SSR不对称PCR法分析虾夷扇贝遗传多样性

采用微卫星引物的不对称扩增法(即不对称PCR-SSR方法),得到了较为准确的微卫星,运用8对微卫星标记对取自日本青森县的自然群体(QSX)、俄罗斯海参崴自然生群体(HSW)和大连旅顺口的自然群体(LSK)及大连的广鹿岛(GLD)、獐子岛(ZZD)、小长山(XCS)和凌水桥(LSQ)养殖群体进行遗传多样性分析。平均观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.51563～0.64583和0.67575～0.74535,其中QSX群体的平均杂合度最高,HSW群体的最低,各群体间的差异不显著,说明中国的扇贝的群体遗传多样性仍然处于一个很高的水平,种质资源较丰富。并对常规PCR和不对称PCR方法扩增微卫星的优缺点进行了探讨。

猪圆环病毒2型不对称PCR检测方法的建立

为研究制备单链DNA的方法,根据GenBank已发表的PCV-2全基因组序列,设计合成2条特异性引物和1条通用引物,通过pGM-T-PCV-2重组质粒的构建、引物浓度优化、单链PCR产物的杂交测序鉴定,以及敏感性和特异性试验,对PCV-2不对称PCR方法进行了研究。结果显示,上、下游引物用量比为20∶1～40∶1时,可明显扩增出457 bp大小的单链和双链特异性目的片段,不对称PCR敏感性和对称PCR相一致,CSFV、PRV、PPV核酸扩增均为阴性,具有良好的特异性和敏感性。PCV-2不对称PCR方法的建立,为基因芯片制备的相关研究奠定了基础。

分子信标用于不对称PCR检测乙型肝炎病毒

为了缓解竞争杂交对分子信标检测的影响, 将分子信标与不对称聚合酶链式反应(PCR)联用进行血清中乙型肝炎病毒(HBV)的检测。并采用更为直接的荧光方法, 将不对称PCR扩增中的引物浓度比确定为5∶1, 该结果与电泳方法得到的结果有所不同。文中结合对称及不对称PCR过程中荧光强度的变化情况, 对其原因进行了详细的探讨。分子信标与不对称PCR联用, 可以专一地检测出血清中HBV的存在, 与分子信标/对称PCR相比, 其检测效果明显增强。

通用多重不对称PCR结合寡核苷酸芯片检测7种食源性致病菌

应用通用多重不对称聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和寡核酸芯片技术建立一种同时检测7种常见食源性致病菌的方法。每种致病菌上游或下游引物5’端连接一段异源的共有序列。以荧光标记的该共有序列作为通用引物,与限制性特异引物经一步多重不对称PCR同时获得所有目标菌的单链标记靶序列,可被芯片上固定的特异性寡核苷酸探针捕获。通过芯片扫描、分析荧光信号完成检测。标准菌株检测结果证实,该方法可特异地检测单一和混合感染的目标菌,基因组DNA的检测灵敏度为0.1~1 pg。95份模拟污染和零售食品样本芯片检测结果与常规的分离与生化鉴定及荧光定量PCR结果一致。建立的寡核苷酸芯片方法可为快速、特异、灵敏及高通量地鉴定食源性致病菌提供一种有效的检测手段。

胰岛素突变体合成中不对称PCR条件的探讨

在胰岛素定点突变体合成中 ,对不对称PCR反应中突变位点的引物和末端引物的比例以及退火温度进行优化。结果表明 :PCR反应 5′末端引物与突变引物的配比为 5 0∶1～ 10 0∶1;第 2轮PCR反应退火温度在 6 5～ 70℃较为理想。

不对称PCR技术及其在食源性致病菌检测中应用的研究进展

不对称PCR技术是获取单链DNA的一种重要方法。将不对称PCR技术与常用核酸检测方法结合,具有较高的灵敏度和较强的特异性,已被广泛应用食源性致病菌检测中。本文对不对称PCR技术进行简介,综述近年来其在食源性致病菌检测中的应用概况,并对其存在的问题进行了简单阐述。

应用不对称PCR提高PRRSV-CSFV-JEV共检芯片的杂交效率

目的比较采用普通RT-PCR和不对称PCR分别进行样品的直接荧光标记,应用于cDNA芯片杂交,分析其对芯片杂交效率的影响。方法以本实验室建立保存的重组质粒和病毒为模板,进行不对称RT-PCR引物浓度优化,应用普通RT-PCR与不对称RT-PCR进行直接荧光标记,将标记的产物与制备的cDNA芯片杂交,在相同条件下完成杂交后芯片的洗涤与扫描,记录扫描图片与数据。结果与普通RT-PCR标记方法相比,应用不对称RT-PCR技术标记单链靶基因,能特异有效提高芯片的杂交效率。结论应用不对称RT-PCR技术对样品进行荧光标记后,与cDNA芯片杂交能提高芯片的杂交效率,有利于cDNA芯片的检测应用。

利用交错式热不对称PCR法获取多脊椎蒙古羊Hoxc8启动子序列的研究

[目的]探索获得蒙古羊Hoxc8基因启动子序列的方法。[方法]尝试利用交错式热不对称PCR法,获得蒙古羊Hoxc8启动子序列。[结果]通过PCR获得的序列不理想,测序结果无法与已知序列相匹配。虽然利用交错式热不对称PCR法未获得蒙古羊的Hoxc8的启动子序列,但可为今后的相关研究提供借鉴。[结论]该研究为进一步分析蒙古羊Hoxc8的启动子区域的甲基化状态奠定了基础。

五指山猪H-FABP基因不对称PCR-SSCP研究

以海南五指山猪为试验材料,采用不对称PCR-SSCP和测序相结合技术,对海南五指山猪心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因第3内含子(intron 3)进行多态检测,并分析其与生长性状(体重、体高、体长、胸围)的相关性。结果表明:在五指山猪H-FABP基因in-tron 3中发现了3种基因型,分别命名为AA、AB、BB,对其中的纯合子AA、BB进行测序,发现intron 3的第335位点处发生了突变,都是由碱基A→G的转换造成。AA、AB、BB三种基因型频率分别为63.5%,18.2%,18.2%,A、B等位基因频率分别为73%和27%。不同基因型个体各生长性状的方差分析表明,不同基因型之间的生产性状无显著差异。

不对称PCR制备单链探针检测登革Ⅱ型病毒复制型RNA和复制中间体RNA

登革病毒是具包膜的单股正链RNA虫媒病毒 ,病毒的复制过程发生在感染细胞胞浆 ,复制型 (RF)RNA是病毒半保留复制的循环模板 ,复制中间体 (RI)RNA的合成则是病毒复制所必需的。经RT PCR获得的DNA模板进行不对称PCR扩增 ,当限制性引物终浓度为 2 5 0nmol L ,两引物比例为 1 0 0∶1时 ,即得到不对称PCR的预计单链和双链DNA产物。此单链产物用于标记探针进行核酸杂交。

IBV S1基因不对称PCR的研究

ＤＮＡ模板为ＩＢＶ广东地方株Ｄ４１经病毒ＲＮＡ提取后反转录而获得；两引物为ＩＢｖＢｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列；跨幅为１．７ｋｂ。当限制性引物（Ｏｌｉｇｏ３’）终浓度为０．８ｍｇ／Ｌ、两引物比例为１：１０时，即得到不对称ＰＣＲ的预计单链和双链ＤＮＡ产物。此研究结果及不对称ＰＣＲ反应条件为国内首次报道。

不对称PCR杂交显色方法的建立及其对HBV DNA的检测

目的：建立一种灵敏、快速、特异的检测 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ Ｐ Ｃ Ｒ产物的杂交显色方法． 方法：使用一个生物素标记的上游引物对 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 进行不对称 Ｐ Ｃ Ｒ扩增，使扩增出的单链带有生物素，并可结合在固定有链亲合素的微孔板表面． 用标有辣根过氧化物酶的探针与固定的单链 Ｐ Ｃ Ｒ 产物杂交，而后加底物显色测定吸光值． 结果：该方法比常规的琼脂糖凝胶电泳法更特异，而且灵敏度高１０ 倍～１００ 倍，对简便处理的标本适应性强，具有良好的重复性． 结论：该方法可以代替琼脂糖凝胶电泳法，有望成为 Ｐ Ｃ Ｒ 产物定性检测的常规临床检验方法．

随机ssDNA文库不对称PCR扩增条件的优化及回收效率比较

本研究开展了SELEX技术中ssDNA文库不对称PCR扩增及回收条件的优化试验,结果得出:20μL不对称PCR反应体系中上下游引物的最佳比例为60∶1,最优循环数为30个循环,回收效率最高的方法为乙醇沉淀法。此条件下,随机ssDNA文库不对称PCR扩增出来的条带清晰、稳定、特异性高,并具有较好的纯化效率。

应用不对称PCR法进行表面等离子共振微生物核酸检测

目的通过比较不同方法获取的微生物核酸样本用于表面等离子共振(SPR)传感器检测效果的差异,对不对称PCR法制备核酸单链用于SPR检测效果进行研究。方法分别将经淬火处理和未经处理的不对称PCR、常规PCR产物用于SPR传感器检测,以检测曲线和检测响应为指标对各样本在SPR传感器上的检测效果进行比较。结果实验结果表明不对称PCR可以直接获得核酸单链,较常规PCR方法在SPR核酸检测上具有更好的检测效果:经过淬火处理后不对称PCR产物样本平均折射率(R I)改变为39.33(RU),而相同浓度的普通PCR产物只有10.63(RU);同时在SPR实时检测曲线也可以观察到不对称PCR产物能够产生明显的结合信号,而普通PCR则没有类似信号出现。结论利用不对称PCR方法可以制备直接用于SPR检测的核酸单链,并且在杂交检测效果上明显优于普通PCR方法。

不对称PCR的引物浓度优化及在柑橘基因型分析上的应用

对柑橘不对称PCR的引物比例浓度进行优化筛选,并以不同柑橘品种的基因组片段为模板验证不对称PCR在柑橘品种基因型分析中的可行性。结果表明,不对称PCR双侧的引物最佳浓度因引物不同而不同,当浓度为10∶1时均能达到理想效果,可见不对称PCR可以用于柑橘基因型分析。

高效阴离子交换色谱法分离不对称PCR产物

目的为分离制备高纯度的DNA单双链提供新的技术方法.方法利用SOURCE15Q强阴离子交换柱分离纯化DNA单双链,并测定回收率.结果SOURCE 15Q柱在紫外检测波长为260nm,流速为1ml/min,流动相为pH9.0时,以20mmol/L Tris-HCl缓冲液+2.0mol/LNaCl,线性浓度梯度洗脱的分离条件下,能很好地对85个碱基长度不对称PCR产物的单双链进行分离;对24mer单链样品进行回收率测试,回收率为92.46%.结论利用SOURCE 15Q强阴离子交换柱分离纯化DNA单双链的方法简便、快捷、稳定、分辨率高、纯度高,适合核酸单链和双链样品的分离、纯化、鉴定和制备.

新型多重不对称PCR-电化学芯片法检测甲型流感病毒

目的建立一种基于多重不对称PCR-电化学芯片技术同时检测多种甲型流感病毒的新方法。方法根据常见型甲型流感病毒的基质蛋白(matrix protein,MP)、血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase transferase,NA)基因的保守序列分别设计特异性引物和探针,建立优化多重PCR反应体系,再结合电化学芯片技术建立多重不对称PCR-电化学芯片法检测甲型流感病毒,对所建方法进行特异性和敏感性评价,同时检测200例流感样动物咽拭子样本。结果本方法检测灵敏度可达1×10~3copies/mL,200例动物样本中检出194例阳性,敏感率为97%。结论本研究建立的多重不对称PCR-电化学芯片法可同时检测常见类型甲型流感病毒,具有较高的特异性和灵敏度,且操作较简单、检测周期短,便于临床筛查、诊断和治疗。

Tm值差异型不对称PCR方法的建立及其在分子诊断中的应用

多数分子诊断方法对靶基因的检测都是以单链DNA为基础的,如何获得大量和高质量的单链靶DNA分子一直是研究热点.以包含BRCA1基因上3个单核苷酸多态性(SNP)的DNA片段为研究对象,通过调整不对称扩增引物碱基序列组成(5′-端引入错配或加入锁核苷酸(locked nucleic acid,LNA)),使用相差10倍浓度来增加不对称引物间Tm值差异,改进扩增条件(添加增强剂的扩增缓冲液,不同退火温度的二阶循环扩增程序)后,进行不对称扩增来产生大量单链靶DNA产物.结果表明Tm差异型不对称PCR(Tm difference asymmetric PCR,TDA-PCR)可有效提高单链DNA分子产率,降低引物设计难度,也扩大了模板序列的适用范围.此外,还针对禽流感病毒H5N1的血凝素(haemagglutinin)HA基因保守序列进行不对称扩增,用获得的单链DNA为模板进行焦磷酸测序检测,所得结果与参考序列一致且无明显干扰信号.因此,采用Tm值差异型不对称PCR可使焦磷酸测序等分子诊断流程更为简便,成本更低,效率更高,具有很好的通用性和实用性.

不对称PCR扩增检测土壤中的肠道病原菌

主要研究内容为通过对最佳反应总体系、反应时间和反应温度等条件进行探索,建立用不对称PCR扩增技术检测土壤中典型肠道病原菌的实验条件。实验主要目的是通过不对称PCR扩增技术获得大量的单链DNA,为用基因芯片方法检测土壤中的典型肠道病原菌做准备。应用不对称PCR扩增检测技术对样品进行荧光标记后,与寡核苷酸基因芯片进行杂交,可以提高杂交效率。

多重不对称PCR探针熔解曲线法在一管中检测多个肥胖易感基因方法的建立

目的针对中国人群4个常见的肥胖易感基因位点(FTO基因rs1421085位点、APOA5基因rs662799位点、FABP2基因rs1799883位点、ADRB3基因rs4994位点),建立一种方便、精准、低成本的检测方法。方法结合前期研究中发现的与中国人群肥胖密切相关的4个基因位点,设计引物对、荧光探针以及对应等位基因的靶序列,通过熔解曲线法,验证荧光探针与对应等位基因的靶序列的工作效果,确认不同基因型的熔解温度。采用PCR-Sanger测序法为金标准,对收集的人唾液样本进行检测,选取12个基因型的样本,开发多重不对称PCR荧光探针熔解曲线法进行检测。随后,使用多重不对称PCR探针熔解曲线法与PCR-Sanger测序法分别对200例志愿者的唾液样本进行基因分型检测,比较两种方法的结果与优缺点。结果多重不对称PCR探针熔解曲线法可以在一管中同时对4个常见的肥胖易感基因位点进行检测,准确度与PCR-Sanger测序法相同,且与PCR-Sanger测序法需有扩增、电泳、纯化、s测序的复杂步骤相比,可在一管中一次完成检测,操作更为便捷,且成本更加节省。结论本研究建立了一种针对4个常见肥胖易感基因位点的方便、精准、低成本的基因分型方法,为人群肥胖易感基因的批量筛查提供了一种有效的检测手段。