乌梅总黄酮对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中miR-145-3p/CREB5轴的影响

目的研究乌梅总黄酮(Fructus mume total flavone,FMF)对MPP^(+)诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞基因表达的影响。方法采用CCK-8筛选FMF及MPP^(+)作用于SH-SY5Y细胞的最佳浓度与时间。收集对照组、模型组(MPP^(+)诱导)和FMF组(MPP^(+)诱导+FMF干预)SH-SY5Y细胞,进行全基因转录组高通量测序,并筛选差异表达的miRNAs和mRNAs。通过生信软件分析miR-145-3p潜在靶基因,并与差异表达mRNAs相交取交集。将SH-SY5Y细胞分为6组:对照组、模型组、miR-145-3p mimics组、mimics NC组、miR-145-3p inhibitor组、inhibitor NC组。qRT-PCR检测细胞miR-145-3p表达水平,Western blot检测细胞CREB5蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因实验检测细胞荧光活性。结果对照组与模型组间比较,存在33个差异表达miRNAs,模型组与FMF组间比较,存在16个差异表达miRNAs,取交集后,得到7个差异表达的miRNAs,其中miR-145-3p在模型组下调,在FMF组上调。经分析获到4个miR-145-3p调控的差异靶基因:CREB5、EGLN1、NTNG1和SLC22A15。与对照组比较,模型组miR-145-3p表达水平显著降低,CREB5蛋白表达水平显著升高。与NC组比较,miR-145-3p mimics组miR-145-3p表达水平显著升高,CREB5蛋白表达水平显著降低,miR-145-3p inhibitor组miR-145-3p表达水平显著降低,CREB5蛋白表达水平显著升高。双荧光素酶报告基因结果显示miR-145-3p与CREB5存在靶向调控关系。结论miR-145-3p和CREB5均在MPP^(+)诱导的SH-SY5Y细胞中差异表达,FMF可调控miR-145-3p/CREB5轴在细胞中的表达水平。

乌梅总黄酮对MPP^(+)诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及机制

目的:研究乌梅总黄酮(Fructus mume,FMF)对1-甲基-4苯基吡啶离子(MPP^(+))诱导的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞损伤的修复作用,同时探讨其可能机制。方法:采用体外细胞培养的方法,MPP^(+)诱导损伤建立SH-SY5Y细胞模型,将细胞分为5组:正常对照组、模型组(250μmol/L MPP^(+))、FMF低(MPP^(+)+FMF 10μmol/L)、中(MPP^(+)+FMF 50μmol/L)和高(MPP^(+)+FMF 100μmol/L)剂量组。药物作用于细胞72 h后,用4,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染色法观察细胞凋亡的形态学改变,Annexin-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,流式细胞仪检测线粒体膜电位,蛋白质印迹法(Western Blot)检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达水平。结果:DAPI染色显示,MPP^(+)诱导损伤的SH-SY5Y细胞大部分胞质浓缩,细胞核体积缩小,呈典型的凋亡特征性形态;经FMF作用72 h后,细胞凋亡形态呈不同程度改善,细胞凋亡数量减少。与正常对照组相比,模型组细胞凋亡率、线粒体膜电位(ΔΨm)、Bax、Caspase-3蛋白表达水平均明显增高(P均<0.01);Bcl-2蛋白的表达水平及Bcl-2/Bax比值均显著下降(P均<0.01)。与模型组相比,FMF(10、50、100μmol/L)组SH-SY5Y细胞凋亡率显著降低(P均<0.01),ΔΨm有下降的趋势,中、高剂量组和模型组比较,差异有统计学意义(P均<0.01);FMF(10、50、100μmol/L)Bcl-2蛋白均有升高的趋势,中、高剂量组和模型组比较,差异有统计学意义(P均<0.01);FMF低、中、高剂量组Bax、Caspase-3蛋白显著降低(P均<0.01),Bcl-2/Bax比值显著升高(P均<0.01)。说明FMF能下调Bax、Caspase-3水平和升高Bcl-2/Bax比值,抑制MPP^(+)诱导的细胞凋亡。结论:FMF通过调控线粒体凋亡途径中相关蛋白表达进而改善MPP^(+)诱导的SH-SY5Y细胞损伤,发挥神经保护作用。

乌梅总黄酮对帕金森病大鼠脑线粒体呼吸链酶复合物影响

目的探讨乌梅总黄酮(FMF)对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病大鼠脑线粒体呼吸链酶复合物的活性及相关线粒体ND1、ND4基因及蛋白表达的影响。方法采用6-OHDA左侧纹状体注射建立帕金森病大鼠模型。大鼠随机分成假手术组,模型组,FMF高、中、低剂量治疗组,每组各10例。FMF高、中、低剂量组予以FMF灌胃给药,剂量分别为160、80、40 mg·kg^-1,假手术组及模型组大鼠接受等容积生理盐水干预。每日1次,连续给药4周。采用比色法检测各组大鼠脑线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性,采用RT-PCR检测编码线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ的ND1、ND4 mRNA,采用Western Blot法检测ND1、ND4蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠脑线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性明显降低(P<0.05);与模型组比较,FMF高剂量组大鼠脑线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ~Ⅳ活性明显改善,FMF中剂量组线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的活性也有不同程度的提高(P<0.05),FMF低剂量组线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ~Ⅳ活性无明显改变(P>0.05)。与假手术组比较,模型组ND1、ND4 mRNA及其蛋白的表达均显著下降(P<0.05);与模型组比较,FMF中、高剂量组均可提高ND1、ND4 mRNA及其蛋白的表达(P<0.05),其中以FMF高剂量组效果最为显著,而FMF低剂量组仅可提高ND4 mRNA的表达(P<0.05)。结论 FMF可能是通过影响线粒体呼吸链酶复合物的活性,提高线粒体ND1、ND4基因和蛋白的表达,防治帕金森病。

乌梅总黄酮通过线粒体自噬对帕金森病大鼠的保护作用

目的:考察乌梅总黄酮(Fructus Mume total flavone,FMF)对6-OHDA诱导帕金森病(Parkinson′s disease,PD)大鼠脑线粒体自噬的影响。方法:选择100只雄性SD大鼠,设假手术组15只,另外85只大鼠采用6-OHDA(5μg/μL)左侧纹状体注射制备PD大鼠模型。造模成功后将大鼠随机分成模型组,FMF低、中、高剂量组,每组15只。FMF低、中、高剂量组分别给予40、80、160 mg/kg FMF灌胃给药,假手术组及模型组给予相等容积生理盐水。干预4周,利用电镜观察大鼠脑组织线粒体形态、结构,采用比色法检测线粒体ATP酶活性,采用WB实验测定线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1、BNIP3的表达。结果:与假手术组相比,模型组大鼠脑组织线粒体明显肿胀,线粒体嵴断裂,部分溶解、消失,排列紊乱;Na^(+)-K^(+)-ATP酶、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶活力明显下降(P<0.05);LC3-Ⅱ、Beclin-1、BNIP3蛋白含量明显下降(P<0.05)。与模型组相比,FMF各剂量治疗组大鼠脑组织线粒体结构破坏呈剂量依赖性减轻,线粒体结构尚完整,部分线粒体稍肿胀,线粒体嵴排列较整齐,线粒体嵴的缺失较少,尤以高剂量组线粒体保护作用最明显。FMF各剂量组Na^(+)-K^(+)-ATP酶、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶活性明显提高(P<0.05),LC3-Ⅱ、Beclin-1、BNIP3蛋白含量明显升高(P<0.05)。结论:FMF能够显著修复6-OHDA诱导PD大鼠的脑线粒体功能损伤,FMF参与调控6-OHDA诱导的脑组织损伤中线粒体自噬水平,促进线粒体自噬。

乌梅总黄酮调控miR-145-3p表达对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用及其机制

目的:探讨乌梅总黄酮(FMF)调控微小RNA (miR)-145-3p对多巴胺能毒素1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用,并阐明其作用机制。方法:构建MPP+诱导帕金森病(PD) SH-SY5Y细胞模型,CCK-8法筛选MPP+和FMF最佳干预浓度和作用时间。将细胞分为对照组(未经处理)、模型组(500μmol·L^(-1)MPP+作用24 h)、MPP++mimics组(转染miR-145-3p mimics)、MPP++NC组(转染miR-145-3p NC)、MPP++FMF组(0.25 g·L^(-1)FMF作用24h)、 MPP++mimics+FMF组(转染miR-145-3pmimics后0.25g·L^(-1)FMF作用24h)和MPP++NC+FMF组(转染miR-145-3p NC后0.25 g·L-1FMF作用24 h)。CCK-8法检测各组细胞增殖能力,AnnexinⅤ-FITC/PI染色法检测各组细胞凋亡率,透射电镜观察各组细胞线粒体自噬超微结构表现,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组细胞中miR-145-3p表达水平,Western blotting法检测各组细胞中Beclin-1蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。结果:不同浓度MPP+作用SH-SY5Y细胞后,细胞增殖能力明显降低(P<0.01),PD细胞模型构建成功。MPP+最佳作用浓度和时间为500μmol·L^(-1)和24 h,FMF最佳干预浓度和作用时间为0.25 g·L^(-1)和24 h。CCK-8法检测,与对照组比较,模型组细胞增殖能力明显降低(P<0.01);与模型组比较,MPP++mimics组和MPP++FMF组细胞增殖能力均明显升高(P<0.01);与MPP++FMF组比较,MPP++mimics+FMF组细胞增殖能力明显升高(P<0.01)。AnnexinⅤ-FITC/PI染色法检测,与对照组比较,模型组细胞凋亡率明显升高(P<0.01);与模型组比较,MPP++mimics组和MPP++FMF组细胞凋亡率均明显降低(P<0.01);与MPP++FMF组比较,MPP++mimics+FMF组细胞凋亡率明显降低(P<0.01)。透射电镜观察,对照组细胞线粒体形态均匀,结构完整;模型组细胞线粒体体积变大,结构不规则,出现空化现象;与模型组比较,MPP++mimics组和MPP++FMF组细胞线粒体结构改善,自噬小体数量增加;与MPP++FMF组比较,MPP++mimics+FMF组细胞线粒体结构较为完整,自噬小体数量进一步增加。RT-qPCR法检测,与对照组比较,模型组细胞中miR-145-3p表达水平明显降低(P<0.01);与模型组比较,MPP++mimics组和MPP++FMF组细胞中miR-145-3p表达水平均明显升高(P<0.01);与MPP++FMF组比较,MPP++mimics+FMF组细胞中miR-145-3p表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法检测,与对照组比较,模型组细胞中Beclin-1蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均降低(P<0.05);与模型组比较,MPP++mimics组和MPP++FMF组细胞中Beclin-1蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显升高(P<0.01);与MPP++FMF组比较,MPP++mimics+FMF组细胞中Beclin-1蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显升高(P<0.01)。结论:FMF能够促进MPP+诱导的SH-SY5Y细胞自噬作用,减轻线粒体功能障碍,缓解MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤,其作用机制与上调miR-145-3p表达有关。

乌梅总黄酮对MPP^(+)诱导SH-SY5Y细胞线粒体损伤的保护作用

目的探讨乌梅总黄酮(FMF)对神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞建立的帕金森病(PD)细胞模型钙调蛋白激酶(CaMKKβ)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路的调控作用及对SH-SY5Y细胞线粒体功能的影响。方法250μmol/L MPP+作用于SH-SY5Y细胞24 h后,建立PD体外细胞模型,将细胞分为5组:对照组(只加SH-SY5Y细胞,不加药物)、模型组(250μmol/L MPP+孵育24 h)、FMF低剂量组(MPP^(+)+FMF 10μmol/L)、FMF中剂量组(MPP^(+)+FMF 50μmol/L)和FMF高剂量组(MPP^(+)+FMF 100μmol/L)。CCK-8法检测细胞的存活率,JC-1染色检测线粒体膜电位(ΔΨm);Western blot检测CaMKKβ/AMPK信号通路相关CaMKKβ、AMPK及磷酸化CaMKKβ(p-CaMKK)、磷酸化AMPK(p-AMPK)表达水平。结果CCK-8检测结果显示,FMF预处理24 h后,FMF低、中、高剂量组MPP+损伤细胞的存活率均较模型组明显升高(P<0.05或P<0.01)。ΔΨm检测结果显示,与对照组相比,模型组细胞ΔΨm明显降低(P<0.001);与模型组相比,FMF低、中、高剂量组ΔΨm明显升高(P<0.001)。Western blot检测结果显示,与对照组比较,模型组p-CaMKKβ、p-AMPK表达水平均明显下降(P<0.01);与模型组比较,FMF低、中、高剂量组p-CaMKKβ、p-AMPK表达水平均明显上调(P<0.05或P<0.01)。FMF干预前、后各组间CaMKKβ、AMPK表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论FMF可减轻MPP+对SH-SYSY细胞的损伤,这种保护作用可能是通过激活CaMKKβ/AMPK通路,改善线粒体功能实现的。