特异性丁酰胆碱酯酶探针的研究进展

哺乳动物体内的丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase,BChE)能够将学习记忆相关的神经递质乙酰胆碱降解为胆碱和乙酸,以维持胆碱能系统的稳态。由肝脏产生的BChE经血液循环分布于全身多种组织中,具有多种药理相关活性,并且能够作为反映肝脏健康或疾病状况的生物标志物。因此,检测BChE的活性以及了解其在体内的分布和表达情况是开展相关研究基础,本综述简要概述了最近报道的用于定量检测和实时监测BChE的特异性荧光或化学发光探针。

喹啉-三嗪衍生物的设计合成及体外丁酰胆碱酯酶抑制活性

以2-(氯甲基)喹啉的盐酸盐为原料,经氧化,亲核取代反应得到结构新颖的喹啉-三嗪衍生物(5a-5f).运用IR、^(1)H NMR、^(13)C NMR和HRMS等表征手段确证所有化合物结构与设计一致.采用Ellman方法对目标化合物进行体外抑制丁酰胆碱酯酶活性测试,结果显示:所有化合物在80μmol/L下抑制率超过50%,其中化合物5e[IC_(50)=(1.71±0.04)μmol/L]活性最佳,强于阳性对照物多奈哌齐[IC_(50)=(12.69±0.07)μmol/L].进一步对5e与BuChE分子对接研究发现,结构中喹啉环和硫原子与酶活性位点残基Ser198、His438、Trp82和Thr120可通过氢键作用.因此,化合物5e是本研究中筛选出活性最好的结构,为阿尔茨海默病(AD)研究提供了新的结构方向.

基于黄酮骨架的“关-开”型荧光探针用于检测活细胞内丁酰胆碱酯酶

以间苯二酚为起始原料,设计合成了一种基于N,N-二甲胺基萘取代的黄酮母核(3)为荧光报告基团的“关-开”型丁酰胆碱酯酶(BChE)荧光探针(4a),并通过核磁共振波谱(NMR)和高分辨质谱(HRMS)进行了结构表征。结果表明,探针4a能够快速地对BChE产生特异性响应,在pH=8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中,574 nm处荧光强度明显增强,同时肉眼可见溶液颜色的改变。通过高效液相色谱(HPLC)和HRMS对响应机理进行了探讨,发现BChE可使探针的酯键发生断裂,生成具有强荧光的黄酮母核(3)。此外,探针4a可用于检测人肝癌细胞(HepG2)中的BChE并进行荧光成像。

丁酰胆碱酯酶抑制剂微量筛选模型的研究

目的为新药发现阶段丁酰胆碱酯酶(butyrylcholines-terase,BChE)抑制剂的筛选提供实用的筛选方法,并为乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选提供选择性评价模型。方法以大鼠血清作为丁酰胆碱酯酶酶源,按照酶反应体系构建原则,在pH 7.4和37℃的条件下,以96孔板为载体,用正交试验法确定酶的最佳反应条件。在确定模型的筛选运行条件后,采用3种阳性药物和115种植物提取物对构建的模型进行筛选测试。结果采用大鼠血清为酶源成功构建了实用的BChE抑制剂微量筛选模型。结论本工作构建的丁酰胆碱酯酶抑制剂微量筛选模型基本具备了简便、快速、可靠、经济、拓展性好的优点,可用于丁酰胆碱酯酶抑制剂的大规模筛选,同时,该模型可与乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选模型相互配合使用,用于评价胆碱酯酶抑制剂的选择性。

鸡屎藤抑制丁酰胆碱酯酶活性及活性部位的UPLC-Q-TOF-MS分析

应用高通量药物筛选技术,筛选发现具有丁酰胆碱酯酶(BuChE)抑制活性的中药提取物,同时采用超高效液相色谱与串联四极杆飞行时间质谱仪联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)对其活性部位进行分析和鉴别。药材经石油醚渗滤、乙醇提取、乙酸乙酯萃取和水煎煮后,得到4个提取部位。采用5,5'-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)法检测BuChE活性,于412 nm波长处检测吸收度,计算提取物对BuChE的抑制率。采用ACQUITY UPLC BEH C1 8色谱柱,以水-甲醇为流动相梯度洗脱,200～400 nm扫描,使用ESI离子源,在正离子模式下采集数据。结果显示,57种中药提取物中,鸡屎藤的乙酸乙酯部位显示较强的BuChE抑制活性,并从其活性部位中分析鉴定出9个化合物,主要成分为环烯醚萜苷类化合物,分别是鸡屎藤苷、鸡屎藤苷酸、甲基鸡屎藤苷、咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖-鸡屎藤苷B和4个未知的环烯醚萜苷类,以及1个黄酮类成分蒙花苷。表明鸡屎藤乙酸乙酯提取部位具有较强的BuChE抑制活性,IC50为12.415μg/mL,Q-TOF-MS测定的相对分子质量及正离子信息鉴定鸡屎藤乙酸乙酯提取物中主要为环烯醚萜类成分,说明其含有的环烯醚萜苷类为抑制BuChE活性的主要成分,为进一步研究鸡屎藤活性成分奠定基础。

独活抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性研究

目的研究独活乙醇提取物及不同萃取部位抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的活性。方法应用薄层色谱(TLC)-生物自显影技术和微孔高通量筛选的方法。结果在TLC-生物自显影抑酶实验中独活乙醇提取物,石油醚和氯仿萃取部位呈现阳性结果;微孔高通量筛选实验中独活乙醇提取物、石油醚及氯仿萃取部位对乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BuChE)均具有抑制作用,浓度为1mg.mL-1时,3个萃取部位对AChE的抑制率分别为(16.88±0.42)%、(11.82±0.55)%、(44.33±3.21)%,对BuChE的抑制率分别为(13.97±1.17)%、(14.64±1.10)%、(18.63±1.24)%。结论独活乙醇提取物、石油醚萃取部位及氯仿萃取部位对2种胆碱酯酶均具有抑制作用,其中氯仿萃取部位对胆碱酯酶抑制率最高,为主要的抑酶活性部位。

山豆根抑制丁酰胆碱酯酶活性及活性部位UPLC-Q-TOF-MS分析

目的:应用高通量药物筛选技术发现山豆根乙醇提取物具有较强的抑制丁酰胆碱酯酶(BuChE)活性。采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)对其活性部位组分进行分析和鉴定。方法:药材经石油醚渗滤、乙醇提取、乙酸乙酯萃取和水煎煮后,得到4个提取部位。采用5,5'-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)法检测BuChE活性,并应用UPLC-Q-TOF-MS对其活性部位组分进行分析和鉴定。结果:山豆根的乙醇部位显示较强的BuChE抑制活性,并从其活性部位中分析鉴定了9个化合物,其中7个化合物主要成分为苦参碱类生物碱,属于喹诺里西啶类生物碱,分别是槐醇、苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、9a-羟基苦参碱、14β-羟基氧化苦参碱、Lamprolobine;2个黄酮类成分分别是Kushenol O、Kushenol I/N。山豆根乙醇提取部位IC50为15.169μg·m L-1。结论:首次发现山豆根乙醇提取部位具有较强的BuChE抑制活性,其主要化学成分为苦参碱类生物碱,研究表明山豆根具有延缓老年痴呆的作用,为研发延缓老年痴呆新药提供科学依据。

急性有机磷农药中毒患者乙酰胆碱酯酶与丁酰胆碱酯酶变化同步观察分析

目的 通过对急性有机磷农药中毒 (AOPP)患者乙酰胆碱酯酶 (AchE)与丁酰胆碱酯酶(BchE)水平的同步监测 ,探讨BchE对AOPP患者的临床意义。方法 41例AOPP患者在抢救治疗过程中分别于入院即刻、2、3、5、7d测定血清BchE ,并就其中 2 1例患者同步测定全血AchE ,另设正常健康对照组 41例。测定结果用SPSS 10 .0做统计分析。结果 41例入院即刻血清BchE、全血AchE与对照组比较 P <0 .0 1,差异非常显著。经治疗后AchE缓慢回升 ,第 7天与同组入院即刻相比 P <0 .0 1,差异非常显著。BchE与同组相比第 3天P <0 .0 1,差异非常显著。从BchE的时间回归图看 ,BchE入院即刻较敏感 ,下降至 10 0 9U L ,经治疗后上升幅度大 ;从AchE时间回归图看 ,入院即刻下降至 5 0 .3 % ,上升幅度较小 ;BchE与AchE直线回归相关比较 ,两者呈正相关 ,r =0 .987。结论 在AOPP时BchE与AchE有同样的敏感性 ,可作为有机磷中毒的实验室指标。同步观察 ,AchE测定在AOPP时下降幅度小 ,回升幅度不大 ,精确性不高 ;血清BchE测定敏感性高 ,回升幅度明显 ,精确性高 ,检验快捷 ,对临床诊断、用药剂量、停药与否有直接指导作用 ,值得推广使用。同时在治疗过程中BchE达 2 0 0 0U

血管性痴呆患者丁酰胆碱酯酶活性及与脑白质病变的相关性研究

目的探讨血管性痴呆(VaD)患者血清丁酰胆碱酯酶(BuChE)活性与认知功能、执行功能及脑白质病变的关系。方法纳入2009年1月—2012年1月于我院神经内科住院及门诊就诊的25例VaD患者(VaD组)及我院同期体检的健康老年人20例(对照组)。对所有受检者检测血BuChE含量,应用简易精神状态检查量表(MMSE)、画钟试验(CDT)、积木试验(BDT)检测认知及执行功能,采用年龄相关白质改变的评分方法(ARWMCrs)评价脑白质病变程度,并分析相关性。结果 VaD患者血BuChE含量高于对照组〔(7 429±853)U/L比(5 283±965)U/L〕,差异有统计学意义(P<0.05);MMSE〔(16.46±3.52)分比(26.35±3.74)分〕、CDT〔(1.53±0.84)分比(3.65±0.52)分〕、BDT〔(14.88±7.29)分比(38.47±7.31)分〕评分均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),而全脑〔(11.38±3.63)分比(4.54±2.21)分〕及额区〔(2.59±0.68)分比(1.07±0.53)分〕ARWMCrs评分高于对照组,差异亦有统计学意义(P<0.05)。VaD患者血BuChE含量与MMSE及CDT评分呈负相关(r值分别为-0.415、-0.463,P<0.05),与额叶ARWMCrs呈正相关(r=0.428,P<0.05)。结论VaD患者血BuChE含量增高,与认知功能、执行功能及脑白质病变相关。

鸭肝丁酰胆碱酯酶的纯化与酶学性质研究

目的:获得鸭肝丁酰胆碱酯酶纯品并对其酶学性质进行研究。方法:采用丙酮脱脂、酸沉淀、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶层析方法,分离纯化鸭肝丁酰胆碱酯酶;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定和酶相对分子量测定。结果:从鸭肝中分离纯化获得电泳纯的丁酰胆碱酯酶,纯化倍数为156.45倍,酶活回收率为23.60%,比活达17.21U/mg。酶相对分子量为388.85kDa,亚基相对分子量为64.70kDa。推测该酶由六个相同亚基构成。该酶最大紫外吸收为278nm。酶催化碘化硫代丁酰胆碱水解的最适pH为8.0,最适温度为35℃。该酶在pH3.0～10.0区域较稳定;在40℃以下处理1h,酶活力保持稳定。Zn2+、Mn2+和Cu2+对该酶具有显著的抑制作用。以碘化丁酰硫代胆碱为底物,测定该酶的表观Km为71.15μmol/L,没有过量底物抑制现象。结论:成功分离纯化获得丁酰胆碱酯酶,该酶具有较好的酸碱耐受性。

丁酰胆碱酯酶基因-壳聚糖纳米粒初步研究

目的 优化抗毒酶基因纳米粒制备工艺 ,并对纳米粒部分性质进行研究。方法 用复凝聚法制备抗毒酶基因纳米粒 ,采用规格化的正交表安排试验 ,用SAS统计软件处理数据 ;用透射电镜观测纳米粒粒径和形态 ;用Pcs测定粒径和Zeta电位 ;用体外转染试验评价纳米粒的体外转染活性 ,用倒置显微镜观察转染结果。结果 正交设计试验结果表明 ,优化的抗毒酶基因纳米粒制备条件是 :壳聚糖浓度 30 0 μg·ml-1,丁酰胆碱酯酶基因质粒浓度 10 0 μg·ml-1,硫酸钠浓度 8mmol·L-1,pH值 5 .5 ,涡旋混合时间 30s。所制备的纳米粒在透射电镜下观察 ,结果表明 :绝大多数粒子的粒径在 10 0nm以下 ,粒径分布比较均匀。Pcs测定结果表明 :98%以上的粒子粒径分布在 5 0～ 10 0nm范围 ,与透射电镜结果相符 ;平均Zeta电位为 15 .9± 6 .3mV。体外基因转染试验表明 :纳米粒能将所包裹的基因递送到细胞内 ,并表达目标蛋白—丁酰胆碱酯酶。结论 壳聚糖浓度、质粒基因浓度以及它们之间的交互作用 ,在制备条件选择中具有决定性作用 ,丁酰胆碱酯酶基因 -壳聚糖纳米粒制备工艺可行 ,递送基因能力较强。本研究结果表明 :壳聚糖纳米粒作为基因递送载体具有广阔的发展空间。

有机磷农药中毒后血乙酰胆碱酯酶与丁酰胆碱酯酶活性变化关系

目的观测有机磷农药中毒后全血、红细胞的乙酰胆碱酯酶和血清丁酰胆碱酯酶活性变化情况,分析乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶之间的相关性。方法①体外实验:以新鲜人血制备红细胞和血清,等量酶原中分别加入不同浓度的敌敌畏进行染毒后,观测全血、红细胞乙酰胆碱酯酶和血清丁酰胆碱酯酶染毒前后活性变化情况。②动物实验:将雄性Wistar大鼠随机分为3组,每组10只,3组按中毒程度轻、中、重分别予敌敌畏2mg/kg、5mg/kg、7mg/kg进行肌注染毒,观测大鼠染毒前后血中全血、红细胞乙酰胆碱酯酶和血清丁酰胆碱酯酶活性变化情况。结果敌敌畏中毒后,全血、红细胞乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性均出现降低,并且活性抑制变化趋势基本是平行的,两酶之间呈正相关关系,但反映的中毒程度存在差异。结论有机磷农药中毒时,不应以乙酰胆碱酯酶的分级诊断标准作为丁酰胆碱酯酶的分级诊断标准,可用乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶之间的差异系数加以修正。

家蚕系统表达的重组人丁酰胆碱酯酶的生化性质

研究家蚕系统中高效表达的重组人丁酰胆碱酯酶(rhBChE)的生化性质并与天然人丁酰胆碱酯酶(nhBChE)进行比较。采用丁酰胆碱酯酶活性测定,抑制剂及重活化剂作用,免疫印迹等方法。实验结果表明,rhBChE及nhBChE在底物亲和力、抑制剂敏感性及可重活化性、稳定性、对抗体的反应性等方面均有相似的生化性质,重组人丁酰胆碱酯酶具有天然人丁酰胆碱酯酶的功能。但rhBChE的糖基化修饰程度较低。

丁酰胆碱酯酶缺陷患者一例

患者,男,29岁,160cm,62kg,在全麻下行腹腔镜右肾部分切除术。既往体健,无手术麻醉史,否认家族性遗传病史;术前血常规、肝肾功能、凝血功能、胸片、心电图均正常;ASAⅠ级。入室后常规监测,HR 60次/分,NBP 140/80 mm Hg,SpO_2 100%;静注咪达唑仑4 mg、丙泊酚100 mg、芬太尼0．2mg以及苯磺酸顺式阿曲库铵20mg行麻醉诱导，3rain后行气管插管，机械通气。

血清丁酰胆碱酯酶、前白蛋白评价肝硬化患者肝脏储备功能的临床价值

选取经临床诊断的肝硬化患者86例,按Ch ild-Pugh分级,将肝硬化患者分成A、B、C三级,检测血清丁酰胆碱酯酶、前白蛋白和白蛋白;设立对照30例。结果随肝硬化程度加重,血清丁酰胆碱酯酶、前白蛋白逐渐降低,其降低幅度依次为C级>B级>A级,组间两两比较有显著性差异(P<0.05);三级与对照组比较均有显著差异(P<0.05)。认为酰胆碱酯酶、前白蛋白与肝硬化程度密切相关,二者比白蛋白更能较好地反映肝脏储备功能。

血清丁酰胆碱酯酶活性与急性心肌梗死患者经皮冠状动脉介入治疗术后炎症因子及短期预后的相关性

目的探讨血清丁酰胆碱酯酶(BuChE)活性与急性心肌梗死(AMI)患者经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后炎症因子及短期预后的相关性。方法纳入229例接受急诊PCI术的AMI患者,检测其基线血清BuChE活性、左心室射血分数(LVEF)、白细胞介素(IL)-6、超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平,记录住院期间主要不良心血管事件(MACE)的发生情况。采用Pearson相关分析评估血清BuChE活性与LVEF、IL-6、hs-CRP的相关性,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清BuChE活性对AMI患者PCI术后发生院内MACE的预测价值。结果229例患者中,38例(16.59%)发生MACE(MACE组),191例(83.41%)患者未发生MACE(非MACE组)。MACE组患者IL-6和hs-CRP水平高于非MACE组,血清BuChE活性低于非MACE组(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,AMI患者入院时血清BuChE活性与PCI术后1周的LVEF呈正相关(r=0.537,P<0.001),与IL-6、hs-CRP均呈负相关(r=-0.746,P<0.001;r=-0.691,P<0.001)oROC曲线分析结果显示,入院时血清BuChE活性预测AMI患者PCI术后发生院内MACE的ROC曲线下面积(AUC)为0.693(95%CI0.552-0.834),敏感度和特异度分别为84.5%和75.0%,约登指数为0.595.结论血清BuChE活性与AMI患者的心功能和炎症反应有关,有望成为预测其PCI术后发生院内MACE的指标之一。

丁酰胆碱酯酶活性评估院前急性有机磷农药中毒患者病情及预后的应用研究

目的探讨丁酰胆碱酯酶(BuChE)活性评估院前急性有机磷农药中毒(AOPP)患者病情及预后的应用效果。方法选择院前急救AOPP患者110例,所有患者在院前采集静脉血测定BuChE活性,并以入院治疗60d为观察界限,分析BuChE特征曲线及预测指标。结果 110例患者中死亡24例,存活96例,其中死亡组院前BuChE活性为(36.7±34.2)%,存活组院前BuChE活性(67.2±15.4)%,两组差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线判断AOPP最佳截断点为BuChE活性小于或等于30%正常值。27例BuChE活性小于或等于30%正常值者病死率为74.07%(20/27),93例大于30%正常值者病死率为4.30%(8/93)。两者病死率比较有差异有统计学意义(P<0.01)。当院前AOPP患者危重度的最佳截断点为BuChE活性小于或等于30%正常值,对其死亡预测的特异度为0.954,敏感度0.761,阳性预测值0.825,准确度0.912,约登指数0.716。结论 BuChE活性对AOPP病情具有快速、有效的预测价值,值得临床推广应用。

丁酰胆碱酯酶活性在评估院前急性乐果中毒患者病情及预后的应用研究

目的丁酰胆碱酯酶活性（BuChE）在院前急性乐果中毒患者病情评估和死亡预测的价值及可行性。方法对2010年1月1日~2011年12月31日院前急性乐果中毒患者作为研究对象,采集血丁酰胆碱酯酶活性,以收入院后60 d为观察终点,结局作为观察指标,对患者进行丁酰胆碱酯酶活性特征曲线（ROC曲线）下面积计算,计算患者相应的预测指标。结果共有115例乐果中毒患者纳入研究,其中丁酰胆碱酯酶活性≤30%正常值的患者23例次,占20.0%,丁酰胆碱酯酶活性〉30%正常值的患者92例次,占80.0%;死亡组丁酰胆碱酯酶活性较存活组低,差异有统计学意义（P〈0.05）;丁酰胆碱酯酶活性ROC曲线下面积为0.962,判断院前中毒患者＂潜在危重症＂的最佳截断点为≤正常值30%,对危重症患者死亡预测的敏感度76.0%,特异度为95.5%,准确度为91.3%,约登指数为0.715。结论丁酰胆碱酯酶活性在急性乐果中毒患者病情评估及死亡的预测具有较强的应用价值。

梭曼、沙林对鸭血清丁酰胆碱酯酶的动力学研究

目的 从酶反应动力学方面揭示梭曼、沙林对丁酰胆碱酯酶的毒性强弱 ,比较两者对丁酰胆碱酯酶的抑制强度。方法 通过改进的Ellman法验测定了鸭血清丁酰胆碱酯酶的km 值 ,以及梭曼、沙林对该酶抑制反应的解离常数kd、膦酰化常数k2 和抑制速率常数ki值。结果 虽然梭曼和沙林在可逆的酶 抑制剂反应过程中反应速度相差不大 ,但梭曼对该酶的亲和力与抑制能力均比沙林强。