基于λ-Red重组酶系统的Ⅳa2基因缺失及重组腺病毒的包装

本研究用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法缺失腺病毒基因组上Ⅳa2基因的大部分编码序列(1104 bp),并获得一种Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒。首先构建PCR打靶的含有卡那霉素抗性表达盒的模板质粒pAK,再以pAK为模板扩增出两端含39 bp同源臂的线性DNA片段;将pFG140质粒及线性DNA片段依次转化到宿主菌BW25113/pIJ790中,通过λ-Red重组酶介导的同源重组获得了缺失Ⅳa2基因的腺病毒基因组质粒pFG140-ΔⅣa2(1104)。酶切及DNA测序结果显示,用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法在pFG140上精确地缺失了预计的Ⅳa2基因3'端的1104bp片段。用PCR方法扩增获得Ⅳa2基因全长ORF,插入表达载体pAAV2neo中,构建成Ⅳa2基因表达质粒pAAV2neo-Ⅳa2。将pFG140-ΔⅣa2(1104)与pAAV2neo-Ⅳa2共转染HEK293细胞,成功地获得了重组腺病毒Ad5ΔⅣa2(1104)。Western Blot的结果表明,Ad5ΔⅣa2(1104)病毒感染的HEK293细胞检测不到Ⅳa2蛋白的表达。本研究建立了一种对腺病毒基因组直接进行缺失操作的λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法,并获得了一种IVa2基因大部分缺失的重组腺病毒。

COL4A2基因Gly683Ala多态性与中国农村男性骨密度相关性研究

目的：研究COL4A2基因多态性与中国农村男性骨密度关系。方法：采用双能X线吸收仪对367名男性研究对象进行腰椎及股骨扫描,应用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测COL4A2基因Gly683Ala多态位点基因型,用广义线性模型分析此位点多态性与腰椎2～4及股骨骨密度关系。结果：在调整环境危险因素前后,均未显示COL4A2基因Gly683Ala多态性与股骨颈及腰椎2～4骨密度有显著相关性（P=0.328、0.813）。结论：在中国农村男性人群中COL4A2基因Gly683Ala多态性与股骨颈及腰椎2～4骨密度可能无相关性。

逍遥散对肝郁脾虚证大鼠IL-6及胶原蛋白COL4A2、COL9A1表达的影响

目的观察慢性束缚应激肝郁脾虚证大鼠血清白细胞介素-6(IL-6)含量及下丘脑、胃、结肠组织Ⅳ型胶原蛋白A2(COL4A2)、Ⅸ型胶原α1链(COL9A1)m RNA表达的变化及逍遥散的调节作用。方法将50只雄性SD大鼠随机分为正常组、7d和21d模型组、7d和21d逍遥散组,每组10只,以慢性束缚应激方法制作肝郁脾虚证大鼠模型并用逍遥散进行干预。观察各组大鼠宏观表现、摄食量及体重增长情况。造模7d和21d结束后,采用间苯三酚法测定各组大鼠血清D-木糖含量,ELISA法检测血清IL-6含量,实时荧光定量PCR检测下丘脑、胃、结肠组织COL4A2、COL9A1的m RNA表达。结果与正常组比较:7d和21d模型组大鼠摄食量和体重增长量显著减少(P<0.01),血清IL-6含量显著升高(P<0.01),下丘脑、胃组织COL4A2m RNA表达显著升高(P<0.01),结肠组织COL4A2 m RNA表达显著降低(P<0.05或P<0.01),下丘脑、胃、结肠组织COL9A1mRNA表达均显著降低(P<0.05或P<0.01);21d模型组大鼠血清D-木糖含量显著降低(P<0.01)。逍遥散对模型组大鼠的上述变化均具有一定的调节作用(P<0.05或P<0.01)。结论调节炎症因子IL-6及胶原蛋白COL4A2、COL9A1的异常表达可能是逍遥散防治慢性应激肝郁脾虚证大鼠的机制之一。