志贺样毒素Ⅱ型变异体B亚基单克隆抗体的制备

为建立针对仔猪水肿病SLT-Ⅱe毒素的检测方法,应用PCR技术克隆SLT-ⅡeB基因,并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术获得6株稳定分泌抗SLT-ⅡeB的单克隆抗体(McAb)细胞株,其抗体亚类包括IgM、IgA、IgG2b和IgG2a,而且轻链均为κ链。阻断ELISA结果显示,6株McAb均能特异性识别天然SLT-Ⅱe毒素。相加ELISA结果显示,3G7和4F3两株是针对不同抗原表位的McAb。

志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位及酶活性部位的基因缺失、突变株表达产物免疫生物学特性

重组志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位pGEX＿Ansp及其酶活性部位的基因缺失株pGEX＿Ade及突变株pGEX＿Amu转化的大肠杆菌经诱导后,表达产物经超声波裂解并滤过除菌。ICR小鼠腹腔注射三种重组质粒转化菌诱导后菌体裂解物的除菌滤液,以检验重组表达产物的毒性和免疫原性;在Vero细胞上检测重组菌表达产物对Vero细胞的半数致死量(CD50)及免疫鼠血清对SLT＿Ⅱe毒素的中和实验三方面来比较pGEX＿Ansp、pGEX＿Ade和pGEX＿Amu的生物学特性,结果表明这三种基因工程菌表达产物经腹腔注射后可以诱导机体产生一定程度的保护性抗体。在Vero细胞上,pGEX＿Ansp的表达产物可在一定程度上使Vero细胞产生细胞病变,pGEX＿Amu的表达产物可在一定程度上抑制Vero细胞单层形成时间,而pGEX＿Ade对Vero细胞的生长无影响。

志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体单克隆抗体的制备及其应用

应用淋巴细胞杂交瘤技术，获得１株针对志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体（ＳｈｉｇａｌｉｋｅｔｏｘｉｎⅡｖａｒｉａｎｔ，ＳＬＴⅡｖ）Ａ亚基单位的杂交瘤细胞，并建立了以硝酸纤维素膜为载体的菌落ＥＬＩＳＡ法。用此法检测１５株分离自猪水肿病的野毒菌株和３株产其它型ＳＬＴ的标准菌株，发现该单克隆抗体与１４株野毒菌株呈阳性反应，与产ＳＬＴⅡ的９３３Ｗ株菌有微弱交叉反应，但与产ＳＬＴⅠ和ＶＴ２的菌株（Ｈ３０和Ｅ３２５１１）均无反应。这表明该法能特异、敏感、简便、快速地鉴定产ＳＬＴⅡｖ的大肠埃希氏菌。

猪水肿病大肠杆菌F18ab菌毛A亚单位与志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位的联合表达

扩增、克隆和表达了水肿病大肠杆菌的致病因子F18ab 菌毛的主要亚单位FedA全基因(包括信号肽序列),并与现有的另一致病因子志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位基因(stx 2eA)连接,然后进行联合表达。同时用已制备的抗Stx 2eA 单克隆抗体和抗F18ab菌毛单克隆抗体对联合表达的融合蛋白质进行检测鉴定。

类志贺毒素Ⅱ型变异体A亚单位基因缺失株的构建及表达

采用PCR方法分别对类志贺氏菌毒素A亚单位基因第 2 98～ 80 5序列、818～ 12 0 1序列进行了扩增 ,使其第 80 6～ 817序列的碱基 (编码 16 7～ 170位氨基酸 )缺失 ,并将两片段连接后克隆至质粒载体pGEX 6P 1中 ,获得了含有重组质粒 pGEX Ade的重组大肠埃希氏菌 ;经SDS PAGE以及使用特异性抗SLT ⅡeA单克隆抗体的Western blotting ,证明该重组大肠埃希氏菌在IPTG诱导条件下可表达SLT ⅡeA。

产志贺毒素Ⅱ型变异体大肠杆菌LAMP检测方法的建立

为建立产志贺毒素Ⅱ型变异体(Stx2e)大肠杆菌的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法,参照Gen-Bank中12条Stx2e序列和9条Stx2序列,针对Stx2e基因保守区域设计并合成4条引物,分别进行了反应条件优化、特异性试验、敏感性试验及模拟样品检测。结果显示,用所建立的LAMP方法对阳性样品扩增所得产物电泳后呈特征性梯状条带,阴性样品的扩增产物电泳后均无扩增条带。建立的LAMP方法对Stx2e+大肠杆菌的最低检出量为38CFU/管,敏感性高于PCR方法(3.8×103CFU/管)。LAMP和PCR对模拟样品检测结果的符合率为100%。该研究为仔猪水肿病的诊断和Stx2e+大肠杆菌的快速检测提供了新的方法。

类志贺毒素II型变异体B亚单位单抗的制备和初步应用

将表达类志贺毒素II型变异体B亚单位融合蛋白的菌株ppSLT-IIeB在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达融合蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/C小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为7C3-1,制备的单抗腹水ELISA效价为210,Westernblet结果表明此单抗仅与融合蛋白反应,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测18株水肿病菌株,发现有13株产类志贺毒素II型变异体。

茯苓酸对SLT-Ⅱe诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌细胞因子的影响

将培养的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMEC)分为正常对照组、SLT-Ⅱe对照组、不同浓度茯苓酸处理组,采用硝酸还原酶法和ELISA法测定了培养3、6、9和12 h时细胞培养上清液中NO、ET-1、PGI2、TXA2及PAF含量的变化,研究了中药复方有效成分茯苓酸对仔猪水肿病的治疗机制。结果显示,1、5、10μg/mL茯苓酸均可下调SLT-Ⅱe诱导的RIMEC NO、TXA2的分泌,10μg/mL茯苓酸可抑制SLT-Ⅱe诱导的RIMEC ET-1的分泌,使其分泌的ET-1含量接近正常水平;不同浓度茯苓酸对SLT-Ⅱe诱导RIMEC过量分泌PGI2、PAF无影响。表明,茯苓酸可通过抑制SLT-Ⅱe诱导肠黏膜微血管内皮细胞NO、ET-1及TXA2的过量分泌,缓解肠道微循环障碍,阻止血小板聚集,避免微血栓形成,从而达到治疗水肿病的目的。

茯苓酸对SLT-Ⅱe诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的影响

通过检测茯苓酸对SLT-Ⅱe诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的浓度变化,探索茯苓主要成分茯苓酸对仔猪水肿病的疗效机制。将培养的肠黏膜微血管内皮细胞分为对照组、SLT-Ⅱe组、不同质量浓度茯苓酸处理组5个组,采用ELISA法测定了培养3,6,9,12h细胞上清液中P-选凝素、sICAM-1及TNF-α浓度的变化。结果表明,不同质量浓度茯苓酸处理组对SLT-Ⅱe诱导肠黏膜微血管内皮细胞过量分泌P-选凝素、TNF-α无明显的抑制作用;10mg/L茯苓酸处理组对SLT-Ⅱe诱导肠黏膜微血管内皮细胞sICAM-1的分泌具有明显的下调作用,使其分泌sICAM-1的浓度逐渐下降至正常水平。由此可见,茯苓酸通过抑制SLT-Ⅱe诱导肠黏膜微血管内皮细胞sICAM-1的过量分泌,阻止白细胞与内皮细胞之间的牢固黏附,防止过度炎症反应对机体的损害,以达到治疗疾病的目的。茯苓酸保护大鼠肠黏膜微血管内皮细胞损伤的模型剂量为10mg/L。

SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO、ET-1、P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的影响

为探索肠黏膜微血管内皮细胞在仔猪水肿病发生机制中的作用,将培养的肠黏膜微血管内皮细胞分为对照组、不同浓度SLT-Ⅱe处理组等5个组,采用ELISA法测定了培养3、6、9和12 h时细胞培养上清液中NO、ET-1、P-选凝素、sICAM-1及TNF-α浓度的变化。结果表明,1、10μg/mL SLT-Ⅱe诱导内皮细胞作用12 h时NO的分泌浓度是对照组NO分泌浓度的3倍。1μg/mL SLT-Ⅱe作用12 h时ET-1、P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的浓度分别是相应对照组的4.6、2.8、2.8、1.8倍。由此可见,SLT-Ⅱe通过诱导肠黏膜微血管内皮细胞NO、ET-1、P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的过量分泌,NO/ET-1比值下降,引起肠道微循环障碍,炎症反应,导致水肿病的发生。SLT-Ⅱe诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞损伤的最佳模型剂量为1μg/mL。

SLT-Ⅱe对PIMVECs分泌炎症反应相关细胞因子的影响

本试验旨在探究大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)处理后,猪小肠微血管内皮细胞(PIMVECs)分泌的肿瘤坏死因子α(TNF-ɑ)、P选择素(P-selectin)、一氧化氮(NO)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)和内皮素(ET)水平的变化。采用超速离心法提取SLT-Ⅱe,采用BCA试剂盒测定其质量浓度,使用SDS-PAGE及Western blotting验证蛋白纯度;用WST-1法从0.1、0.5、1、5、10μg/mL SLT-Ⅱe和0、2、4、8、12、24 h中筛选出SLT-Ⅱe对PIMVECs最佳作用浓度与时间;ELISA法检测对照组(0μg/mL SLT-Ⅱe)和试验组(1μg/mL SLT-Ⅱe)细胞上清中TNF-ɑ、P-selectin、NO、ICAM-1和ET含量的变化。结果表明:所提蛋白为SLT-Ⅱe,蛋白含量为721.75μg/mL;1μg/mL的SLT-Ⅱe作用8 h后可极显著降低PIMVECs的活性(P<0.01);1μg/mL的SLT-Ⅱe作用9和12 h时PIMVECs的TNF-ɑ分泌量显著升高(P<0.05),NO/ET的值显著高于对照组(P<0.05),作用6、9、12 h时P-selectin的含量显著升高(P<0.05),作用12 h时的ICAM-1分泌量显著升高(P<0.05)。综上所述,SLT-Ⅱe浓度为1μg/mL时可以诱导PIMVECs分泌的TNF-ɑ、P-selectin、ICAM-1以及NO/ET上升,为研究仔猪水肿病发病机制提供参考。

SLT-IIeA基因在原核系统中的克隆与表达及其鉴定

PCR扩增并克隆在 p UC1 8质粒中的类志贺样毒素 II型变异体 ( SL T-IIe) A亚单位基因片段切出 ,按预定阅读框架插入到原核性表达载体 p GEX-6p-1的谷胱甘肽 S-转移酶( GST)基因的下游 ,获得重组质粒 pp GEX-A。重组质粒导入大肠杆菌 BL2 1 ,用 IPTG进行诱导表达 ,通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS-PAGE电泳分析及 Western-blot鉴定 ,表明重组菌能大量表达融合蛋白形式的 SL T-IIe A,即 SL T-IIe A蛋白与谷胱甘肽转移酶相连组成的蛋白质。本实验的研究结果 ,为进一步研究 SL T-IIe的生物学特性及研制仔猪水肿病亚单位苗提供了有效的生物材料。

大黄酸对SLT-Ⅱe诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌细胞因子的影响

通过检测大黄酸对SLT-Ⅱe诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)、前列环素(PGI2)、血栓素A2(TXA2)、P-选凝素及可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)的浓度变化,以探索中药复方主要成分大黄酸对仔猪水肿病的疗效机制。将培养的肠黏膜微血管内皮细胞分为对照组、SLT-Ⅱe组、不同浓度大黄酸处理组等5个组,采用ELISA法测定了培养3、6、9和12h时细胞培养上清液中NO、ET-1、PGI2、TXA2、P-选凝素及sICAM-1浓度的变化。结果显示,5μg/mL大黄酸可显著下调SLT-Ⅱe诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞NO、P-选凝素及sICAM-1的分泌,12h内使NO、P-选凝素及sICAM-1的分泌浓度接近正常水平,对ET-1的分泌也有一定的抑制作用;1、5、10μg/mL大黄酸不能下调SLT-Ⅱe诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞PGI2和TXA2的分泌。表明,大黄酸通过抑制SLT-Ⅱe诱导肠黏膜微血管内皮细胞NO、ET-1、P-选凝素及sICAM-1的过量分泌,缓解肠道微循环障碍,减轻炎症反应,达到治疗水肿病的目的。