响应面法优化三孢布拉氏霉菌发酵产番茄红素工艺

番茄红素除了呈现鲜艳的颜色外,还具有比较强的抗氧化等功能性作用,因而广泛应用于食品、饮料等行业,与化学合成法相比,微生物发酵法生产的番茄红素因为安全性更易于被消费者接受,因此提高天然番茄红素产量意义重大。文章以三孢布拉氏霉菌为发酵菌种,通过响应面法对发酵培养基的组成及发酵条件进行优化,从而提高番茄红素的产量与纯度。经过单因素分析和响应面优化后的培养基组成及培养条件为玉米粉20 g/L、黄豆粉25 g/L、磷酸二氢钾0.6 g/L、硫酸镁0.9 g/L、玉米油12 g/L、发酵液初始pH 6.5、接种量6%、装液量40 mL/250 mL、正菌和负菌接种比例1∶15、培养温度26℃、转速180 r/min、振荡培养144 h,在42 h时加入0.4 g/L的2-氨基-6-甲基吡啶作为环化酶阻断剂,在此条件下番茄红素的产量为626.25 mg/L,比优化前提高了25.6%,该研究结果可为番茄红素工业化生产提供参考,有助于更好地应用于肉品、饮料、保健品等行业。

吡啶类化合物对三孢布拉氏霉菌代谢途径的影响

利用β-胡萝卜素高产菌株三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)发酵生产番茄红素过程中,可通过突变菌株或中途加入阻断剂的方法,将代谢控制在番茄红素水平。主要考察了吡啶衍生物如2,6-二甲基吡啶、2,5-二甲基吡啶、2-氨基-6-甲基吡啶及烟草废弃物(主要成分为3-吡啶基衍生物)对三孢布拉氏霉菌代谢途径的影响。结果表明:1.0g/L的 2,6-二甲基吡啶阻断效果最好,大量积累番茄红素,几乎无β-胡萝卜素生成;加入的烟草废弃物浓度为 15g/L时,有少量β-胡萝卜素生成,番茄红素含量较前者提高58％,达到 1 090.03 mg/L。

N^+离子注入对三孢布拉氏霉菌抗氧化酶活性的影响

本文研究了N+离子注入对三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora(-))细胞内过氧化氢酶(Catalase,CAT)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)活力的影响,以及对菌体清除超氧阴离子自由基O2–·、羟基自由基·OH能力和菌体总抗氧化能力(Total Antioxidative capacity,T-AOC)的影响。结果表明,B.trispora(-)经N+离子注入后CAT酶的活性均低于对照水平,POD和SOD酶的活性以及清除O2–·和·OH的能力随着注入剂量的增加呈现先减后增的变化趋势,而菌体总抗氧化能力在N+注量为6.0×1015cm-2处降到最低,随后逐渐增加,在N+注量为1.2×1016cm-2处增至最大后逐渐下降。由此推测,离子注入B.trispora(-)所诱导的总抗氧化能力的变化是导致B.trispora(-)注量-存活率曲线呈现"马鞍型"变化趋势的原因之一。

三孢布拉氏霉菌发酵产番茄红素工艺条件的优化

利用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素,并对其发酵条件进行探讨,确定其最佳发酵条件。结果表明,番茄红素最大吸收波长为508 nm;活化的冻干粉菌种在斜面培养基上于25℃培养5 d后,呈较好生长状态,菌丝粗壮,孢子生长状态饱满,镜检显示,其个体生长状态良好;扩大培养120 h时孢子数量达到最高峰;发酵至36 h时添加阻断剂效果最好,发酵至72 h时添加增氧剂效果最好。通过发酵条件优化的正交试验发现,三孢布拉氏霉菌发酵产番茄红素的最优发酵工艺为发酵温度25℃、pH值5.0、发酵时间5 d、接种量10.0%。

三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素工艺优化

三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora,B.trispora)是目前微生物发酵产β-胡萝卜素的主要菌种之一。该研究通过单因素及响应面试验对三孢布拉氏霉菌液态发酵培养基成分以及工艺参数进行优化。优化后的最佳发酵培养基组成为:玉米粉20 g/L、黄豆粉30 g/L、葡萄糖4.8 g/L、玉米浆粉2.6 g/L、植物油4%、VB1、0.001%、MgSO40.5 g/L、KH2PO42 g/L。工艺参数:发酵液初始pH 6.80、装液量35 mL/250 mL、负正菌种接种体积比1.60∶1、接种量12.5%、培养温度28℃、转速200 r/min、发酵时间132 h。在此发酵条件下,三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素的含量为523.8 mg/L,比优化前提高了19.9%。

环化酶阻断剂对三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素的影响

番茄红素具有良好的抗氧化活性,在清除自由基、抗癌、抗炎和预防心血管系统疾病等方面都表现出良好的功效。采用微生物发酵的方法,选择三孢布拉氏霉菌作为发酵菌株,加入环化酶阻断剂来提高三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素的产量。以番茄红素产量作为筛选指标,对比4种环化酶阻断剂(2-氨基-6-甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、2-甲基咪唑和2-异丙基咪唑)对番茄红素产量的影响,选出最优环化酶阻断剂,在单因素的基础上进行正交试验优化。结果表明:与未添加环化酶阻断剂相比,添加环化酶阻断剂在一定程度上提高了番茄红素的产量,同时以2-氨基-6-甲基吡啶作为阻断剂,添加量0.5 g/L时番茄红素产量最高,故选择2-氨基-6-甲基吡啶进行正交试验;三孢布拉氏霉菌最优发酵条件为2-氨基-6-甲基吡啶的添加量0.4 g/L,发酵42 h时添加,发酵时间144 h,在此条件下,菌体生物量由39.88 g/L变为38.85 g/L,番茄红素产量由7.18 mg/L提高至498.59 mg/L。环化酶阻断剂对三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素产生积极影响,可显著提高其产量。

三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶多克隆抗体的制备及鉴定

对三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶(CarRA)进行抗原表位分析并制备兔多克隆抗体。运用GOLDENKEY分子生物学软件对三孢布拉氏霉菌CarRA结构蛋白的抗原表位及其二级结构进行了分析比较,结合现有的抗原表位选取原则从中筛选了一段显示表位特征的氨基酸残基序列,应用固相合成法合成三孢布拉氏霉菌CarRA多肽,然后将其与KLH偶联制成免疫原,应用于动物免疫及多克隆抗体的制备,对该多抗与三孢布拉氏霉菌CarRA的反应性进行了检测。获得了三孢布拉氏霉菌CarRA的多抗,该抗体经间接酶联免疫吸附测定法检测其效价为1:32000,Dot blot检测在三个稀释度下都出现了目的条带,证实该抗体具有较好的反应性和特异性。成功制备了三孢布拉氏霉菌CarRA多抗,为进一步明确发酵促进剂的作用机制及其对三孢布拉氏霉菌代谢网络的影响,对CarRA进行定量以及对其相关功能进行深入研究提供了有利条件。

发酵促进剂对三孢布拉氏霉菌发酵的影响

β-胡萝卜素(β-carotene)是一种天然类胡萝卜素,具有预防多种癌症及防治血管硬化和冠心病等作用。三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora,B.trispora)是最常用的β-胡萝卜素高产菌。本文通过向发酵培养基中添加不同的表面活性剂,改变不同植物油的添加量,加入无机氮源硝酸钠和有机碳源丙二酸钠,研究它们对B.trispora产β-胡萝卜素的影响。结果表明表面活性剂Tween20在低浓度下促进合成,高浓度下促进作用降低,添加量为0.5%(体积分数)时B.trispora的β-胡萝卜素含量有最大值133.105mg/L,相对空白值108.167mg/L提高了23.06%,效果比较明显;1.5%(体积分数)的大豆精油效果最好,优于棉籽粗油;无机氮源硝酸钠对于B.trispora的生物合成量和β-胡萝卜素含量均起到抑制作用,不适合作为培养基添加物;有机碳源丙二酸钠添加量为1.0%(体积分数)时β-胡萝卜素含量有最大值112.326 mg/L,不添加时的β-胡萝卜素含量仅为71.566 mg/L,提高1.57倍。

三孢布拉氏霉菌产β-胡萝卜素发酵培养基的优化

通过单因素试验设计找到三孢布拉氏霉菌产β-胡萝卜素的最优碳源为葡萄糖,最优氮源为麸皮浸出液和大豆粉,再通过正交试验设计优化三孢布拉氏霉菌产β-胡萝卜素的发酵培养基,得到了最佳发酵培养基配方为:葡萄糖6%、大豆粉1%、麸皮浸出液3%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、VB10.0005%、大豆油1%,在此培养基配方下三孢布拉氏霉菌的β-胡萝卜素产量达到了325.6mg/L。在此优化的培养基基础上,接种24h后添加0.1%β-紫罗兰酮到发酵培养基中有利于三孢布拉氏霉菌合成β-胡萝卜素。

代谢调节剂对三孢布拉氏霉菌发酵的影响

三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素仍存在产物含量低、代谢调控方法单一等问题。为了进一步提高三孢布拉氏霉菌菌丝体中β-胡萝卜素的含量,通过向初始发酵培养基中添加不同的代谢调节剂,探究其对三孢布拉氏霉菌产β-胡萝卜素的影响。研究发现,发酵培养基中添加0.5%的丙酮酸钠、0.1%的Span-20、0.1%的2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、3%的甘油均能提高β-胡萝卜素含量,其中抗氧化剂BHT的促进作用最大,β-胡萝卜素含量达到4.25mg/g,相比空白组提高了72.1%。不同浓度的液体石蜡对β-胡萝卜素含量没有促进作用,但其促进生物量的增大,使β-胡萝卜素的产量得到提升。

利用常压室温等离子体诱变选育三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素产量差异菌株

为筛选β-胡萝卜素产量差异菌株,通过常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,简称ARTP)诱变三孢布拉氏霉菌孢子,研究不同处理时间对三孢布拉氏霉菌存活率的影响,建立有效的筛选方案,经由洛伐他汀筛选,菌丝产生不同的颜色差异,初步获得β-胡萝卜素产量差异菌株。结果表明,随着ARTP诱变处理时间的增加,其致死率逐渐增高,较为理想的处理时间为160~200 s;洛伐他汀扩大了突变体之间的颜色差异,促进了正突变株的产生;传代并纯化突变体,获得洛伐他汀筛选菌株10株,其中深黄4株、黄色3株、浅黄2株、白色1株,正突变菌株β-胡萝卜素产量上升48.6%,负突变株产量下降16.5%。

三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶定点突变和定向进化研究

三孢布拉氏霉菌中carRA基因编码的CarRA为双功能酶,该酶的R结构域具有番茄红素环化酶的功能,是三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素合成途径过程中的关键酶,其酶活性的高低即环化能力的强弱决定了番茄红素的积累水平。为深入研究三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶的功能,以酿酒酵母菌株W303为出发菌株,首先构建了二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸高效合成的酿酒酵母底盘菌株W303-thmgr-Bts 1,在该底盘菌株中表达三孢布拉氏霉菌的carB和carRA基因,完成类胡萝卜素代谢途径的构建。在此基础上对R结构域进行定点突变和随机突变,并成功构建了5个单一保守位点的突变酶和依赖于酵母同源重组的番茄红素环化酶随机突变体库。通过评估各突变株的菌落颜色和测定类胡萝卜素的产量来确定一系列位点的突变对R结构域催化番茄红素合成β-胡萝卜素能力的影响,最终筛选出了影响该蛋白活性的关键氨基酸位点,为三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶的催化机制研究与酶活性改良奠定了理论基础。

三孢布拉氏霉生物合成β-胡萝卜素的研究──Ⅰ.三孢布拉氏霉负菌优良菌株SCB201的选育

采用紫外照射、亚硝基胍（NTG）和离子束综合诱变处理，获得一株三孢布拉氏霉菌负亩优良菌株SCB201。在优化了的培养条件下，它与三孢布拉氏霉菌正菌SCB200接合培养产β－胡萝卜素达到2g／1，较其亲株0．2g／1的水平提高了10倍。

玉米浆中金属离子对三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素的影响

玉米浆是玉米淀粉生产加工所得的副产物,其含有蛋白质、维生素、氨基酸等营养成分,被广泛应用于微生物发酵生产中,但由于玉米浆包含有多种金属离子,可能会影响微生物发酵生产的过程。本研究通过单因素试验法分别采用Fe Cl3、Mn SO4、Zn SO4、Cu SO4和Ca Cl2模拟玉米浆中存在的Fe3+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Ca2+的不同质量分数,研究了玉米浆中存在的部分金属离子对三孢布拉氏霉菌合成β-胡萝卜素的影响,研究发现一定浓度的Zn2+或Mn2+对三孢布拉氏霉菌合成β-胡萝卜素有促进作用;而不同浓度的Fe3+,Cu2+和Ca2+对β-胡萝卜素合成存在抑制作用。本研究对以玉米浆为原料采用三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素有一定的指导。

三孢布拉霉发酵生产类胡萝卜素的产业化关键点探讨

三孢布拉氏霉菌代谢可产生天然的β-胡萝卜素和番茄红素,该菌株的性能已被广泛认可,并已实现工业化生产。文中对三孢布拉氏霉菌的代谢途径、相关基因、发酵调控和菌株诱变改良等产业化过程中的关键点进行了综述。

β-胡萝卜素发酵过程中关键的代谢产物——三孢酸

利用三孢布拉氏霉菌(Blakelea trispora)发酵生产β-胡萝卜素发现:使用(+)、(-)菌混合的培养物与分别使用“+”、“-”菌的培养物相比,β-胡萝卜素产率可提高3-15倍;既使用膜将(+)、(-)菌株隔开培养,这种作用仍然很明显。究其原因,主要是混合培养物中生成的β因子或称三孢酸在起作用。主要介绍了三孢酸的性质、作用机理和功能、合成路线及其分离纯化,以期为类胡萝卜素实现工业化生产提供依据。

三孢酸结构类似物对发酵生产番茄红素的影响

考察了三孢酸结构类似物α-紫罗酮、β-紫罗酮和脱落酸对番茄红素生产菌Blakeslea trispora的生长和番茄红素合成的影响。结果表明α-紫罗酮、β-紫罗酮和脱落酸对Blakeslea trispora菌体生长影响不大,但都能明显刺激番茄红素的合成。在发酵培养2d后加入α-紫罗酮、β-紫罗酮和脱落酸,番茄红素的产量最高。其中脱落酸的添加对番茄红素产量影响最为显著,在发酵2d后添加脱落酸9.36×10-3mmol/L,番茄红素产量达到549mg/L,比对照(382mg/L)提高了44%。

小分子效应物对发酵法生产番茄红素的影响

利用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素具有较大的工业化生产潜力。本文主要考察了在小试过程中,不同小分子效应物对三孢布拉氏霉菌合成番茄红素的影响。结果表明:trinton-X100对菌体中番茄红素含量影响较小,span-20、β-紫罗酮和异烟肼却可以提高番茄红素的产量。特别是添加span-20可使番茄红素含量提高2倍,达98.6mg/L发酵液。

菌体形态对发酵法生产番茄红素的影响

菌体形态是影响霉菌代谢的重要因素。主要考察了煤油和不同表面活性剂对三孢布拉氏霉菌菌体形态及番茄红素合成能力的影响。结果表明:当添加煤油和triton-X100形成菌丝球时,该菌丝形态不利于物质的传递,细胞合成番茄红素的能力无明显变化。而当添加水溶性表面活性剂span-20时,形成粗、短分散型的菌丝体,强化了传质,促进了番茄红素的合成,番茄红素生产能力提高了近3倍。

生物合成法生产β-胡萝卜素发酵条件研究

对三孢布拉氏霉菌生物合成β-胡萝卜素的发酵条件进行了研究。在一系列单因素试验的基础上,初步得到β-胡萝卜素合成的发酵条件,分析了各因素对β-胡萝卜素产量及发酵生物量进行了分析。经正交设计优化后,得到三孢布拉氏霉菌的最佳发酵条件为:发酵温度为28℃,初始pH为7.0,正负菌种接种比例1:1,接种量为6%,发酵时间为156～162h,种龄42h,在此优化的发酵条件下,三孢布拉氏霉菌的β-胡萝卜素产量为772.47mg/L,比优化前提高了117.3%。