中性蛋白酶高温酶解条件下猪粪资源化利用中养分的变化规律

以酶工程及酶动力学为技术依托及科学依据,将猪粪加玉米秸秆组合作为底物,添加2%中性蛋白酶,在生化反应釜中80℃酶解3 h,底物含水量降低至56.01%,同比下降2.34%;大分子有机质含量降低至63.79%,酶解后,A、B处理的底物有机质含量分别降低了14.19%、15.06%;植物可利用大量元素提高至6.87%,符合NY 525—2012有机肥标准;速效磷、速效钾、全盐、总腐殖酸呈下降趋势;蛔虫卵死亡率达到92%,种子发芽指数达到54%,达到有机肥腐熟标准。

枯草芽孢杆菌对环境耐受性和产中性蛋白酶能力研究

为了探究枯草芽孢杆菌对环境耐受性及产中性蛋白酶的能力,试验模拟饲料加工温度、胃肠道酸性环境、胆盐对枯草芽孢杆菌进行环境耐受性评定,在单因素(pH值、时间、温度、接种量、碳源、碳源添加量和金属离子)试验基础上采用正交试验以中性蛋白酶活力为评定指标,对枯草芽孢杆菌培养条件进行优化。结果表明:枯草芽孢杆菌对温度、胃肠道酸性环境和胆盐均具有一定耐受性;单因素试验中最佳pH值为5,培养时间为24 h,培养温度为30℃,接种量为2%,碳源为淀粉,淀粉添加量为3%;金属离子Mg^(2+)、Fe^(2+)、Mn^(2+)、Cu^(2+)和Zn^(2+)对产酶均具有抑制作用,不在培养基中添加金属离子。正交试验优化后枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶活力最佳培养条件为pH值6,淀粉添加量3%,培养温度35℃,培养时间24 h,枯草芽孢杆菌种子菌液接种量3%,在最优条件下,酶活力可达40.05 U/mL。说明枯草芽孢杆菌可耐受动物胃肠道环境且培养条件优化后中性蛋白酶酶活力显著提高。

中性蛋白酶辅助提取天麻淀粉的工艺优化

以新鲜天麻为原料、中性蛋白酶为酶解剂,通过单因素和正交试验研究料液比、酶解时间、酶解pH、酶添加量和酶解温度对天麻淀粉中蛋白质残留率和天麻淀粉得率的影响,并确定最佳提取工艺。结果表明:天麻淀粉提取最佳工艺为料液比1∶7(g/mL)、酶解时间2.5 h、酶解温度35℃、酶添加量0.8 mg/g、酶解pH 7.0,在此条件下天麻淀粉得率为12.49%,蛋白质残留率为0.0068%。

枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定化及应用的研究

目前酶法脱毛用酶稳定性差,易受到外界环境影响。为改善酶的稳定性和提高酶法脱毛效率,以脱毛用中性蛋白酶为研究对象,以纳米SiO_(2)、海藻酸钠和壳聚糖为固定化材料,采用共价结合法对枯草芽孢杆菌来源的重组中性蛋白酶的固定化进行了探索和研究。以固定化中性蛋白酶的酶活回收率为指标,通过单因素结合响应面法优化了中性蛋白酶固定化三种材料的配比,纳米SiO_(2)1.02%、壳聚糖1.32%和海藻酸钠1.57%,在此条件下固定化中性蛋白酶的回收率可达67.28%±4.21%。将固定化中性蛋白酶应用于黄牛皮循环脱毛工艺中,可循环脱毛4次,液体酶仅可开展3次,与液体酶相比其稳定性显著提高。经组织学评价脱毛后的黄牛皮粒面和毛孔结构清晰,网状层联系紧密,无缝隙;胶原纤维束内部略松散,胶原纤维束之间略松散。因此,固定化中性蛋白酶可用于皮革业脱毛环节,推动酶制剂在制革业的应用。

中性蛋白酶对抑制韧性饼干自然断裂的影响

在韧性饼干的生产过程中添加中性蛋白酶,在相同的配方和工艺、不同储藏温度条件下比较中性蛋白酶的添加量对饼干自然破碎率的影响,确定了适宜的中性蛋白酶添加量范围。

中性蛋白酶及碱性蛋白酶制备玉米粗肽的醒酒活性比较

本文旨在使玉米蛋白增值,为工业化生产玉米醒酒肽提供依据。采用气相色谱、氨基酸自动分析仪等仪器,研究了玉米蛋白水解物——粗肽的醒酒活性。结果表明:中性蛋白酶的低水解度粗肽(2h、酶底比0．5％、料液比1:25)能使小鼠血醇浓度降低54．06％,但该粗肽的蛋白回收率太低。碱性蛋白酶的中水解度粗肽(4h、酶底比0．5％、料液比1:20)的醒酒活性高,并存在剂量效应关系,其剂量为800 mg／kg．bw时,小鼠血醇浓度降低了62．80％,且该粗肽的蛋白回收率高,具有开发价值。

饲料中添加中性蛋白酶对青鱼生长、消化及鱼体组成的影响

用含中性蛋白酶8000U/g的酶制剂,制作酶制剂使用量分别为0、0.5‰、1‰、2‰和3‰的5种实验饲料,喂养平均初始重为(3.03±0.04)g的5组三重复的青鱼鱼种8周。实验在容积为80L的15只循环式水族箱中进行。实验水温为(25.0±0.5)℃。结果表明:实验饲料中酶制剂含量为0.5‰时,实验鱼的鱼体增重与摄食不含酶制剂饲料的实验组无显著差异(p>0.05),而当饲料中酶制剂含量提高至1‰时,鱼体增重出现显著提高(p<0.05)。但饲料中酶制剂含量从1‰进一步提高至2‰和3‰,则鱼体增重不再有显著变化(p>0.05);饲料中酶制剂含量为1‰、2‰和3‰实验组的摄食量显著高于饲料中酶制剂含量为0和0.5‰的实验组(p<0.05)。而饲料中酶制剂含量为1‰、2‰和3‰实验组的饲料系数显著低于饲料中酶制剂含量为0和0.5‰的实验组(p<0.05);青鱼饲料中使用酶制剂对饲料干物质的表观消化率、实验鱼的肠蛋白酶活性、肠和肝胰脏淀粉酶活性、全鱼营养组成、脏体指数、肝体指数无显著影响(p>0.05);饲料中0.5‰—3‰酶制剂含量时,实验鱼对饲料蛋白质的表观消化率均显著高于饲料中不含酶制剂的实验组(p<0.05)。青鱼鱼种肝胰脏蛋白酶活性随着饲料中酶制剂使用量从0增加0.5‰和1‰而呈逐渐升高的趋势,但饲料中酶制剂使用量继续增加则不再有显著变化。因此,在本实验条件下,饲料中使用1‰—3‰的中性蛋白酶制剂促进青鱼鱼种的生长和降低饲料系数。

枯草芽孢杆菌高产中性蛋白酶发酵条件的优化

通过单因素试验和正交试验对枯草芽孢杆菌10075菌株发酵产中性蛋白酶的培养基组分及培养条件进行优化,达到提高菌株中性蛋白酶产量的目的。结果表明,发酵培养基的最佳组分:添加麦芽糖8.0%、蛋白胨4.0%、MgSO4 0.08%;最适发酵条件为发酵温度37℃、初始pH 7.0、发酵时间42 h,酶活力由最初的98.36 U/mL提高到353.45 U/mL。

中性蛋白酶发酵工艺优化研究

采用正交试验，对枯草芽孢杆菌ＨＤ４０１中性蛋白酶深层发酵工艺进行了优化，结果表明：较优发酵培养基为玉米粉５％、豆饼粉３％、麸皮４％、Ｎａ＿２ＨＰＯ＿４０．４％、ＫＨ＿２ＰＯ＿４０．０３％；在发酵中期流加蚕蛹水解液５％、植酸钙０．２％、吐温－８００．１％，对发酵后期有较大的调控作用。采用优化工艺，在２Ｌ发酵罐中进行验证试验，酶活达１３２００ｕ／ｍｌ，比原工艺提高了１６４％。

AS1.398中性蛋白酶固定化条件的初步研究

考察壳聚糖、卡拉胶、海藻酸钠、琼脂等固定化载体对 AS1 .398中性蛋白酶固定化的影响。确定 0 .3%戊二醛在 30℃ ,p H8.0的条件下处理壳聚糖 8～ 1 0 h,加酶液 ,固定 8h,酶活力回收约为 77% ,固定化酶最适作用温度为 55℃ ,最适作用 p H为 8.0 ;

中性蛋白酶水解鸡骨泥制备短肽工艺优化

为了探究酶法制备鸡骨泥短肽的最佳工艺,该文研究了以中性蛋白酶酶解鸡骨泥时各因素对短肽得率和羟自由基清除率的影响,以及鸡骨泥肽清除超氧阴离子自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)的能力。试验探究了酶解过程中不同底物浓度、酶浓度、反应温度和反应时间对短肽得率和羟自由基清除率的影响,采用响应曲面优化得到了以短肽得率为目标的中性蛋白酶酶解鸡骨泥的最优工艺,当反应液p H值为7.2,反应温度42℃,反应时间2 h,底物质量分数5%,酶添加量200 mg/g,该条件下制备鸡骨泥肽,测得其短肽得率为56.16%,羟自由基清除率为54.12%。采用该酶解工艺制备鸡骨泥肽,测得其对超氧阴离子自由基最高清除率为56.01%,对DPPH自由基最高清除率为81.57%,说明鸡骨泥肽具有一定的抗氧化活性,研究结果为酶法制备鸡骨泥肽提供参考。

中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4产酶条件及部分酶学性质

采用稀释平板分离法从土壤中分离到一株产中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4.通过单因素碳、氮源以及正交试验确定了最佳产酶培养基配方,同时还研究了起始pH值、金属离子、接种量对产酶的影响以及温度、pH值、金属离子以及表面活性剂对酶稳定性的影响;以最佳培养基为发酵培养基,于37℃、160 r/min振荡培养48 h,酶活达2 519.35 U/mL;该酶最适作用温度为55℃,最适作用pH值为7.5,在pH 7.5缓冲体系中,55℃反应60 min后仍有50%的酶活力.Ca2+和表面活性剂对酶有一定的激活作用,但激活作用不明显.

枯草芽孢杆菌ZC-7中性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

枯草芽孢杆菌ZC-7的发酵液,经离心分离得到粗酶液,再经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、SephadexG-75柱层析等步骤获得电泳纯的中性蛋白酶。SDS-PAGE测得其分子量大约为42kDa。以酪蛋白为底物时,该酶的Km为5×10-3,Vmax为2.5×104μg/min,酶的最适作用pH为7.0,最适反应温度为55℃,在pH6.5～8.0,40℃以下较稳定,对1mol/Lh2O2具有一定的耐受性。EDTA、异丙醇和乙醇对该酶有抑制作用,Ca2+、Mg2+和Li+离子对其具有保护作用。

枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化

对1株枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵培养基以及发酵条件进行了优化,最终确定了摇瓶最佳发酵培养基为:甘油40 g/L、豆粕粉30 g/L、麸皮10 g/L、Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L。摇床最佳发酵条件为:温度30℃、转速250 r/min、接种量体积分数6%,在此发酵条件下,酶活达到6 082.7 U/m L,发酵强度为56 U/(m L·h)。在15 L发酵罐进行了初步验证,通过流加甘油分批发酵,在第25h酶活达到最大值,为11 871 U/m L。

枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的特性及补料研究

采用分离纯化的枯草芽孢杆菌进行产中性蛋白酶的研究,结果表明:适宜的碳源和氮源分别为玉米粉和豆粕粉;磷酸盐能提高酶产量;未添加Na2HPO4和KH2PO4的情况下,Ca2+和Mg2+对产酶都有抑制作用;Na2HPO4和KH2PO4存在时,1 mmol/L的Ca2+和Mg2+能使酶产量分别提高12%和8%,随着离子浓度的增加,产酶受到抑制;采用在11 h、18 h和24 h分别补加10 g/L玉米粉和7.5 g/L豆粕粉的补加策略,产量提高了96%,生产强度提高了112%。

中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备花生短肽的研究

【目的】为了充分利用花生榨油之后的副产物,提高产品附加值,建立花生短肽制备工艺,研发功能性花生短肽产品。【方法】通过比较酶种类、底物浓度、酶解温度、酶解时间对水解度与短肽得率的影响,采用二次回归正交旋转组合设计优化分步酶解制备花生短肽的最佳工艺。【结果】中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备短肽的最佳工艺参数为:Neutrase水解花生分离蛋白2.04 h后加入Protamex继续酶解1.96 h,Neutrase添加量为5 200 U·g-1底物,Protamex添加量为422.32 U·g-1底物,水解温度44.83℃,底物浓度8%,在此条件下,短肽得率为83.93%,水解度为38.25%,花生短肽纯度为93.85%±0.44%。经高效液相色谱测定,分子量小于1 000 D的水解产物占98.88%。【结论】采用Neutrase与Protamex分步酶解花生分离蛋白制备花生短肽,与现有碱性蛋白酶酶解制备花生短肽方法相比,避免了后续脱盐步骤,简化了工艺,且具有制备条件温和,DH和TCA-NSI高,纯度高,分子量集中分布于1 000 D以下等特点。

中性蛋白酶对壳聚糖的降解

用粘度测定法和还原糖测定法，研究了中性蛋白酶非专一性降解壳聚糖过程中温度、ｐＨ 值、反应时间、酶浓度、底物浓度、金属离子及壳聚糖的脱乙酰度对中性蛋白酶降解壳聚糖反应速度的影响，确定了以壳聚糖为底物的中性蛋白酶的一些催化特性：最适温度为５０ ℃；最适ｐＨ 值为６ ．０ ；米氏常数 Ｋｍ 值为１ ．１ ×１０ － ２ ｇ／ ｍＬ；一定浓度的Ｃｕ２ ＋ 、Ｂａ２ ＋ 、Ｍｎ２ ＋ 抑制该酶的活性；ＩＣＨ２ ＣＯＯＨ 是激活剂。随着壳聚糖脱乙酰度的提高，降解速度降低。

无鱼粉低磷饲料中添加中性蛋白酶和植酸酶对建鲤生长及营养物质利用的影响

在无鱼粉低磷饲料中添加中性蛋白酶、中性植酸酶,考察对建鲤(Cyprinus carpio var.Jian)生长、营养物质消化率和沉积率、血浆生化指标及肠道组织学的影响。配制含鱼粉5%和磷酸二氢钙1.5%的正对照饲料、无鱼粉饲料、无鱼粉低磷饲料(磷酸二氢钙1.0%)和在无鱼粉饲料中添加175 mg/kg蛋白酶,在无鱼粉低磷饲料中添加175 mg/kg蛋白酶+300 mg/kg植酸酶的5组等蛋白饲料,饲喂初始体重为(52.5±2.0)g的建鲤10周。结果表明:对照组具有最高增重率和最低饲料系数(P<0.05),无鱼粉饲料和无鱼粉低磷饲料组的增重率、蛋白质和磷沉积率、蛋白质和钙消化率均显著下降(P<0.05);在无鱼粉饲料中添加蛋白酶后,提高了建鲤增重率13.1%(P<0.05),达到和对照组基本一致的水平;显著提高了蛋白质、钙消化率和肠绒毛高度,降低了饲料系数(P<0.05);在无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶和植酸酶后,显著提高了脂肪、蛋白质、磷沉积率和蛋白质、钙、磷消化率(P<0.05),增加了前肠绒毛长度和隐窝深度(P<0.05),提高了血浆磷浓度(P<0.05)。以上结果表明,在全植物性蛋白饲料中添加蛋白酶,在全植物蛋白的低磷饲料中同时添加蛋白酶和植酸酶可以促进建鲤生长,提高对营养物质的消化率和沉积率,促进肠道生长发育。

枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

将编码枯草芽孢杆菌AS1.398 的中性蛋白酶功能区和包含前导区序列(“pro”序列)在内的全长基因克隆到酵母整合型质粒pPIC9K中,电转化His4 缺陷型巴斯德毕赤酵母SMD1168,通过MD-G418平板、PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDS-PAGE分析和酶活测定表明,枯草芽孢杆菌AS1.398的全长中性蛋白酶基因在毕赤酵母中获得了高效表达,表达产物分泌至培养基中,分子量约为43kD。经甲醇诱导培养后,发酵液中的中性蛋白酶活力达20000 U/mL。

响应面试验优化中性蛋白酶辅助提取青稞淀粉工艺

采用中性蛋白酶辅助提取青稞淀粉,研究料液比、加酶量、酶解时间、酶解温度和p H值对青稞淀粉中蛋白残留量的影响,选择加酶量、酶解时间、酶解温度为影响因素进行响应面优化试验。以淀粉蛋白残留量和淀粉提取率为评价指标,确定最佳提取工艺条件。结果表明,加酶量、酶解温度、酶解时间、加酶量与酶解温度的交互作用及加酶量与酶解时间的交互作用对淀粉蛋白残留量有极显著影响,而对淀粉提取率无显著影响。实验范围内得到的最佳提取工艺条件为加酶量140.79 U/g、酶解温度45.01℃、酶解时间2.57 h,在此条件下青稞淀粉的提取率为60.36%,淀粉蛋白残留量为1.31%。