基于串联质谱标签的蛋白质组学联合高内涵筛选技术筛选胃癌相关基因的研究

目的:应用Tandem mass tag(TMT)技术联合高内涵筛选(HCS)寻找潜在的胃癌相关基因。方法:利用TMT技术从胃癌及癌旁组织中筛选差异表达蛋白质,应用GO和KEGG数据库进行注释和信号通路富集并结合PubMed数据库结果,筛选出胃癌中未见或较少报道的上调目的基因。通过shRNA技术敲减基因,HCS技术比较敲减对细胞增殖的影响,筛选出肿瘤增殖相关基因并通过检测mRNA含量、克隆形成和CCK8进行验证。结果:通过TMT从胃癌和癌旁组织定量到差异表达蛋白1008个(上调649个,下调359个),25个目的基因敲减后HCS结果显示SF3B4敲减抑制细胞增殖,验证发现SF3B4是潜在的胃癌细胞增殖相关基因。结论:TMT技术结合HCS为肿瘤相关基因的筛选提供新的可能性。本研究提示SF3B4是潜在的胃癌增殖相关基因,为研究胃癌发生机制提供新线索。

基于串联质谱标签的蛋白质组学技术分析海水流化冰辅助保鲜对大黄鱼肌肉蛋白质的影响

为研究大黄鱼(Larimichthys crocea)蛋白质在海水流化冰辅助保鲜期内的变化,采用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)技术定量标记新鲜(贮藏0 d)大黄鱼及不同海水流化冰贮藏时间(7、23 d)下大黄鱼的肌肉蛋白质,筛选出不同贮藏时间下的差异表达蛋白,并对差异蛋白进行基因本体(gene ontology,GO)、直系同源簇/真核生物直系同源簇(clusters of orthologous groups/clusters of eukaryotic orthologous groups,COG/KOG)与京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析。结果显示,在3个比较组(7 d vs 0 d、23 d vs 7 d和23 d vs 0 d)中鉴定到的差异蛋白总数分别为215、133、269个,其中表达上调的差异蛋白数分别为117、37、113个,表达下调的差异蛋白数分别为98、96、156个。同时,3个比较组的共有差异蛋白为44个。GO分析表明,差异蛋白主要参与细胞过程、生物调节、细胞和细胞内组分、结合功能和催化活性等方面;COG/KOG分析表明,差异蛋白的功能活性主要集中在细胞骨架、碳水化合物转运和代谢、信号转导机制以及翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣蛋白等方面;KEGG分析表明,差异蛋白共参与38条信号通路,且在贮藏后期(23 d),紧密连接和致病性大肠埃希菌感染2条信号通路中差异蛋白的参与数目最多,它们可能是造成大黄鱼新鲜度急剧下降的主要信号通路。44个共有差异蛋白与大黄鱼新鲜度指标进行的相关性分析表明,脆性X智力低下综合征相关蛋白2、肌醇-1-单磷酸酶、Rho GDP解离抑制剂1、锚蛋白-1和甲基四氢叶酸合酶结构域蛋白可以作为新鲜度指示蛋白。本研究为揭示大黄鱼在海水流化冰贮藏期内的品质变化机制、大黄鱼新鲜度评价和保鲜工艺改进提供了依据。

肌萎缩侧索硬化患者的脑脊液存在差异表达蛋白:基于串联质谱标签方法

目的基于串联质谱标签(TMT)技术,从蛋白质组学层面研究肌萎缩侧索硬化(ALS)患者脑脊液(CSF)中的差异性表达蛋白,探讨ALS发病的机制和相关作用途径。方法选取2017年11月～2018年4月于中国人民解放军联勤保障部队第928医院和中南大学湘雅医院神经内科就诊5例延髓起病ALS患者和5例肢体起病ALS患者,以5例偏头痛及低颅压头痛的患者为健康对照,分别获取CSF,利用串联质谱标签(TMT)技术鉴定CSF中差异性蛋白质,并进行生物信息学分析。结果共鉴定并定量1530种蛋白。延髓起病ALS患者中48种蛋白表达上调,6种蛋白表达下调;肢体起病ALS患者中16种蛋白表达上调,19种蛋白表达下调。GO分析显示这些蛋白均参与细胞生理过程、单器官过程和生物调节等过程,在细胞内和细胞外均有分布,且具有结合功能、催化活性和受体活性等。KEGG通路分析显示,延髓起病ALS患者CSF中上调蛋白参与溶酶体和代谢等3条通路。肢体起病ALS患者CSF中下调蛋白参与补体和凝血级联途径、金黄色葡萄球菌感染和单纯疱疹感染等7条通路,各通路均包含补体成分。结论延髓起病和肢体起病的ALS患者CSF中均存在差异性表达蛋白。溶酶体通路参与延髓起病ALS的发生和发展,免疫反应参与肢体起病ALS的发生和发展。

基于串联质谱标签定量蛋白质组学技术的芍甘附子汤治疗类风湿关节炎作用机制研究

目的采用串联质谱标签(TMT)定量蛋白质组学技术探讨芍甘附子汤治疗类风湿关节炎(RA)的作用机制。方法建立牛Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠模型,将造模成功的大鼠分为模型组和芍甘附子汤组(2.1 g·kg^(-1)),并设置正常组,每组16只。首次免疫3周后,芍甘附子汤组予芍甘附子汤2.1 g·kg^(-1)灌胃,模型组和正常组予等量生理盐水,每日1次,连续28 d。于首次免疫前(d 0)及免疫后d 7、d 14、d 21、d 28、d 35、d 42、d 49测定足跖体积并计算肿胀度,于d 14、d 21、d 28、d 35、d 42、d 49进行关节炎指数(AI)评分。末次给药24 h后,麻醉大鼠,取膝关节滑膜组织,采用TMT蛋白质组学技术筛选各组间滑膜组织差异蛋白质,基因本体论(GO)对差异蛋白质进行功能注释,京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库对差异蛋白质所涉及的信号通路进行分析。结果与正常组相比,模型组大鼠足跖出现明显肿胀(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,芍甘附子汤组大鼠足跖肿胀度和AI明显下降(P<0.05,P<0.01)。与正常组比较,模型组鉴定出白细胞介素1受体辅助蛋白b(IL1RAP)、神经细胞黏附分子-接触蛋白-1(Cntn1)、衣被蛋白复合物ζ亚基(Copz1)等85个差异表达蛋白;与模型组相比,芍甘附子汤组鉴定出IL1RAP、组织蛋白酶L1(Ctsl)、1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶ABHD5(ABHD5)等49个差异表达蛋白;GO富集分析表明差异蛋白质主要涉及催化、结合活性等45个分子功能(MF),脂质代谢、信号传递等104个生物学过程(BP),细胞膜、细胞器和大分子复合物等23个细胞组分(CC);KEGG分析表明差异蛋白质主要涉及TGF-β信号通路、Apelin信号通路等18条信号通路。结论芍甘附子汤对CIA大鼠滑膜的49个蛋白具有调节作用,其治疗RA的机制可能主要与下调IL1RAP、Ctsl,上调ABHD5表达有关。

丹酚酸A对缺血性脑卒中模型大鼠海马区蛋白影响的串联质谱标签蛋白组学分析

背景:丹酚酸A对缺血性脑卒中后缺血侧海马区蛋白表达的影响及其作用机制尚未明确。目的:观察丹酚酸A对缺血性脑卒中大鼠海马区蛋白差异表达的影响,探讨其可能的神经保护机制。方法:采用改良Longa方法制备缺血性脑卒中大鼠模型,造模后随机分为生理盐水组与丹酚酸A组(n=6)。丹酚酸A组于线栓拔出后尾静脉注射2 mg/kg丹酚酸A;生理盐水组注射等体积的生理盐水。采用改良神经功能缺损评分标准评价大鼠神经功能;T2加权成像检测脑梗死体积;旷场实验及Morris水迷宫测试观察各组大鼠的自主行为、学习记忆能力;串联质谱标签定量蛋白组学技术分析缺血性脑卒中模型大鼠缺血侧海马区蛋白的差异表达。结果与结论:①与生理盐水组相比,丹酚酸A组大鼠改良神经功能缺损评分显著降低;②T2加权成像显示,丹酚酸A组较生理盐水组脑梗死体积明显减少;③旷场实验结果发现,丹酚酸A组大鼠自主活动及自由探索行为表现更佳;④Morris水迷宫测试结果表明,丹酚酸A组大鼠在定向航行实验中逃避潜伏期明显缩短、穿越平台次数相较于生理盐水组显著增加;⑤缺血侧海马区差异蛋白质分析结果发现,丹酚酸A组与生理盐水组之间筛选出50个上调及3个下调差异蛋白;基因本体论分析表明它们主要参与binding,catalytic activity等分子功能;京都基因和基因组百科全书信号通路分析显示,它们主要涉及Complement and coagulation cascades,Staphylococus aureus infection等信号通路;⑥结果显示,丹酚酸A可能通过调控缺血性脑卒中大鼠缺血侧海马区差异蛋白、补体及凝血级联信号通路,对缺血性脑卒中大鼠发挥神经保护作用。

基于串联质量标签定量质谱法的胶质瘤外泌体蛋白组差异分析

为筛选胶质瘤外泌体中参与肿瘤迁移的差异蛋白,寻找可能抑制肿瘤细胞迁移的作用靶点.本试验分别对具有不同迁移能力的A172、U251胶质瘤细胞系培养上清液进行了差异性探究.结果显示,A172条件培养基具有更强的迁移促进作用,而外泌体为促进肿瘤迁移的主要成分.随后利用串联质量标签(tandem mass tag,TMT)定量质谱法对其外泌体进行的蛋白质组学分析发现,差异蛋白(倍数改变≥2)主要富集于核糖体、间隙连接、泛素介导的蛋白降解三个KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信号通路.通过分析共获得了50种具有显著表达差异的外泌体蛋白,可作为胶质瘤的外泌体检测标志物及抑制肿瘤细胞迁移的潜在作用靶点.

基于串联质谱标签法和平行反应监测技术的氟喹诺酮耐药沙门菌蛋白质组学分析

【背景】随着沙门菌对氟喹诺酮类药物的耐药性不断增强,对其耐药机理的研究显得尤为迫切和重要,蛋白质组学分析将为沙门菌的耐药机理研究提供新的靶点和方向。【目的】对鼠伤寒沙门菌诱导获得耐药性前后进行蛋白质组学分析,为深入研究沙门菌耐药机理奠定基础。【方法】用环丙沙星对鼠伤寒沙门菌ATCC13311进行耐药性诱导,利用串联质谱标签法(Tandem mass tag,TMT)对其耐药性进行差异蛋白的筛选和生物信息学分析,并选取15个差异蛋白进行平行反应监测(Parallel reaction monitoring,PRM)靶向蛋白验证。【结果】筛选出318个差异表达蛋白,其中上调159个,下调159个,涉及的KEGG通路主要包括细菌趋药性、ABC转运蛋白、双组分系统等;PRM定量到13个验证蛋白且变化趋势与TMT一致。【结论】通过TMT定量结合PRM靶向验证对鼠伤寒沙门菌耐药前后进行蛋白质组学分析,筛选出多个差异蛋白和代谢通路,包括外排泵相关蛋白、外膜蛋白、双组分相关蛋白及通路、细菌趋化性相关蛋白及通路等,为沙门菌氟喹诺酮类耐药机理的深入研究奠定了基础。

基于串联质谱标签定量蛋白质组学技术筛选糖尿病足皮肤抗菌肽的可行性和价值

目的:探讨基于定量蛋白质组学串联质谱标签(TMT)技术筛选糖尿病足皮肤抗菌肽的可行性和价值。方法:收集2017年4月至2018年12月在东南大学附属中大医院行清创手术的糖尿病足患者的下肢溃疡周围皮肤全层和同期行其他手术非糖尿病患者的下肢皮肤全层标本各3例患者标本。利用TMT技术分别对上述标本进行蛋白组学分析,筛选出发生显著变化的差异蛋白。搜索UniProt-GOA数据库对鉴定到的差异蛋白生物学作用阐释。以鉴定到的蛋白为背景,利用Fisher精确检验法评价差异表达蛋白。利用InterPro数据库分析差异表达蛋白功能结构域的富集情况。结果:共发现133个差异蛋白,其中表达上调和下调的蛋白分别为101个和32个。基因本体(GO)富集分析表明,在蛋白生物学过程中最显著富集的过程为对细菌的防御过程,其次为抗菌体液反应过程。共有19个蛋白涉及对细菌的防御反应过程,其中18个蛋白发生了上调,1个蛋白发生了下调。差异蛋白上调倍数达4倍以上的共有8个,分别为蛋白为溶菌酶C、中性粒细胞弹性蛋白酶、杀菌渗透性增加蛋白、乳铁蛋白、膜相关磷脂酶A2、肽聚糖识别蛋白1、免疫球蛋白J链和蛋白S100-A12。共有8个蛋白涉及抗菌体液反应过程,其中7个蛋白与对细菌的防御反应中涉及的蛋白重叠。通过蛋白互作分析显示,差异表达的抗菌反应蛋白形成了一个包含14个节点和34条边的复杂调控网络,平均节点度为4.86,聚类系数为0.652。结论:通过TMT标记蛋白组学技术发现,参与对细菌的防御反应及抗菌体液免疫反应的差异蛋白,如溶菌酶C、中性粒细胞弹性蛋白酶、杀菌渗透性增加蛋白、乳铁蛋白、膜相关磷脂酶A2、肽聚糖识别蛋白1、免疫球蛋白J链和蛋白S100-A12,有望成为治疗糖尿病足感染的新靶点。

人胃上皮细胞系GES-1在不同pH环境下的串联质谱标签定量蛋白质组学分析

胃是人体重要的消化器官,胃部环境pH改变可能引发多种疾病。本研究探究了不同pH环境对胃上皮细胞系GES-1蛋白质组的影响。将GES-1放置在酸性(pH 6.8)、碱性(pH 9.4)和对照(pH 7.4)培养基中,培养7 d后收集细胞沉淀,进行串联质谱标签(tandem mass tags,TMT)定量蛋白质组学测序,选择差异表达蛋白进行KEGG富集分析。结果表明,胃上皮细胞GES-1最适生长pH为7.4,在强碱环境(pH 9.4)中细胞能保持较好的状态,在弱酸环境(pH 6.8)中难以维持正常细胞形态。与对照组相比,136个蛋白在酸性(pH 6.8)样品中显著差异表达,其中96个蛋白上调,40个蛋白下调。KEGG富集结果显示,差异蛋白与胆汁分泌、丙酮酸代谢、抗原加工呈递、铁死亡等103个生物学过程相关;与对照组相比,15个蛋白在碱性(pH 9.4)样品中显著上调,1个蛋白显著下调,差异蛋白被富集到47个生物学过程,包括霍乱弧菌感染、补体与凝血级联、内质网中的蛋白质加工、蛋白质输出等。本研究揭示了GES-1细胞响应pH环境改变的蛋白质组特点,为探究因环境pH变化引发的胃部病变提供了新的思路。

基于串联质谱标签定量蛋白质组学筛选胸主动脉瘤/夹层蛋白质标志物

目的通过串联质谱标签(tandem mass tag.TMT)定量蛋白质组学分析胸主动脉瘤患者及动脉瘤基础上并发StanfordA型主动脉夹层的患者,与正常人群主动脉管壁的差异表达蛋白,筛选出与胸主动脉瘤/夹层中膜退行性病变密切相关的蛋白标志物。方法收集2019年12月至2020年5月四川大学华西医院心脏移植捐献者[正常组,年龄(40.50±9.31)岁]、升主动脉瘤患者[动脉瘤组,年龄(56.50±8.19)岁]及动脉瘤基础上并发Stanford A型主动脉夹层患者[夹层组,年龄(54.17±6.68)岁]的升主动脉组织样本各6例,均为男性。采用TMT.定量蛋白质谱技术,筛选出动脉瘤组和夹层组与正常组之间具有显著表达差异(差异倍数≥1.50或≤0.67)的蛋白质,通过GO和KEGG功能富集分析探讨潜在的信号通路机制。结果相比正常组,动脉瘤组和夹层组均有表达且具有显著差异的蛋白质共63个,其中发生上调的蛋白质有30个,下调的蛋白质有33个。基于GO富集分析及KEGG通路分析,筛选出动脉瘤及夹层组的3条共同差异代谢通路,分别为过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路.细胞外基质受体相互作用(extracellular matrix receptor interaction)信号通路以及补体和凝血级联(complement and coagulation cascades)信号通路。结论本研究筛选了在胸主动脉瘤/夹层发生发展过程中具有潜在重要作用的63个差异蛋白质及3条差异代谢通路.为搜寻调控胸主动脉瘤/夹层中膜退行性病变过程中的关键分子靶标提供了依据。

肉芽肿性乳腺炎病灶组织差异表达蛋白质筛选及关键分子验证

目的分析肉芽肿性小叶性乳腺炎(GLM)病灶组织中的差异表达蛋白质,筛选GLM的生物标志物,再根据结果对关键分子进行验证。方法采用TMT标记定量蛋白质组学方法,对GLM患者(3例)病灶与正常乳腺组织中蛋白质组进行鉴定和定量,筛选出发生显著变化的差异表达蛋白质,导入Proteome Discoverer软件中,搜索Uniprot数据库,完成生物信息学分析。采用细胞因子抗体芯片技术对筛选出的关键分子进行定量和验证。结果GLM病灶组织与正常乳腺组织筛选出差异表达蛋白质1405个,其中1106个表达上调,299个表达下调。GO富集分析显示,这些差异表达蛋白质主要参与细胞过程、代谢过程、蛋白质代谢、生物学调节等。KEGG通路分析发现,差异表达蛋白质参与补体活化、免疫调节、炎症反应等。细胞因子定量分析验证了GLM病灶组织中IL-1β、MCP2、IL-6表达升高。结论GLM病灶和正常乳腺组织中存在差异表达的蛋白质参与炎症、免疫等多种信号通路,可能是GLM发生发展的关键分子。特定蛋白质是值得进一步研究的生物标志物。

基于TMT定量蛋白质组学技术筛选贝赫切特病血清差异蛋白

贝赫切特病(Behcet’s disease,BD)又称白塞病,是一种自身免疫性疾病,地中海、东亚等地区高发[1]。复发性口腔溃疡、生殖器溃疡和眼部病变,是BD经典的“三联征”,除此以外,还可累及多个系统,如消化道、心血管系统等[2]。BD的基本病理改变是血管炎,表现为血管内皮细胞损伤,血栓形成,血管壁和周围组织炎症细胞浸润等[3],动静脉均可受累,预后差,致死率高[4]。由于缺乏特异性血清标志物,BD的诊断主要依靠其临床表现,当患者症状不典型时,极易漏诊、误诊;因此,筛选和鉴定BD特异的血清分子标志物是BD研究的热点。

发育性颈椎管狭窄人群血清差异蛋白质组学分析

背景:正常健康人与发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群之间的血清特异性生物学标志物尚未完全明确。目的:寻找并鉴定气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄的潜在生物学标志物。方法:分别采集发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群血清9例、健康正常人群血清8例,采用同位素相对标记与绝对定量技术串联质谱标签联合液相色谱-串联质谱筛选2组人群血清的差异蛋白及鉴定,使用Western Blot法对肌球蛋白轻链3(MYL3)差异蛋白进行验证。结果与结论:(1)串联质谱标签技术:共鉴定出61个差异蛋白(P <0.05),其中与健康正常人群组比,补体成分C1q受体、载脂蛋白A4、C-C基序趋化因子配体18等14种差异蛋白明显上调,而肌球蛋白轻链3、线粒体翻译延伸因子、核仁磷酸蛋白1等47种差异蛋白明显下调;(2)基因富集分析:这些差异蛋白可能参与染色体组织、线粒体膜组织、肌肉系统过程的调节等分子功能;(3)蛋白相互作用网络分析:健康正常人群与发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群之间的共同差异蛋白中补体C1q受体、载脂蛋白A4、C-C基序趋化因子配体18、肌球蛋白轻链3、线粒体翻译延伸因子、核仁磷酸蛋白1等38种位于功能网络节点,且与颈椎骨能量代谢、骨细胞产生、破骨细胞的形成等系统关系密切;(4)运用Western Blot法对主要差异蛋白肌球蛋白轻链3进行验证:其验证结果与蛋白组学结果相一致;(5)结论:通过绝对定量技术联合液相色谱-串联质谱技术发现健康正常人群与发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群之间的血清差异表达蛋白,并初步推测肌球蛋白轻链3可能是发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群的特异性血清标志物。

葛根素调控CENPA抑制膀胱癌细胞增殖的机制研究

目的:探索葛根素抑制膀胱癌(bladder cancer,BLCA)T24及5637细胞系的作用机制。方法:利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测法证实葛根素抑制BLCA T24及5637细胞的能力。通过串联质谱标签(Tandem Mass Tags,TMT)技术获得差异表达蛋白列表,并进行功能富集分析。通过生物信息分析筛选关键蛋白并对其进行表达分析、生存分析和上游转录因子预测。分子对接及Western blotting实验用于上游转录因子的验证。结果:CCK-8检测结果显示葛根素对T24和5637细胞系的IC 50分别为218μmol·L^(-1)和198μmol·L^(-1)。功能富集分析显示差异表达蛋白主要富集在细胞周期和DNA复制通路。筛选出的关键蛋白为CDK1、CCNB1和PLK1。CHEA3网站预测关键蛋白上游转录因子为着丝粒蛋A(centromere protein A,CENPA。分子对接显示葛根素与CENPA的结合能为-6.3 kcal·mol^(-1)(1 cal=4.1840 J),Western blotting显示葛根素可显著降低CENPA的表达。结论:葛根素可能通过抑制CENPA的表达来影响蛋白CCNB1和PLK1,从而调控BLCA细胞的细胞周期或DNA复制以抑制其增殖。

静脉注射利多卡因后差异蛋白质的蛋白质组学分析

目的利用蛋白质组学技术定量分析静脉注射利多卡因(IVL)前后血清中差异蛋白质的表达。方法选取健康志愿者5例,IVL 1.5 mg·kg^(-1)后再以3 mg·(kg·h)^(-1)持续泵注30 min。IVL前和IVL后1 h各采集静脉血5 mL,通过串联质谱标记及高效液相色谱分离技术鉴定IVL后差异表达蛋白,并采用京都基因和基因组百科全书(KEGG)和基因本体论(GO)数据库分析鉴定差异蛋白的生物学信息。结果检测到IVL前后的血清中差异蛋白共15种,其中上调蛋白6种、下调蛋白9种。GO分析发现,大部分差异蛋白参与了细胞进程;亚细胞结构定位发现多数差异蛋白定位于细胞外区域及细胞质;功能富集分析发现多数蛋白参与炎性反应调节、B细胞的活化调控和蛋白质加工。上调蛋白组KEGG通路富集到p53信号通路。通过对上调组和下调组差异蛋白分析,发现差异蛋白依托泊苷诱导的2.4号蛋白(EI24)参与p53信号通路且调控钙离子浓度。结论IVL可能通过调控依托泊苷诱导的EI24和上池蛋白(SBSN)抑制肿瘤细胞的发生与发展;EI24可能通过调控细胞内钙离子浓度参与IVL产生的镇静作用。

应用TMT结合质谱技术筛选高原红细胞增多症患者血浆差异表达蛋白

目的:应用串联质谱标签(TMT)结合质谱技术比较高原红细胞增多症(HAPC)患者和健康对照者血浆中的差异表达蛋白。方法:收集HAPC患者血浆4例,与之相匹配的健康对照组血浆5例,组内等量混合后利用多重免疫亲和层析柱去除14种高丰度蛋白,TMT试剂标记后样本进行液相色谱分离,采用HPLC-MS/MS质谱鉴定及相对定量;获取HAPC患者和健康对照血浆各20例,ELISA方法验证部分筛选的差异蛋白。结果:共鉴定和定量了1 094种蛋白,差异表达的蛋白有249种,其中HAPC组较健康对照组表达量≥1.5倍的上调蛋白质有162种,表达量≤67%的下调蛋白质有87种;C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A在HAPC组中较健康对照组表达量均上调(P<0.05)。结论:筛选出多种与炎症相关的差异表达蛋白,为深入研究HAPC发生机制奠定了良好基础。

基于TMT技术的激素性股骨头坏死硬化带修复模式探索及临床验证

背景:股骨头内硬化带是激素性股骨头坏死疾病发展过程中重要的影像学特征并与预后相关。过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α,PGC-1α)被证明具有成骨、促血管形成、抗线粒体凋亡等生物活性,与激素性股骨头坏死的骨修复可能存在紧密关联。目的:筛选激素性股骨头坏死硬化带区与正常区的差异蛋白,筛选出硬化带的关键蛋白,并验证关键蛋白在激素性股骨头坏死股骨头标本中的差异表达;探索激素性股骨头坏死硬化带修复模式。方法:取激素性股骨头坏死行人工全髋关节置换术取出的股骨头标本,通过串联质谱标签技术筛选硬化带区与正常区的差异表达基因,并进行GO与KEGG信号通路分析,构建关键靶点的蛋白互作网络、筛选关键基因。观察关键蛋白在激素性股骨头坏死硬化带中的表达,通过Western blotting、免疫组化验证关键蛋白在硬化带中的表达。结果与结论:①通过串联质谱标签定量蛋白质谱检测发现:相比于正常区骨组织,股骨头硬化带骨组织中具有显著差异表达(Log_(2)FC>1.20、Log_(2)FC<0.84和P<0.05)的蛋白质有609个,其中发生上调的蛋白质290个,发生下调的蛋白质319个;②通过GO与KEGG通路富集分析,发现在前10位的富集通路中,Wnt信号通路与生命周期调控通路与骨修复关系密切;在生命周期调控通道中,PGC-1α是重要的蛋白之一;③与激素性股骨头坏死标本正常区相比,Western blotting验证了PGC-1α、NRF-1在硬化带中低表达,Cleaved Caspase-3在硬化带中高表达;④光镜下免疫组化结果显示,股骨头组织标本中硬化区及正常区的PGC-1α、NRF1及Cleaved Caspase-3阳性染色分布,可以发现骨小梁、成骨细胞和骨髓均有表达存在;硬化带区Cleaved Caspase-3表达更为明显;⑤结论:激素性股骨头坏死硬化带中存在包含Wnt等成骨相关通路活跃、以PGC-1α低表达为特征的氧化凋亡活跃等生物学行为;PGC-1α在激素性股骨头坏死硬化带中低表达可能与氧化凋亡活跃相关。

宰后冷藏初期活性氧调控糖酵解对牛肉嫩度的影响

为探究宰后冷藏初期活性氧(reactive oxygen species,ROS)调控牛肉糖酵解途径的机制及其对嫩度的影响,分别以ROS激活剂过氧化氢(hydrogen peroxide,H_(2)O_(2))、ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)和生理盐水(对照)处理新鲜牛肉,在不同冷藏(4℃)时间(0.5、6、12、24、48 h)测定糖酵解水平和嫩度指标,并采用串联质谱标签(tandem mass tags,TMT)定量蛋白质组学技术对冷藏24 h的样品进行蛋白质鉴定与定量分析,筛选糖酵解通路中的差异表达蛋白。结果表明,H_(2)O_(2)处理组糖酵解水平显著提高,糖原分解量和乳酸积累量在宰后冷藏6~24 h显著高于其他两组(P<0.05),而NAC处理抑制了糖酵解进程。同时,H_(2)O_(2)处理组在12 h时达到极限p H值,分别比对照组和NAC组提前了12 h和36 h,并且H_(2)O_(2)处理组剪切力在12 h达到最大值,肌原纤维小片化指数在6~48 h内显著高于其他两组(P<0.05),表明较高的ROS水平通过提升糖酵解能力加快了牛肉的嫩化进程。进一步利用TMT蛋白组学技术从冷藏24 h的H_(2)O_(2)处理组和对照组样品中筛选出糖酵解通路相关的8种上调蛋白和2种下调蛋白,其中以磷酸甘油酸变位酶、2-磷酸-D-甘油酸水解酶、丙酮酸脱氢酶E1亚基β为核心的上调蛋白与下调的丙酮酸脱氢酶E1亚基α共同加快糖酵解进程。综上所述,宰后冷藏初期牛肉中的ROS可以调控糖酵解通路中关键蛋白质的表达,进而加速糖酵解水平,改善肉的嫩度。

基于高通量定量蛋白组学技术的全脂牛乳和脱脂牛乳蛋白组差异分析研究

蛋白质是牛乳中重要的营养成分,然而关于脱脂处理对牛乳蛋白含量的影响尚不清楚。本文采用串联质谱标签(Tandem Mass Tags,TMT)标记定量蛋白组学方法,对全脂牛乳和脱脂牛乳中全蛋白组进行分析,探究脱脂对牛乳蛋白的影响。全脂和脱脂牛乳中共鉴定出1352个蛋白,筛选出199个差异表达蛋白。与全脂牛乳相比,脱脂后有67个蛋白上调,132个蛋白下调。牛乳主要活性蛋白中,κ-酪蛋白在脱脂后相对含量降低,而β-乳球蛋白和乳铁蛋白在脱脂后相对含量升高,α-乳白蛋白、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、牛血清蛋白及乳过氧化物酶相对含量则无显著性差异。乳脂肪球膜蛋白中嗜乳脂蛋白和乳凝集素在脱脂后相对含量降低。脱脂对牛乳中骨架蛋白、代谢相关蛋白等也有影响,改变了牛乳品质及营养价值。通过对全脂和脱脂牛乳中蛋白质分析,明确了脱脂对牛乳蛋白的影响,可以为婴幼儿乳品开发及消费者购买不同脂肪含量的牛奶提供参考。

长日照条件下2个热带玉米自交系的蛋白质组学分析

【目的】对长日照条件下2个热带玉米自交系进行蛋白质组学分析,为揭示玉米在长日照下的开花分子调控机制提供理论依据。【方法】以光敏型(FT32)和光钝型(FQR273)热带玉米自交系为材料,利用串联质谱标签(TMT)技术筛选差异蛋白,并对其进行GO功能注释及KEGG信号通路富集分析,构建蛋白间的相互作用网络。【结果】从长日照条件下FT32和FQR273热带玉米自交系4叶期叶片样品鉴定出6082个有效蛋白,其中显著差异蛋白605个(107个上调表达,498个下调表达)。605个差异蛋白注释到生物学过程、细胞组分和分子功能三大类,共79个条目,其中在生物学过程分类中,主要注释为翻译过程、谷胱甘肽代谢过程和蛋白质折叠;在细胞组分分类中,主要注释为膜整体组分、细胞质和叶绿体;在分子功能分类中,主要注释为ATP结合、金属离子结合和核糖体结构组成。有140个差异蛋白富集到13条KEGG信号通路,其中主要富集在次生代谢物生物合成、卟啉和叶绿素代谢和氨基酸生物合成。磷酸合成、核糖体代谢和翻译过程是玉米叶片在长日照条件下的关键途径。对被功能注释的196个蛋白进行归类和深入分析,根据生物学功能将其分为四大类,分别为活性氧(ROS)体内平衡(33个)、蛋白代谢(59个)、相关转移酶(25个)及其他功能(79个)。【结论】在长日照条件下,光敏型FT32玉米相对于光钝型FQR273的ROS体内平衡能力和蛋白代谢相关蛋白及相关转移酶活性均呈下调表达,其他功能蛋白种类繁多且功能复杂,以不同的方式发挥作用。即在长日照条件下,光敏感FT32玉米叶片以核糖体代谢和翻译过程为主的调控系统,维持玉米正常生长。