三七皂苷R1药理作用机制与神经保护作用研究进展

三七是五加科人参属多年生直立草本植物三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]干燥根及根茎,作为我国传统中药,具有较好的补益功效,《中药大辞典》有言,三七功用补血,去瘀损,止血衄,能通能补,功效最良,是方药中之最珍贵者。生吃去瘀生新,消肿定痛,止血不留瘀,行血不伤新;熟服可补益健体。三七皂苷R1是三七总皂苷中特征化合物,近些年来,我国老龄化程度不断加剧,神经系统疾病发生率逐年增高,同时,对三七皂苷R1治疗神经疾病的报道增多,其发挥神经保护作用有确切的疗效。该文旨在对三七皂苷R1治疗神经疾病以及作用机制展开综述,为临床用药与新药开发提供一定的理论依据。

基于血浆代谢组学研究三七皂苷R1改善神经炎症的分子作用机制

目的:通过血浆代谢组学研究三七皂苷R1(notoginsenside R1,NGR1)治疗神经炎症的分子作用机制。方法:采用腹腔注射0.83 mg‧kg^(-1)脂多糖(LPS)构建小鼠神经炎症模型,应用NGR1(30 mg‧kg^(-1))进行给药治疗,眼眶静脉丛取血并分离血浆。在使用苏木素-伊红(HE)染色法检测小鼠脑组织损伤情况、采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术检测神经炎症相关指标及酶联免疫吸附反应(ELISA)技术分析血清炎症因子变化的基础上,应用液相色谱-质谱法(LC-MS)对各组小鼠血浆样品进行代谢组学分析,通过人类代谢组数据库(HMDB)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库进行差异内源代谢物的鉴定,并应用MetaboAnalyst和Metscape数据库进一步分析差异内源代谢物的关键代谢途径,最后通过qRT-PCR检测调控关键代谢途径基因表达水平的变化。结果:NGR1能够明显改善小鼠脑组织神经损伤,明显降低中枢神经炎症因子离子化钙结合适配分子1(Iba-1)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6的mRNA水平,显著提高转化生长因子-β(TGF-β)的mRNA水平,显著降低血清炎症因子IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平。此外,代谢组学发现模型组与给药组之间小鼠血浆中皮质酮、吲哚丙酮酸、泛酸、12S-羟基5Z,8Z,10E,14Z-二十碳四烯酸、PC(18:3(9Z,12Z,15Z)/16:1(9Z))等22个差异内源代谢物发生明显变化,主要涉及甘油磷脂代谢、亚油酸代谢及类固醇激素生物合成等代谢通路。qRT-PCR结果显示,给药后能显著逆转关键代谢途径中2A型磷脂酶A2(PLA2G2A)、1B型磷脂酶A2(PLA2G1B)、12A型磷脂酶A2(PLA2G12A)、醛酮还原酶1D1(AKR1D1)、羟基类固醇11β脱氢酶1(HSD11B1)、羟基类固醇11β脱氢酶2(HSD11B2)mRNA表达水平。结论:NGR1对LPS诱导的神经炎症具有治疗作用,并可能通过调控皮质酮等关键代谢物及甘油磷脂代谢、亚油酸代谢及类固醇激素生物合成等关键途径发挥抗神经炎症的作用,将为深入研究NGR1抗神经炎症的作用机制提供参考。

三七皂苷R1对脑缺血再灌注诱导焦亡的影响

目的:研究三七皂苷R1对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其可能机制。方法:将70只SD大鼠随机分为对照组、假手术组、模型组、三七皂苷R1低剂量组、三七皂苷R1中剂量组、三七皂苷R1高剂量组及依达拉奉组,每组10只。三七皂苷R1低、中、高剂量组大鼠分别灌胃低[25 mg/(kg·d)]、中[50 mg/(kg·d)]、高[100 mg/(kg·d)]剂量三七皂苷R1混悬液,依达拉奉组大鼠腹腔注射依达拉奉[3 mg/(kg·d)]。连续给药7 d后,除对照组和假手术组外,其余各组大鼠构建大脑中动脉阻断(MCAO)模型,再灌注24 h后取材。采用Zea Longa法进行神经功能学评价;测定脑组织含水量;采用苏木精-伊红(HE)染色评价脑组织病理变化;采用酶联免疫吸附法(ELISA)法测定脑组织IL-18和IL-1β的含量;采用蛋白质印迹法检测脑组织NLRP3、GSDMD和Caspase-1蛋白的表达。结果:模型组大鼠神经功能损伤评分、脑含水量高于假手术组(P<0.01);模型组大鼠脑组织中IL-18和IL-1β的含量及NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白相对表达量高于假手术组(P<0.01)。三七皂苷R1中、高剂量组及依达拉奉组大鼠神经功能损伤评分、脑组织含水量均低于模型组(P<0.05或P<0.01);三七皂苷R1中、高剂量组及依达拉奉组大鼠脑组织中IL-18和IL-1β水平及NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白相对表达量均低于模型组(P<0.05或P<0.01)。结论:三七皂苷R1对大鼠脑缺血再灌注损伤有抑制作用,其作用机制可能与抑制缺血再灌注引起的焦亡有关。

三七皂苷R1对LPS诱导的小鼠心肌损伤的保护作用

目的探讨三七皂苷R1(Notoginsenoside R1)对内毒素诱导的C57BL/6J小鼠心肌损伤的保护作用,阐明其抗心肌炎症的作用机制。方法 C57BL/6J小鼠预防性给予三七皂苷R1 3 d后,注射LPS(10 mg.kg-1,ip)建立急性内毒素心肌损伤模型。采用超声心动测定射血分数(EF),缩短分数(FS)等指标,观察小鼠心功能;采用免疫组化检测心室肌中ED-1+和CD11b+炎性细胞的浸润情况;Western blot检测IκBα和NF-κB p65的表达变化;应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测心肌组织匀浆中TNF-α、IL-1β和VCAM-1、ICAM-1的表达水平。结果超声心动显示,与模型组(LPS组)相比三七皂苷R1能明显抑制LPS诱导的小鼠的左心室收缩功能减弱的情况;免疫组化可观察到R1有效抑制了ED-1+和CD11b+细胞的侵入;Western blot法显示R1对IκBα的降解具有抑制作用,同时对由此产生的NF-κB的活化也具有抑制作用;ELISA实验显示与模型组相比,R1明显降低了组织中TNF-α、IL-1β的浓度,抑制心肌组织中VCAM-1和ICAM-1的表达。结论三七皂苷R1对LPS引起的心肌炎症具有明显的抑制作用,能有效改善由此导致的心肌损伤。

三七皂苷R1调节炎性T细胞亚群保护血管内皮的实验研究

目的探讨炎性T细胞亚群在胶原酶诱导的血管内皮损伤早期的变化状态及三七皂苷R1的保护作用机制。方法采用扫描电镜观察ApoE-/-小鼠动脉内皮损伤程度;流式细胞术检测小鼠外周血中CD62Phi、CD62P+CD62E+脱落内皮细胞的比例;胞内外因子染色法检测炎性T细胞亚群分泌TNF-α、IL-17的水平。结果扫描电镜下,内皮损伤模型组小鼠血管内膜受损明显,内皮脱落面积明显增加,实验组经三七皂苷R1处理后血管内皮偶有脱落(P均<0.05);另外,模型组脱落内皮细胞CD62Phi、CD62P+CD62E+比例明显高于正常对照组,同时,T细胞分泌TNF-α、IL-17的能力明显升高,而实验组脱落内皮细胞比例明显低于模型组,T细胞分泌IL-17的比例下降(P均<0.05)。结论 Th17细胞亚群比例升高与血管内皮早期损伤密切相关,三七皂苷R1在保护血管内皮的同时,可选择性地下调Th17细胞亚群比例。

三七皂苷R1对肺高压大鼠肺动脉平滑肌细胞SOCE的抑制作用

目的探讨三七皂苷R1(notoginsenoside R1)对慢性低氧(chronic hypoxia,CH)及野百合碱(monocrotaline,MCT)致肺高压(pulmonary hypertension,PH)大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)钙池操纵性钙内流(store-operated calcium entry,SOCE)的作用。方法制备CH及MCT致PH大鼠模型,通过Mn2+淬灭Fura-2荧光和Fluo-3荧光检测胞质游离Ca2+浓度(intracellular free calcium concentration,[Ca2+]i)观察三七皂苷R1对CH及MCT致PH大鼠PASMCs SOCE的作用。结果成功制备CH及MCT致PH大鼠模型;在硝苯地平预处理情况下,10μmol·L-1三七皂苷R1可明显降低环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)诱导CH及MCT致PH大鼠PASMCs Mn2+淬灭幅度、Mn2+最大淬灭率、胞膜Ca2+内流量和静息[Ca2+]i。结论三七皂苷R1对CH及MCT致PH大鼠PASMCs具有抑制SOCE和降低静息[Ca2+]i的作用。

三七皂苷R1通过线粒体相关通路促进白血病细胞株HL-60凋亡

目的:观察三七皂苷(notoginsenoside)R1对白血病细胞株HL-60凋亡的影响,探讨其可能的作用机制。方法:采用MTT法和流式细胞术(Annexin V-FITC双染法)分别检测三七皂苷R1(10、20、40及80μmol/L)处理HL-60细胞12、24、36及48 h后HL-60细胞的凋亡情况,Western blotting检测HL-60细胞内Bcl-2、Bax及细胞色素C(cytochrome-C,Cyt C)蛋白的表达水平,JC-1染色法观察HL-60线粒体膜电位的变化。结果:MTT和流式细胞术检测显示三七皂苷R1浓度依赖性诱导HL-60细胞的凋亡,且细胞存活率随处理时间的增加而降低;与空白对照组相比,加入三七皂苷R1后细胞中Bcl-2蛋白表达显著减少[(0.45±0.03)vs(1.00±0.00),P<0.05]、Bax蛋白表达显著增加[(1.72±0.08)vs(1.00±0.00),P<0.05];Bcl-2/Bax比值减小[(0.21±0.01)vs(1.00±0.00),P<0.05];线粒体膜电位降低[(0.56±0.09)vs(1.00±0.00),P<0.05];胞质(cyto)中Cyt-C蛋白表达水平显著下降[(0.42±0.03)vs(1.00±0.00),P<0.05]。结论:三七皂苷R1可显著诱导HL-60细胞凋亡,其作用机制可能是通过线粒体通路促进细胞的凋亡;本实验可为三七皂苷R1用于临床治疗白血病提供实验依据。

三七皂苷R1对肺高压大鼠模型肺动脉的舒张作用

目的探讨三七皂苷R1(notoginsenoside R1)对慢性低氧(chronic hypoxia,CH)和野百合碱(monocrotaline,MCT)致肺高压(pulmonary hypertension,PH)大鼠模型肺动脉(pulmonary arteries,PAs)收缩效应的作用及其机制。方法清洁级♂SD大鼠随机分为3组。正常对照组;CH组:大鼠饲养于氧分压为10.0%±0.5%的密封有机玻璃箱内;MCT组:大鼠按60 mg·kg-1(BW)一次性腹腔注射20 mg·L-1的MCT。观察三七皂苷R1对两种肺高压模型大鼠PAs收缩效应的作用。结果可成功制备CH和MCT致肺高压大鼠;三七皂苷R1(0.1～100μmol·L-1)对10 nmol·L-1内皮素-1(endothelin-1,ET-1)诱发正常大鼠PAs收缩效应呈剂量依赖性舒张,EC50为(5.25±0.14)μmol·L-1;3 nmol·L-1Gd3+阻断ET-1诱发两种肺高压模型大鼠PAs收缩效应后,再加入三七皂苷R1无进一步抑制作用;6μmol·L-1三七皂苷R1对环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)诱发两种肺高压模型大鼠PAs收缩效应均有明显的抑制作用。结论三七皂苷R1可能通过阻断钙池操纵性钙内流介导的PAs收缩产生治疗肺高压作用。

三七皂苷R1在抗凝血酶参与下对体外凝血酶活性的影响

目的观察三七皂苷R1在抗凝血酶参与下对体外凝血酶活性的影响,探讨其作用原理。方法在有或无25%血浆抗凝血酶参与下制备凝血酶标准曲线;实验分为正常、溶媒及阳性对照组与三七皂苷R1高、中、低(5、2.5、1.25 mg/mL)剂量组,在有或无25%血浆抗凝血酶参与下,凝血酶与底物S-2238发生酸水解停止反应,观察三七皂苷R1对凝血酶活性的影响。结果在有或无25%血浆抗凝血酶参与下,吸光值与酶活力浓度呈相关性。在没有血浆抗凝血酶参与下,三七皂苷R1对凝血酶活性无甚影响(P>0.05);在25%血浆抗凝血酶参与下,高浓度(5 mg/mL)三七皂苷R1能明显抑制凝血酶的活性(与缓冲液对照比较,P<0.05),抑制率达19.87%。结论三七皂苷R1可能通过与抗凝血酶形成复合物后再抑制凝血酶活性。

三七皂苷R1上调miR-146a水平和减轻ApoE^(-/-)小鼠肝脏炎症损伤的研究

目的观察三七皂苷R1(R1)对ApoE^(-/-)小鼠肝脏白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和微小RNA-146a(miR-146a)的影响。方法采用高脂饲料喂养雄性ApoE^(-/-)小鼠,建立小鼠动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)模型,随机分为模型组,R1低、中、高剂量组,辛伐他汀组,另设同龄C57BL/6J雄性小鼠为正常对照组。连续给药12周后处死小鼠,检测血糖、血脂、肝功能(AST,ALT)以及肝匀浆TNF-α、IL-6等指标,HE染色观察肝组织病理形态学,PCR测肝脏miR-146a表达。结果模型组小鼠血糖、血脂、ALT、AST、TNF-α、IL-6均较正常对照组显著升高(P<0.05,P<0.01),血清HDL-C含量显著降低(P<0.01),肝脏切片可见小鼠肝细胞质内充满脂滴,大部分肝细胞呈现脂肪变性;与模型组比较,R1高剂量组能显著降低小鼠空腹血糖、血脂、AST、ALT以及肝脏中的TNF-α、IL-6(P<0.01),同时升高HDL-C和miR-146a水平(P<0.01);R1各组小鼠肝脂肪变性较模型组有所减轻。结论三七皂苷R1能降低AS小鼠血糖、血脂水平,并保护肝功能,其机制可能主要与三七皂苷R1升高肝脏miR-146a水平,降低TNF-α、IL-6等炎症因子有关。

三七皂苷R1、R2和人参皂苷Rb1药效学研究

目的:研究三七皂苷R1、R2和人参皂苷Rb1的生物活性。方法:观察组分对冠脉结扎导致的大鼠心肌缺血性模型的影响、催眠、镇静作用。结果:3个三七组分的均可减少大鼠心肌缺血模型心律失常的发生率,R1和R2作用明显。可不同程度的减少大鼠心肌缺血模型心肌梗塞面积,R2作用较明显。可不同程度的降低心肌缺血模型的大鼠CK、LDH、MDA含量,但是对于SOD水平均无明显影响。对戊巴比妥钠阈剂量均无明显的协同作用,对戊巴比妥阈下剂量无明显的催眠作用,对正常动物自主活动没有明显影响。R1和R2能够明显抑制咖啡因导致的自主活动增加。结论:R1和R2对冠脉结扎所致大鼠心肌缺血性损伤具有一定的保护作用,具有一定的镇静作用。

三七皂苷R1对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的研究三七皂苷R1对大鼠脑缺血再灌注损伤后学习记忆障碍的影响。方法 SD大鼠随机分为假手术组、模型组、三七皂苷R1 1.4 mg/kg组(R1A组)和三七皂苷R1 7.0 mg/kg组(R1B组)。大鼠腹腔注射三七皂苷R1,连续给药14 d,实验第4天制作右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,缺血后2 h再灌。再灌后不同时间点采用Longa法对大鼠进行神经功能行为缺陷评分,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法记录大鼠脑梗死体积,Morris水迷宫法观察大鼠空间学习记忆能力,电生理学方法记录中枢突触传递长时程增强(LTP)现象。结果三七皂苷R1(1.4,7.0 mg/kg)可减少大鼠脑梗死体积,改善大鼠空间学习记忆障碍,增强大鼠海马齿状回高频刺激(HFS)诱导的LTP现象。结论三七皂苷R1对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

三七皂苷R1对UV辐射皮肤成纤维细胞的影响

目的探讨三七皂苷R1对UV诱导的人皮肤成纤维细胞的保护作用及其相关分子机制。方法采用不同剂量UV照射原代培养的人皮肤成纤维细胞,同时加入三七皂苷R1干预处理,倒置相差显微镜观察细胞损伤的形态学变化,并用MTT法检测其增殖活性,比色法检测成纤维细胞培养上清中羟脯氨酸的含量,ELISA法检测成纤维细胞MMP-1蛋白水平。结果 UVB、UVA辐射成纤维细胞后,细胞损伤程度呈剂量依赖性,加入三七皂苷R1后,体外培养成纤维细胞未出现明显的数量上和形态学改变;三七皂苷R1浓度为5,20μg.mL-1时经UV照射的FB细胞增殖活性增加;三七皂苷R1浓度为5,20μg.mL-1时抑制MMP-1的分泌。结论 UVB、UVA辐射对皮肤成纤维细胞具有明显的损伤作用,而三七皂苷R1对其具有一定的保护作用。

黄芩苷、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1对过氧化氢所致大鼠海马神经元损伤的保护作用

目的 :探讨黄芩苷、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1对过氧化氢所致的大鼠海马神经元损伤的保护作用。方法 :采用新生 1dSD大鼠海马神经元原代培养 ,以H2 O2 ( 5 0 μM)造成细胞损伤模型 ,将黄芩苷、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1的高 ( 2 0 μg ml)和低 ( 0 2 μg ml)两个剂量加入到培养细胞液中。在4h时 ,检测细胞形态及释放出的LDH活性变化 ,观察到上述药物对海马神经元损伤的直接保护作用。结果 :低剂量黄芩苷和三七皂苷R1与模型组比较 ,未见明显差异 ,三种组分高剂量和丹参酮ⅡA低剂量组与模型组比较 ,均有明显差异。结论 :黄芩苷、丹参酮ⅡA。

高效液相色谱法测定三七片中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的含量

目的：用RP-HPLC法测定三七片中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的含量。方法：以ZORBAXEXTEND-C18分析柱（4.6mm×250mm,5μm）;乙腈-水（24∶76）为流动相;检测波长203nm;流速1.2mL.min^-1;柱温30℃。结果：三七皂苷R1在0.153-0.918μg内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.99805）;人参皂苷Rg1在0.786-4.716μg内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.99949）;回收率三七皂苷R1为97.15%,RSD=0.93%,人参皂苷Rg1为98.25%,RSD=0.68%。结论：方法简便、快速、重现性好,可作为三七片质量控制的辅助检测选项。

HPLC法测定复方乌骨藤胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量

建立HPLC法测定复方乌骨藤胶囊中三七皂苷R_1、人参皂苷Rg_1和人参皂苷Rb_1的含量。采用Kromasil C_(18)柱(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以乙腈(A)—水(B)为流动相进行梯度洗脱;流速1.0mL·mL^(-1),柱温40℃。结果表明:三七皂苷R_1在0.229-2.29μg范围内线性关系良好(r=0.9996),平均加样回收率(n=6)为98.7%;人参皂苷Rg_1在0.814-8.14μg范围内线性关系良好(r=1.0000),平均加样回收率(n=6)为99.2%;人参皂苷Rb_1在0.771-7.71μg范围内线性关系良好(r=0.9996),平均加样回收率(n=6)为99.3%。本方法操作简便,结果准确,灵敏度高,重现性好,可作为复方乌骨藤胶囊中所含三七的质量控制方法。

HPLC法测定复元胶囊三七皂苷R1及淫羊藿苷的含量

目的采用HPLC法检测复元胶囊中主要成分三七皂苷R1和淫羊藿苷的含量。方法取3个不同批次复元胶囊各5粒,经溶解、醇提、萃取、过滤等处理后采用HPLC检测其含量,以地高辛为内标,获得药品和内标曲线下面积之比,按照标准曲线计算出三七皂苷R1及淫羊藿苷的含量。结果计算出每粒复元胶囊中三七皂苷R1的含量为12.18 mg/g,淫羊藿苷的含量为54.65 mg/g。结论本实验HPLC方法可行,能准确检测复元胶囊中三七皂苷R1及淫羊藿苷的含量。

三七皂苷R1对铝佐剂甲型肝炎疫苗的免疫增强作用

目的探索三七皂苷R1对Al(OH)3佐剂甲型肝炎疫苗的免疫增强作用及降低铝佐剂用量的可行性。方法在甲型肝炎病毒(HAV)抗原中,加入不同剂量的铝佐剂与三七皂苷R1构成复合佐剂,经肌肉注射免疫小鼠,每隔4周检测小鼠血清HAV-IgG水平,并与无佐剂组和单独铝佐剂组进行比较。结果各免疫组抗体水平在12周时达到最高,之后逐渐下降。在抗原中加入复合佐剂后,与无佐剂组相比,IgG水平显著升高;与单独铝佐剂组相比,加入一定剂量的三七皂苷R1能够显著增强铝佐剂的作用,且抗体水平维持时间较长。结论适当剂量的铝佐剂与三七皂苷R1混合作为佐剂,具有增强铝佐剂的作用,并能降低铝佐剂的用量。

HPLC法测定红药片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg_1的含量

目的:建立高效液相法同时测定红药片中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1含量的方法。方法:液相条件Shim-PackVP-ODS柱,流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液(20︰80),流速为1.0ml/min,检测波长为203nm,柱温为25℃。结果:三七皂苷R1的回归方程为Y=140994X+4793.2(r=0.9991,n=5),线性范围0.5255～1.5770μg,人参皂苷Rg1的回归方程为Y=128600X+178309(r=0.9993,n=5),线性范围2.103～6.308μg;其平均回收率分别为97.94%和98.91%。结论:此法简便、结果可靠,为红药片质量标准控制提供快速准确的测定方法。