脂氧素A4对Ⅱ型肺泡上皮细胞-间质转化的抑制作用及其机制

目的 探讨脂氧素A4(lipoxin A4, LXA4)对Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡcell, ATⅡ)间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响及可能机制。方法 将A549细胞分为对照组、转化生长因子β1(transforming growth factor, TGF-β1)组、空质粒+TGF-β1组、pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组及LXA4+TGF-β1组。TGF-β1组以5 ng/mL TGF-β1干预A549细胞48 h;空质粒+TGF-β1组和pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组A549细胞先分别转染空质粒或Nrf2过表达质粒,再以5 ng/mL TGF-β1干预48 h;LXA4+TGF-β1组A549细胞先用100 nmol/L LXA4预处理6 h再给予5 ng/mL TGF-β1干预48 h。光镜观察细胞形态变化,免疫印迹及免疫荧光法检测上皮标志物E钙黏蛋白(E-cadherin)、间质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表达;免疫印迹法检测核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)蛋白水平。结果 与对照组相比,TGF-β1组光镜下可见部分A549细胞形态从鹅卵石状变成细长不规则状,呈间质性改变,E-cadherin表达减少(P<0.05)、α-SMA表达增多(P<0.01),Nrf2蛋白水平下调(P<0.05)。与TGF-β1组相比,pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组A549细胞E-cadherin表达增多(P<0.05)、α-SMA表达减少(P<0.01);LXA4+TGF-β1组A549细胞E-cadherin上调、α-SMA下调以及Nrf2蛋白水平增多(P<0.05)。结论 LXA4可抑制A549细胞发生EMT,其机制与上调Nrf2表达相关。

肺上皮细胞昼夜节律紊乱在慢性阻塞性肺疾病中的作用

慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)已成为中国三大常见慢性病之一,但其发病机制尚未完全阐明,治疗手段也较为有限。肺上皮细胞在慢阻肺发病中起到至关重要的作用。吸烟导致的肺上皮细胞生物钟紊乱与慢阻肺发病的关系日益受到关注。本文就气道上皮细胞和肺泡上皮细胞昼夜节律调控紊乱在慢阻肺发病机制中的研究现状,以及潜在的药物治疗策略和未来研究方向作一评述,以期为慢阻肺发病机制研究及其临床治疗提供借鉴与参考。

基于上皮细胞-间充质转化的搜风愈喘方调控哮喘大鼠气道重塑的机制研究

目的探讨搜风愈喘方通过调控上皮细胞-间充质转化(EMT)抑制哮喘气道重塑的作用机制。方法将60只大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、地塞米松组及搜风愈喘方高、中、低剂量组,每组10只。除正常对照组外,其余各组均采用卵清白蛋白(OVA)注射和雾化复制哮喘大鼠模型。各组大鼠给予相应药物灌胃21 d后处死大鼠,苏木素-伊红(HE)染色,观察肺组织病理形态学变化;透射电镜观察大鼠肺组织中上皮细胞超微结构情况;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中的转化生长因子β1(TGF-β1)、白细胞介素17(IL-17)的含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测肺组织匀浆中TGF-β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)的mRNA表达。蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测肺组织中TGF-β1、α-SMA、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,模型对照组大鼠血清中TGF-β1、IL-17含量明显升高(P<0.01),肺组织中TGF-β1、α-SMA和N-cadherin mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.01),E-cadherin mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.01);HE染色显示气道壁及肺泡壁增厚,视野内可见大量炎症细胞浸润,炎症评分明显升高(P<0.01);透射电镜显示肺组织中上皮细胞水肿程度严重,胞内基质局部溶解、变淡,细胞器肿胀明显。与模型对照组比较,地塞米松组和搜风愈喘方各剂量组大鼠血清中TGF-β1、IL-17含量明显降低(P<0.05,P<0.01),TGF-β1、α-SMA和N-cadherin mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01),E-cadherin mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.05,P<0.01);肺组织炎症细胞浸润减轻,支气管壁及肺泡壁增厚程度减轻,地塞米松组和搜风愈喘方高剂量组炎症评分降低(P<0.05);超微结构显示上皮细胞水肿程度明显减轻,细胞膜完整,胞内基质均匀,细胞器大多轻微肿胀。结论搜风愈喘方可降低TGF-β1水平,从而改善肺组织EMT,达到防治哮喘气道重塑的目的。

丁酸钠通过G蛋白偶联受体41介导蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路刺激牛乳腺上皮细胞增殖

本试验旨在研究丁酸钠(SB)刺激牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖的分子机制。采用单因素设计,以含不同浓度(0、15、30、45、60和75μmol/L)SB的DMEM/F12培养基(含10%新生胎牛血清)培养BMECs,通过细胞计数试剂盒(CCK⁃8)检测细胞活性,确定适宜SB浓度。然后以对照(0μmol/L)和适宜SB浓度培养BMECs,并采用蛋白激酶B(Akt)阻断剂(AKT⁃IN⁃1)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)阻断剂雷帕霉素(Rap)或小干扰RNA(siR⁃NA)沉默G蛋白偶联受体41(GPR41)对信号通路及受体进行处理,检测BMECs细胞增殖、凋亡以及GPR41和Akt/mTOR信号通路相关基因和蛋白表达的变化。结果表明:1)与对照组相比,60μmol/L的SB显著提高了BMECs细胞活力(P<0.05),75μmol/L的SB显著抑制了BMECs细胞活力(P<0.05);60μmol/L的SB极显著增加了增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白A2(CCNA2)和细胞周期蛋白D1(CCND1)的mRNA相对表达量(P<0.01),显著增加了PCNA和细胞周期蛋白A1(CCNA1)的蛋白相对表达量(P<0.05)。2)与对照组相比,60μmol/L SB显著或极显著提高了B细胞淋巴瘤2(BCL2)的mRNA和蛋白相对表达量及BCL2/B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(BAX)比值(P<0.05或P<0.01),显著或极显著降低了BAX、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase⁃3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase⁃9)的mRNA和蛋白相对表达量(P<0.05),同时显著或极显著提高了磷酸化蛋白激酶B(p⁃Akt)/Akt和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p⁃mTOR)/mTOR比值(P<0.05或P<0.01)。60μmol/L的SB对Akt和mTOR信号通路的激活被AKT⁃IN⁃1极显著阻断(P<0.01),而Rap抑制mTOR完全逆转了60μmol/L SB对BMECs增殖的促进作用以及增殖基因和蛋白表达的改变(P<0.05或P<0.01),但不影响与凋亡和SB激活的Akt信号通路相关的mRNA或蛋白表达(P>0.05)。3)与对照组相比,60μmol/L的SB极显著提高了GPR41的mRNA相对表达量(P<0.01),显著提高了GPR41蛋白相对表达量(P<0.05)。GPR41 siRNA沉默GPR41后完全逆转了60μmol/L SB对BMECs增殖的促进作用以及Akt/mTOR信号通路相关的增殖基因和蛋白的mRNA或蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。由此可见,60μmol/L SB可通过GPR41介导Akt/mTOR信号通路促进BMECs增殖。

过表达线粒体蛋白磷酸酶2C对人肾小管上皮细胞转录组的影响

背景:课题组前期研究发现相较于野生型小鼠,线粒体蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2Cm,PP2Cm)基因缺失小鼠明显发生肾功能衰竭的症状,因此推测PP2Cm可能在肾脏纤维化发展过程中发挥重要保护作用,然而其分子机制尚不明确。目的:探究PP2Cm基因对于人肾小管上皮细胞转录组的影响。方法:培养人肾小管上皮细胞,用质粒将PP2Cm基因转染进入人肾小管上皮细胞,荧光定量PCR实验和Western blot实验检测细胞中PP2Cm的表达,随后分别提取细胞RNA进行转录组测序,寻找转染组和对照组之间的差异性表达基因,利用生物信息学方法进一步对所得的差异基因进行GO分析和KEGG分析。结果与结论:通过测序分析,与未转染空白细胞相比,在转染PP2Cm基因的人肾小管上皮细胞中存在796个差异性表达基因,其中553个下调基因,243个上调基因,GO分析结果显示,上调表达的基因显著富集在细胞生物合成过程、蛋白质翻译、内在凋亡信号通路等;下调表达的基因显著富集在内皮细胞增殖、细胞黏附等信号通路;KEGG分析结果显示,显著上调表达的基因富集在氨基酸代谢、生物合成等代谢相关信号通路;下调表达的基因显著富集在泛酸和辅酶A的生物合成等信号通路。结果表明,PP2Cm过表达可以影响肾小管上皮细胞的一系列生物学过程相关的多条信号通路,可能在氨基酸代谢、生物合成等代谢相关信号通路中起重要作用。

脂多糖处理时间对山羊瘤胃上皮细胞损伤的影响

在山羊瘤胃上皮细胞(GRECs)基础培养基中加入1μg/mL脂多糖(LPS),培养3、6、9 h后,检测细胞活性、抗氧化指标、炎症因子及紧密连接蛋白基因的表达。结果发现:1)LPS处理3 h组GRECs的活性显著低于处理6 h和9 h组的,而处理6 h和9 h组GRECs的活性无显著差异;2)LPS处理3 h组GRECs的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH–PX)活性极显著低于处理6 h和9 h组的,但MDA含量的变化则相反,GRECs的SOD和CAT活性随LPS处理时间的延长而显著升高,ROS含量则随LPS处理时间的延长而极显著降低;3)LPS处理3h组GRECs的TNF–ɑ和IL–1β相对表达量极显著高于处理6h和9h组的,IL–1β相对表达量随LPS处理时间的延长而显著降低,各组间IL–6相对表达量无显著差异;4)LPS处理3 h组GRECs的ZO–1分布低,随着处理时间延长ZO–1分布增加,LPS处理3 h的GRECs紧密连接蛋白Claudin–1相对表达量显著高于处理6 h和9 h组的。说明随着LPS处理时间的延长,山羊瘤胃上皮细胞能够通过提高自身抗氧化和抗炎症能力来缓解氧化损伤,进而改善细胞屏障功能。

H3K27乙酰化修饰促进lncRNA OIP5-AS1转录并通过上调TLR4诱导过敏性鼻炎鼻黏膜上皮细胞凋亡

目的本研究旨在探讨组蛋白3的27位赖氨酸(H3K27)乙酰化修饰对长链非编码RNA OPA相互作用蛋白5-反义RNA1(lncRNA OIP5-AS1)转录的促进作用,探讨其通过调控Toll样受体4(TLR4)对过敏性鼻炎(AR)中鼻黏膜上皮细胞(NEC)凋亡的影响。方法白细胞介素13(IL-13)处理NEC以建立AR细胞模型。采用实时定量PCR检测OIP5-AS1和TLR4在AR患者鼻黏膜组织和体外细胞模型中的表达。ELISA检测粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、嗜酸性粒细胞趋化因子1(eotaxin-1)和黏蛋白5AC(MUC5AC)的浓度。原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色法用于检测NEC的凋亡。双荧光素酶报告实验用于验证OIP5-AS1和TLR4的关系。染色质免疫沉淀(ChIP)实验分析用于验证OIP5-AS1启动子区组蛋白的H3K27乙酰化修饰。结果与健康对照和未处理的NEC相比,OIP5-AS1和TLR4在AR患者鼻黏膜组织和IL-13刺激的NEC中均表达升高。敲减OIP5-AS1可降低IL-13诱导的NEC的TLR4水平,而过表达OIP5-AS1可增加IL-13处理的NEC的TLR4水平。敲减OIP5-AS1可降低IL-13处理的NEC凋亡率及GM-CSF、eotaxin-1和MUC5AC的分泌,而过表达TLR4可部分逆转敲减OIP5-AS1对NEC凋亡及GM-CSF、eotaxin-1和MUC5AC表达的影响。此外,H3K27ac在OIP5-AS1的启动子区域显著富集,H3K27乙酰化可促进OIP5-AS1在IL-13诱导的NEC中的表达。结论H3K27乙酰化修饰促进OIP5-AS1转录并通过上调TLR4诱导AR中NEC凋亡。

吴茱萸碱对哮喘模型大鼠炎症及上皮细胞凋亡的影响及机制

目的 探究吴茱萸碱对哮喘模型大鼠炎症反应及上皮细胞凋亡的影响及潜在机制。方法 将SD大鼠分为对照组、模型组、吴茱萸碱低剂量组(10 mg/kg)、吴茱萸碱高剂量组(20 mg/kg)、地塞米松组(阳性对照,0.5 mg/kg)、表皮细胞生长因子(EGF)组[丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活剂,10μg]、吴茱萸碱高剂量+EGF组(20 mg/kg吴茱萸碱+10μg EGF),每组10只。除对照组外,其余各组大鼠以10%卵白蛋白(OVA)-氢氧化铝混合液3点注射致敏联合2%OVA雾化液吸入激发的方式建立哮喘模型。检测各组大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞(巨噬细胞、淋巴细胞)数,观察大鼠肺组织的病理变化,检测大鼠肺组织中气道上皮细胞凋亡情况、血清炎症因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素4)水平、通路相关蛋白[p38 MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38 MAPK)、信号转导及转录激活因子1(STAT1)]及凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]的表达水平。结果 与对照组比较,模型组大鼠肺组织可见支气管黏膜水肿、肺泡间隔增厚和大量炎症细胞浸润,炎症细胞数显著增多;气道上皮细胞凋亡率、炎症因子水平、p-38 MAPK/p-38 MAPK和Bax、STAT1蛋白表达水平均显著升高,Bcl-2蛋白表达水平和Bcl-2/Bax均显著降低(P<0.05)。与模型组比较,吴茱萸碱低、高剂量组和地塞米松组大鼠肺组织病理改变均有不同程度缓解,上述各指标均显著逆转,而EGF组上述指标的变化趋势则相反(P<0.05);EGF能显著减弱高剂量吴茱萸碱对哮喘大鼠炎症反应的改善作用(P<0.05)。结论 吴茱萸碱可减轻哮喘大鼠炎症反应并减少气道上皮细胞凋亡,其作用机制可能与抑制p38 MAPK/STAT1信号通路有关。

榅桲总黄酮对高糖诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的影响及作用机制

目的探讨榅桲总黄酮对高糖诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的影响及作用机制。方法用高糖诱导人晶状体上皮细胞建立细胞损伤模型。取人晶状体上皮细胞加入含有30 mmol·L^(-1)葡萄糖的培养基处理24 h,记为高糖组。用含有5.5 mmol·L^(-1)葡萄糖的培养基处理24 h记为对照组。取人晶状体上皮细胞按照每孔5×10^(3)个接种于96孔板,分别加入含有10 mmol·L^(-1)、20 mmol·L^(-1)、40 mmol·L^(-1)榅桲总黄酮与30 mmol·L^(-1)葡萄糖的培养基处理24 h,记为高糖+低榅桲总黄酮组、高糖+中榅桲总黄酮组、高糖+高榅桲总黄酮组。用Lipofectamine2000转染试剂向人晶状体上皮细胞分别转染anti-miR-NC、anti-miR-370,随后加30 mmol·L^(-1)葡萄糖处理24 h,命名为高糖+anti-miR-NC组、高糖+anti-miR-370组。分别向人晶状体上皮细胞转染miR-NC、miR-370 mimics,加30 mmol·L^(-1)葡萄糖的培养基及40 mmol·L^(-1)榅桲总黄酮处理24 h,记为高糖+榅桲总黄酮+miR-NC组、高糖+榅桲总黄酮+miR-370组。采用ELISA法监测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,流式细胞仪检测细胞凋亡率,qRT-PCR检测miR-370表达量,Western blot检测凋亡蛋白表达情况。结果与对照组相比,高糖组人晶状体上皮细胞SOD和CAT活性降低,MDA含量升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与高糖组相比,高糖+低、中、高榅桲总黄酮组人晶状体上皮细胞SOD和CAT的活性升高,MDA含量降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组相比,高糖组人晶状体上皮细胞凋亡率,Caspase-3、Caspase-9蛋白表达升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与高糖组相比,高糖+低、中、高榅桲总黄酮组人晶状体上皮细胞凋亡率,Caspase-3、Caspase-9蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。对照组、高糖组、高糖+低榅桲总黄酮组、高糖+中榅桲总黄酮组、高糖+高榅桲总黄酮组人晶状体上皮细胞miR-370表达量分别为1.00±0.00、4.04±0.36、3.22±0.24、2.42±0.23和1.62±0.14,5组比较差异有统计学意义(F=256.138,P<0.05)。与高糖+anti-miR-NC组相比,高糖+anti-miR-370组人晶状体上皮细胞miR-370表达量降低,SOD和CAT活性升高,MDA含量降低,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。与高糖+anti-miR-NC组相比,高糖+anti-miR-370组人晶状体上皮细胞凋亡率,Caspase-3、Caspase-9蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。与高糖+榅桲总黄酮+miR-NC组相比,高糖+榅桲总黄酮+miR-370组人晶状体上皮细胞SOD和CAT活性降低,MDA含量、细胞凋亡率、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达升高,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。结论高糖诱导的人晶状体上皮细胞中miR-370的表达升高,榅桲总黄酮可抑制高糖诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激和凋亡,其作用机制可能与其能降低miR-370表达有关。

永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10^(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10^(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10^(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0 TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10^(8.75)TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID_(50)/mL)。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

上皮细胞转化序列2通过调控p33生长抑制因子1表达影响食管鳞状细胞癌细胞的体外转移活性

目的探讨上皮细胞转化序列2(ECT2)与p33生长抑制因子1(p33ING1)的表达水平对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞转移活性的影响。方法采用免疫组织化学法和免疫印迹法检测食管鳞癌组织和癌旁组织中ECT2和p33ING1的表达情况。将人食管鳞癌细胞系KYSE140细胞分为4组:空白组、阴性对照组(pcDNA 3.1 NC)组、过表达组(pcDNA 3.1 ECT2)和抑制表达组(si ECT2)。采用MTT法和细胞集落形成实验研究细胞的增殖和生长能力,Transwell实验和划痕实验研究细胞的侵袭和迁移能力,并用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期,Western blotting检测ECT2对p33ING1蛋白的影响。结果在食管鳞癌组织中ECT2表达增加,p33ING1表达降低。过表达ECT2能够显著增加KYSE140细胞的生长、集落形成、迁移以及侵袭能力,并能降低KYSE140细胞的凋亡率和p33ING1的表达;此外,抑制ECT2表达后能够逆转上述变化。结论ECT2高表达能够促进食管鳞癌KYSE140细胞的生长、转移,并抑制其凋亡,其机制可能与ECT2能够抑制p33ING1表达相关。

芒柄花素调节Hippo/YAP信号通路对炎症性肠病大鼠肠上皮细胞凋亡的影响

目的 探究芒柄花素(FMN)对炎症性肠病(IBD)大鼠肠上皮细胞凋亡的影响及可能机制。方法 采用三硝基苯磺酸诱导的方法构建大鼠IBD模型。将造模成功的48只大鼠按照随机数字表法分为模型组(生理盐水),低、高剂量FMN组(20、40 mg/kg FMN)和高剂量FMN+YAP抑制剂Verteporfin(VTPF)组(40 mg/kg FMN+10 mg/kg VTPF),每组12只;另取12只大鼠设为正常组(生理盐水);每天给药/生理盐水1次,连续7 d。末次给药后,对大鼠疾病活动指数(DAI)进行评分;测量大鼠结肠长度;观察大鼠结肠组织的病理学变化;检测大鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10水平;检测大鼠肠上皮细胞的凋亡情况;检测大鼠结肠组织中Yes相关蛋白(YAP)、切割型胱天蛋白酶3(cleaved-caspase-3)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠DAI评分,TNF-α、IL-6水平,肠上皮细胞凋亡率,cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);结肠长度显著变短(P<0.05);IL-10水平和YAP、Bcl-2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);结肠组织出现细胞形态异常、排列紊乱,炎症细胞浸润等病理学变化。与IBD组比较,低剂量FMN组、高剂量FMN组大鼠上述指标水平均显著改善(P<0.05),且具有剂量依赖性(P<0.05);而加入VTPF后,显著逆转了FMN对IBD大鼠上述指标的改善作用(P<0.05)。结论 FMN可能是通过抑制Hippo/YAP信号通路,促进YAP的表达,进而抑制IBD大鼠肠上皮细胞凋亡。

脓毒症外泌体miR-1306-5p对肠黏膜上皮细胞炎症、凋亡和氧化应激的影响

目的研究脓毒症血浆源性外泌体微小RNA-1306-5p(miR-1306-5p)对肠黏膜上皮细胞的炎症、凋亡和氧化应激损伤的调控作用,并探讨潜在机制。方法分离脓毒症血浆源性外泌体和健康血浆外泌体,分为健康血浆外泌体组和脓毒症血浆源性外泌体组。用电镜观察外泌体,分析两组外泌体物理参数,并检测外泌体中miR-1306-5p的表达。将肠黏膜上皮细胞分为对照组、miR-1306-5p模拟物的阴性对照组(mimic-NC组)、miR-1306-5p模拟物组(mimic组)、mimic联合过表达Polo样激酶1(PLK1)的空载体组(mimic-PLK1-EV组)、mimic联合过表达PLK1组(mimic+PLK1-OE组)。采用实时荧光定量PCR检测各组中miR-1306-5p和PLK1 mRNA的表达,蛋白质印记法检测miR-1306-5p的靶基因PLK1、胱天蛋白酶(caspase)3、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl2-相关X蛋白(Bax)的表达,双荧光素酶报告基因法检测miR-1306-5p和PLK1的结合作用,采用流式细胞术检测细胞凋亡,酶联免疫吸附试验检测培养细胞的上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8的表达,试剂盒法检测细胞中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)的表达。结果脓毒症血浆源性外泌体和健康血浆外泌体均呈椭球形,物理参数之间的差异无统计学意义(P>0.05),与健康血浆外泌体组比较,脓毒症血浆源性外泌体组中的miR-1306-5p的表达上调(P<0.05)。双荧光素酶报告基因法证实,PLK1是miR-1306-5p的靶基因。与mimic-NC组比较,mimic组miR-1306-5p、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、caspase3、Bax、ROS、MDA的表达上调,细胞凋亡率增加,PKL1、Bcl-2、GSH、SOD的表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与mimic+PLK1-EV组比较,mimic+PLK1-OE组TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、caspase3、Bax、ROS、MDA的表达明显下调,细胞凋亡率降低,PKL1、Bcl-2、GSH、SOD的表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论脓毒症血浆源性外泌体miR-1306-5p通过靶向抑制PKL1促进肠黏膜上皮细胞的炎症、凋亡和氧化应激损伤。

基于METTL3介导的miR-29a-3p的m^(6)A修饰探讨平喘颗粒抑制气道上皮细胞泛凋亡治疗哮喘的机制研究

目的:观察平喘颗粒对METTL3介导的气道上皮细胞中miR-29a-3p的m^(6)A修饰的影响,明确其抑制哮喘气道炎症的分子机制。方法:16HBE采用LPS诱导(50 mg/L)构建细胞模型,并给予平喘颗粒含药血清和地塞米松进行干预。分别采用CCK8法检测细胞活性、ELISA法检测炎症因子(TNF-α、IL-6和IL-8)的含量和miR-29a-3p的m^(6)A修饰水平、Western blot检测METTL3与泛凋亡蛋白的表达和qRT-PCR检测METTL3与miR-29a-3p的表达。结果:与模型组相比,平喘颗粒能够显著增加16HBE的活力,抑制炎症因子TNF-α、IL-6和IL-8的含量,下调泛凋亡相关蛋白p-RIPK3、p-MLKL、cleaved Caspase-1、cleaved Caspase-3的表达和GSDMD-NT/FL-GSDMD与GSDME-NT/FL-GSDME的比值,差异均具有统计学意义(P<0.01)。此外,平喘颗粒能够显著上调细胞中miR-29a-3p和METTL3的表达水平,促进miR-29a-3p的m^(6)A修饰水平,与模型组相比差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论:平喘颗粒主要通过METTL3增强miR-29a-3p的m^(6)A修饰水平,抑制气道上皮细胞泛凋亡,改善气道炎症。

姜黄素对小鼠小肠上皮细胞氧化应激损伤的保护作用及机制研究

本试验旨在研究姜黄素对小鼠小肠上皮细胞(MODE-K细胞)氧化应激损伤的保护作用及机制。使用过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导小鼠小肠上皮细胞,建立细胞氧化损伤模型,并确定最佳造模H_(2)O_(2)浓度。对照组使用正常培养液培养细胞,不进行任何处理;模型组使用正常培养液培养细胞后,加入H_(2)O_(2)处理细胞4 h;姜黄素组使用正常培养液培养细胞后,先加入不同浓度(1.25、2.50、5.00、10.00和20.00μmol/L)的姜黄素处理细胞12 h,然后再加入H_(2)O_(2)处理细胞4 h。测定小鼠小肠上皮细胞存活率、凋亡率以及细胞中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量和乳酸脱氢酶(LDH)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,实时荧光定量PCR检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤相关X蛋白(Bax)、半胱天冬蛋白酶-3(Caspase-3)的mRNA相对表达水平,利用分子模拟研究姜黄素与Kelch样环氧氯丙烷关联蛋白1(Keap1)口袋结合的优势构象和相互作用,蛋白质印迹(Western blot)检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、Keap1、血红素加氧酶-1(HO-1)的蛋白相对表达水平。结果表明:1)最佳造模H_(2)O_(2)浓度为150μmol/L。2)与对照组相比,模型组的细胞存活率及细胞中SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.05),细胞中ROS、MDA含量和LDH活性显著增加(P<0.05)。与模型组相比,5.00~20.00μmol/L姜黄素组的细胞存活率及细胞中SOD、GSH-Px活性显著增加(P<0.05),细胞中ROS、MDA含量和LDH活性显著降低(P<0.05)。3)与对照组相比,模型组的细胞凋亡率显著增加(P<0.05),细胞中Bcl-2的mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05),Bax和Caspase-3的mRNA相对表达水平显著提高(P<0.05)。与模型组相比,10.00μmol/L姜黄素组的细胞凋亡率显著降低(P<0.05),细胞中Bcl-2的mRNA相对表达水平显著提高(P<0.05),Bax和Caspase-3的mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05)。4)分子对接结果表明,姜黄素通过与Keap1的Kelch结构域结合位点相互作用,成功阻止了Keap1-Nrf2之间的相互作用,从而发挥了抗氧化的作用。Western blot结果进一步表明,与模型组相比,10.00μmol/L姜黄素组的细胞中Nrf2、HO-1的蛋白相对表达水平显著提高(P<0.05),Keap1的蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05)。由此可见,适宜浓度(10.00μmol/L)的姜黄素可通过促进Nrf2/HO-1信号通路中Nrf2和HO-1的蛋白表达,抑制Keap1的蛋白表达,减轻H_(2)O_(2)诱导的小鼠小肠上皮细胞的氧化损伤。

茶树油对脂多糖诱导奶牛小肠上皮细胞损伤的影响

本试验旨在研究茶树油(TTO)对脂多糖(LPS)诱导奶牛小肠上皮细胞(BIECs)损伤的影响。试验选取3头健康新生中国荷斯坦犊牛的空肠组织,分离并获得BIECs进行培养。通过使用不同浓度的LPS(0、1、2和4μg/mL)和不同浓度的TTO(0、0.00625%、0.01250%、0.02500%、0.05000%和0.10000%),建立细胞炎症模型。然后,对照组以不含TTO和LPS的培养基处理细胞;LPS组以1μg/mL的LPS处理细胞12 h;LPS+TTO组采用0.01250%和0.02500%的TTO预处理细胞12 h,经水洗后,再暴露于LPS处理12 h。结果表明:1)与对照组(未添加TTO)相比,添加0.00625%、0.01250%、0.02500%和0.05000%TTO对BIECs细胞活力无显著影响(P>0.05),添加TTO显著提高跨膜电阻(TEER)(P<0.05)。与对照组相比,添加0.01250%TTO显著提高BIECs中闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、封闭蛋白(occludin)、闭合蛋白-1(claudin-1)和闭合蛋白-4(claudin-4)的mRNA相对表达量(P<0.05),显著降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA相对表达量(P<0.05)。2)与LPS组相比,LPS+TTO组TEER以及ZO-1、occludin和claudin-1的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05),TNF-α的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05);LPS+TTO组ZO-1蛋白相对表达量显著提高(P<0.05)。综上可知,TTO可以通过上调紧密连接蛋白表达和下调炎性因子表达,缓解LPS诱导的犊牛小肠上皮细胞屏障功能障碍和炎症损伤。

基于网络药理学的银杏叶提取物修复蓝光损伤视网膜色素上皮细胞的机制

目的探讨银杏叶提取物修复蓝光损伤视网膜色素上皮细胞的作用机制。方法用网络药理学方法获取银杏叶提取物的活性组分、二级结构及其作用靶点、疾病作用靶点、构建蛋白互作关系网络、筛选出关键蛋白,并进行富集分析。体外细胞实验检测蓝光损伤视网膜色素上皮细胞添加银杏叶提取物后细胞活性、细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)相对量和miR-103a-3p mRNA表达量。结果查得银杏叶提取物20种活性组分、61个对视网膜色素上皮病变的潜在作用靶点,富集分析发现潜在作用靶点基因本体主要富集到BP,京都基因与基因组百科全书主要富集到脂质和动脉粥样硬化通路等。体外实验发现,银杏叶提取物可以提高蓝光损伤后视网膜色素上皮细胞活性,减少ROS相对量,高剂量的银杏叶提取物可以降低miR-103a-3p mRNA表达(P均<0.05)。结论银杏叶提取物可能通过作用于肿瘤坏死因子、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、前列腺素内过氧化物合成酶Ⅱ等9个靶点,调节脂质与动脉粥样硬化通路、癌miRNA(microRNAs in cancer)通路等,抑制视网膜色素上皮细胞的细胞死亡、氧化代谢等,从而修复视网膜色素上皮细胞蓝光损伤。

病理组织学方法在犬乳腺肌上皮细胞源肿瘤诊断中的应用

犬乳腺肌上皮细胞源肿瘤是少见的犬乳腺肿瘤类型之一,瘤细胞常呈梭形或多形性,细胞质中常可见透明空泡,较易与其他含有空泡化胞质的肿瘤和梭形细胞瘤混淆,因此采用合适的诊断方法对犬乳腺肌上皮细胞源肿瘤进行精准诊断是很有必要的,尤其对于其临床精准治疗至关重要。其中病理组织学诊断是肿瘤病诊断的金标准,论文总结了常规HE染色、PAS糖原染色、脂肪染色和免疫组织化学染色方法在犬乳腺肌上皮细胞源肿瘤诊断中的应用,以期为实现犬乳腺肌上皮细胞源肿瘤的精准诊断提供依据。

TGF-β_(1)通过miR-21d-5p调控BMP7表达诱导肾小管上皮细胞增殖及迁移

目的:探讨转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))可能通过微小RNA-21d-5p(miR-21d-5p)对骨形态发生蛋白7(BMP7)的调控,从而对肾小管上皮细胞的增殖以及迁移的影响及可能机制。方法:观察TGF-β_(1)处理的肾小管上皮细胞HK-2并检测miR-21d-5p的表达,在HK-2细胞中分组转染miR-21d-5p或anti-miR-21d-5p,再使用TGF-β_(1)处理,观察过度表达或抑制表达miR-21d-5p对TGF-β_(1)诱导肾小管上皮细胞的细胞活性及迁移的影响。分析TGF-β_(1)、miR-21d-5p与BMP7的靶向关系。共转染miR-21d-5p和pcDNA3.1-BMP7,或anti-miR-21d-5p和si-BMP7,使用TGF-β_(1)处理,评估TGF-β_(1)、miR-21d-5p与BMP7的在肾小管上皮细胞的增殖以及迁移的相互关系。结果:TGF-β_(1)处理HK-2细胞后,miR-21d-5p表达和迁移细胞数量升高(P<0.05),P21和E-钙黏蛋白(E-cadherin)水平降低(P<0.05)。过度表达miR-21d-5p增加TGF-β_(1)诱导HK-2细胞增殖和迁移上调(P<0.05),降低P21和E-cadherin蛋白表达(P<0.05),过度表达BMP7可以逆转此过程。抑制miR-21d-5p降低TGF-β_(1)诱导HK-2细胞增殖和迁移细胞水平(P<0.05),显著升高P21和E-cadherin蛋白水平(P<0.05),被抑制表达的BMP7可以逆转此过程。结论:TGF-β_(1)可能通过miR-21d-5p靶向调控BMP7表达,从而诱导肾小管上皮细胞增殖及迁移,进一步影响肾脏纤维化进展。

阿魏酸改善高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的研究

目的 通过观察阿魏酸(FA)对高糖(HG)诱导视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)损伤的影响,探讨FA对糖尿病视网膜病变的作用机制。方法 采用HG处理ARPE-19构建体外糖尿病视网膜色素上皮细胞损伤模型,FA溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,分为Control组(5 mmol/L葡萄糖)、DMSO组(0.1%DMSO+5 mmol/L葡萄糖)、HG组(30 mmol/L葡萄糖)、HG+FA组(30 mmol/L葡萄糖+50μmol/L)。通过CCK-8检测细胞的增殖活性;采用活性氧(ROS)检测试剂盒检测各组ROS水平;免疫细胞荧光和Western blot检测Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子(MyD88)、核因子κB(NF-κB)的表达水平。结果 CCK-8检测结果表明,与Control组相比,HG可诱导ARPE-19细胞的增殖活性降低,而FA可改善高糖对细胞增殖的影响(P<0.05)。ROS检测结果表明,与Control组相比,HG组可诱导ARPE-19细胞ROS荧光强度升高,FA可显著降低高糖诱导ARPE-19细胞的ROS荧光强度(P<0.05)。免疫细胞荧光和Western blot实验表明,HG组可诱导ARPE-19细胞TLR4、MyD88、NF-κB表达升高,FA可显著降低它们的表达(P<0.05)。结论 FA通过降低ROS产生和下调TLR4、MyD88、NF-κB表达改善高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤。