乳腺癌干细胞相关信号通路和生物标志物的研究进展

乳腺癌患者死亡率较高的主要原因为放化疗耐药导致癌症复发与转移,研究发现,乳腺癌复发转移与乳腺癌干细胞的存在相关,肿瘤内的乳腺癌干细胞具有自我更新和分化能力,且对传统放化疗具有一定抵抗性。而乳腺癌干细胞相关的信号通路和生物标志物可为乳腺癌靶向治疗提供有力依据。目前已知乳腺癌干细胞与Wnt/β-catenin、Notch、NRF2、PI3K/AKT/mTOR和Hedgehog/Sonic Hedgehog等信号通路相关并有CD24、CD44、CD49、钙黏蛋白3、CD133、EpCAM、Erbb2/HER-2、CXCR1等标志物,这些标志物及信号通路有望用作生物标记,作为乳腺癌诊疗、复发进展及转移倾向性等方面的标志,但在未来研究中仍存在一定挑战。因此,综述与乳腺癌干细胞相关信号通路和生物标志物并进行展望,以期为乳腺癌治疗药物研究提供理论支持。

基于CD44/CD24和ALDH1对人乳腺癌干细胞分离鉴定的方法学研究

目的:通过分子、细胞实验、动物实验三方面研究分别从四类乳腺癌组织样本寻找分离和鉴定筛选乳腺癌干细胞的方法,旨在为乳腺癌干细胞的研究寻找确定的方法,为乳腺癌的治疗提供参考方向。方法:采用DocSense组织单细胞悬液制备方法从乳腺癌组织中获取原代乳腺癌单细胞用于细胞培养,通过采用CD44/CD24和乙醛脱氢酶1(ALDH1)抗体进行流式分选出CD44^(+)/CD24^(-/low)组、ALDH1+组及非干细胞表型CD44-/ALDH1-组的细胞群,分组后的细胞采用乳腺癌干细胞干性鉴定(微球克隆形成实验),MTT实验分别绘制Luminal A型,Luminal B型,HER-2+型,Basal-like型筛选出的CD44^(+)/CD24^(-/low)组、ALDH1+组和CD44-/ALDH1-组细胞生长曲线,最后采用裸鼠成瘤实验及剥离肿瘤组织病理切片采用苏木精-伊红法染色(HE染色)验证所分选出来细胞干性及组织为乳腺癌组织。结果:本研究利用组织单细胞消融技术、干细胞微球形成实验及流式细胞术,成功富集并筛选出4类分子亚型的8种乳腺癌肿瘤干细胞;通过肿瘤微球克隆形成实验、MTT实验鉴定出标记CD44^(+)/CD24^(-/low)、ALDH1+表型的乳腺癌干细胞侵袭性和增殖能力更强;裸鼠皮下荷瘤HE染色进一步证明CD44^(+)/CD24^(-/low)、ALDH1+表型的乳腺癌细胞成瘤能力更强、异质性更明显。结论:CD44^(+)/CD24^(-/low)组、ALDH1+组乳腺癌干细胞干性表达能力较强,可作为乳腺癌干细胞的鉴定和筛选的关键指标,为乳腺癌的治疗提供新的参考方向。

基于Nanog信号通路探究miR-328对乳腺癌干细胞分化及间质转化的作用机制

目的 基于Nanog信号通路探究miR-328对乳腺癌干细胞分化及间质转化的作用机制。方法 选取秦皇岛市第四医院10例乳腺癌患者癌组织标本与10例癌旁组织标本进行研究。人乳腺癌干细胞分为乳腺癌组(乳腺癌干细胞)、NC组(乳腺癌转染miR-328-NC)、模拟物组(转染miR-328 mimics)、抑制物组(转染miR-328 siRNA)。运用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-328、E-钙黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、波形蛋白(Vimentin),检测细胞克隆形成情况,噻唑蓝(MTT)检测增殖,Transwell检测侵袭及迁移能力,Western印迹检测信号转导与转录活化因子(STAT)3、p-STAT3、肿瘤干性相关蛋白(Nanog)蛋白表达。结果 miR-328在乳腺癌组织中表达水平显著低于在癌旁组织(P<0.05)。乳腺癌组与NC组各指标间差异无统计学意义(P<0.05);与乳腺癌组相比,miR-328模拟物组miR-328表达、E-cadherin mRNA表达明显升高,N-cadherin及Vimentin mRNA表达、细胞增殖率、克隆形成率、STAT3、p-STAT3、Nanog、MUC-1蛋白表达、侵袭及迁移数量明显降低(P<0.05),miR-328抑制物组miR-328、E-cadherin表达明显降低,N-cadherin及Vimentin表达、细胞增殖率、克隆形成率、STAT3、p-STAT3、Nanog、MUC-1蛋白表达、侵袭及迁移数量明显升高(P<0.05),STAT3/Nanog抑制剂组与模拟物组以上指标水平差异无统计学意义(P>0.05),STAT3/Nanog激活剂组与抑制物组以上指标水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 上调miR-328通过可以抑制Nanog通路,诱导乳腺癌干细胞分化并抑制其上皮间质转化。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1β对乳腺癌干细胞干性表达的调控

背景:研究表明,过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1β(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1beta,PGC-1β)通过PI3K/AKT/mTOR信号通路影响乳腺癌细胞的增殖、迁移及凋亡。而PGC-1β能否通过PI3K/AKT/mTOR信号通路影响乳腺癌干细胞的干性及其影响机制还不清楚。目的:探究PGC-1β对乳腺癌干细胞干性的影响及调控机制。方法:将PGC-1β空载体、过表达载体(Lv-PGC-1β)、干扰载体(Sh-PGC-1β)分别转染乳腺肿瘤MCF-7细胞,荧光显微镜观察转染效果;qRTPCR及Western blot验证慢病毒转染后PGC-1βmRNA和蛋白的相对表达。在干性培养基中分别培养未转染组、PGC-1β空载体组、PGC-1β过表达组及PGC-1β干扰组的MCF-7细胞使其成为乳腺癌干细胞,显微镜下观察并记录干细胞球体的形成过程,Western blot验证干性标志物(ABCG2、ALDH1、OCT4)、上皮-间充质转化标记物(E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Slug和ZEB1)及PI3K/AKT/mTOR通路核心蛋白的相对表达。结果与结论:①MCF-7贴壁细胞经干性培养基培养形成了折光性好、中间密度高的致密球干细胞;②乳腺癌干细胞干性蛋白的表达明显高于其贴壁细胞(P<0.01);③与未转染组、空载体组相比,PGC-1β过表达组乳腺癌干细胞的形成时间缩短,细胞球体数目增多、球体直径增大(P<0.01),而PGC-1β干扰组细胞球体数目减少、球体直径减小(P<0.01);④PGC-1β过表达组干性相关蛋白的表达高于未转染组、空载体组(P<0.01),上皮-间充质转化相关蛋白E-Cadherin表达低于未转染组、空载体组(P<0.01),而N-Cadherin、Vimentin、Slug和ZEB1的表达高于未转染组、空载体组(P<0.01);PI3K/AKT/mTOR相关蛋白及其磷酸化相关蛋白表达高于未转染组、空载体组(P<0.01),PGC-1β干扰组结果则与PGC-1β过表达组相反;⑤结果提示,PGC-1β能够通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路影响乳腺癌干细胞上皮-间充质转化,从而促进乳腺癌干细胞的形成及干性相关标志物的表达。

乳腺癌干细胞在乳腺癌内分泌治疗耐药中的作用研究进展

乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)是存在于乳腺癌组织中的数量很少、具有自我更新能力和产生异质性肿瘤细胞的细胞亚群。内分泌耐药是目前内分泌治疗应用的主要限制。现有研究表明,BCSCs在乳腺癌内分泌治疗耐药中发挥重要作用。本文就BCSCs在激素受体(hormone receptor,HR)阳性乳腺癌内分泌治疗耐药中的作用进行综述。

雌激素对乳腺癌干细胞增殖、自我更新的作用研究

目的探讨雌激素对乳腺癌干细胞(BCSC)增殖及自我更新的影响。方法以人乳腺癌细胞MCF-7培养BCSC,并采用细胞免疫荧光实验验证;用含0,1,5,10,20,100 nmol/L雌激素的完全培养基培养BCSC 0,24,48,72 h后,采用CCK-8法检测细胞增殖情况;用含0,10,20 nmol/L雌激素的完全培养基培养BCSC 24 h后,观察细胞形态并计算成球率;用含0,1,5,10 nmol/L雌激素的完全培养基培养BCSC 24 h后,采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)mRNA的表达情况。结果成功从MCF-7细胞中培养出BCSC。与0 nmol/L比较,1,5,10 nmol/L雌激素作用下,BCSC增殖能力显著增强(P<0.05),且与浓度和作用时间呈正相关;与0 nmol/L比较,10 nmol/L和20 nmol/L雌激素作用下,BCSC体积均显著增大,数量均显著增多(P<0.05);与0 nmol/L比较,1,5,10 nmol/L雌激素作用下,BCSC的PI3K,AKT,mTORmRNA表达水平均显著升高(P<0.05),且存在浓度依赖性。结论较低浓度(0~10 nmol/L)的雌激素具有促进BCSC生长的作用,其作用机制可能与活化PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

靶向治疗下乳腺癌干细胞发生发展动力学分析

为了研究靶向治疗下乳腺癌干细胞的生长情况,本文在Gompertzian生长模型基础上建立不同状态乳腺癌干细胞理论模型。考虑乳腺癌干细胞的增殖、死亡及特定肿瘤微环境对不同状态乳腺癌干细胞发生发展的影响,用非线性Hill函数描述乳腺癌干细胞对其自身生长速率的反馈,采用解析和数值方法研究不同状态乳腺癌干细胞发生发展。结果表明:在ka(dad0)=1处发生音叉分岔,ka(dad0)<1时无乳腺癌干细胞,ka(dad0)>1时存在乳腺癌干细胞;在乳腺癌干细胞靶向治疗期间,乳腺癌干细胞量急剧降低,并维持一段时间的休眠状态,最后随着疗效减弱,又回到稳定增殖水平;增加活跃状态乳腺癌干细胞的死亡率,可能延长乳腺癌干细胞处于休眠状态的时间。在不同状态的乳腺癌干细胞发生发展过程中,其增殖、死亡及特定肿瘤微环境均起着关键作用。还发现靶向治疗和肿瘤微环境的改变对抑制乳腺癌复发都有一定作用。

乳腺癌干细胞亚群中MMP-9和BRMS1的表达及其临床病理意义

目的探讨基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP-9)和乳腺癌转移抑制因子1(breast cancer metastasis sup-pressor 1,BRMS1)在乳腺癌干细胞侵袭转移中的作用。方法采用免疫磁珠法从MCF-7乳腺癌细胞中分选出CD44+CD24-和非CD44+CD24-两组细胞亚群,RT-PCR法检测CD44+CD24-、非CD44+CD24-及未分选组中ALDH1 mRNA的表达水平。采用Western blot法分别检测MMP-9、BRMS1在两组细胞亚群中的表达;采用Transwell检测CD44+CD24-、非CD44+CD24-及未分选组中细胞亚群的迁移及侵袭能力;采用免疫组化SP法检测65例乳腺癌中MMP-9、BRMS1及ALDH1蛋白的表达。其中乳腺癌伴淋巴结转移组40例,非转移组25例。结果 ALDH1 mRNA水平在CD44+CD24-细胞亚群中的表达明显高于未分选组及非CD44+CD24-组;CD44+CD24-细胞亚群迁移及侵袭能力均高于未分选组及非CD44+CD24-组(P<0.05);在分选出的CD44+CD24-细胞亚群中MMP-9和ALDH1的表达高于非CD44+CD24-细胞亚群,而BRMS1的表达低于非CD44+CD24-细胞亚群,两者差异均有显著性(P<0.05);MMP-9和ALDH1在乳腺癌伴淋巴结转移组中的表达高于非转移组,且两者表达呈正相关,BRMS1在乳腺癌伴淋巴结转移组中的表达低于非转移组,与MMP9及ALDH1的表达呈负相关(P<0.05)。结论 MMP-9和BRMS1在乳腺癌干细胞侵袭转移中可能发挥重要作用。

Let-7维持乳腺癌干细胞的特性及机制的研究

目的:研究let-7在乳腺癌干细胞中的表达,探索let-7影响乳腺癌干细胞的特性及机制。方法:采用SP分选法,分选乳腺癌细胞系MCF-7中的SP及NSP细胞亚群;运用实时定量PCR法检测MCF-7细胞系中SP、NSP亚群let-7a/b/c的表达;通过Western blot法检测Ras、ERK蛋白在MCF-7细胞系中SP、NSP亚群中的表达,探索let-7维持乳腺癌干细胞特性的机制。结果:SP侧群细胞占MCF-7细胞的3.3%,加入维拉帕米抑制干细胞外排荧光染料Hoechst33342的功能后,SP侧群细胞占乳腺癌MCF-7细胞的比例下降至0.4%。Let-7miRNA在SP细胞中的表达低于NSP细胞,其中let-7b/c在SP及NSP亚群中表达差异最大;p-Ras、p-ERK在SP细胞中的表达高于NSP细胞,t-Ras及t-ERK的表达无明显差异。结论:SP法是一种可有效分离干细胞的方法,乳腺癌细胞系MCF-7中存在肿瘤干细胞亚群;let-7在乳腺癌干细胞中的表达低于普通肿瘤细胞,而p-Ras、p-ERK在乳腺癌干细胞中的表达高于普通肿瘤细胞,let-7的低表达失去了对Ras mRNA的抑制,使Ras信号转导通路激活,进而磷酸化的p-Ras和p-ERK表达升高,维持乳腺癌干细胞的功能。

阳和汤含药血清对缺氧乳腺癌干细胞MDA-MB-231增殖的抑制作用及其机制

目的研究阳和汤含药血清对缺氧乳腺癌干细胞MDA-MB-231增殖的抑制作用及其机制。方法体外培养缺氧乳腺癌干细胞MDA-MB-231,采用阳和汤高、中、低浓度含药血清,顺铂,单药或联合HIF-1α抑制剂处理。MTT法检测细胞增殖活性,Real-time PCR法检测HIF-1α、IGF-II、L-Selectin的m RNA表达变化,Western blot检测HIF-1α、IGF-II、L-Selectin的蛋白表达变化。结果阳和汤含药血清能抑制细胞生长,而且呈浓度依赖性,阳和汤含药血清能下调HIF-1α、IGF-II、L-Selectin的m RNA及蛋白表达,且呈浓度依赖性,联合HIF-1α抑制剂效果更明显。结论阳和汤含药血清能抑制缺氧乳腺癌干细胞的增殖,可能通过调节HIF-1α/IGF-II信号通路及L-Selectin的表达抑制乳腺癌细胞的增殖转移。

异嗪皮啶对人乳腺癌干细胞凋亡相关基因Bcl-2与Caspase家族表达的影响

目的:研究草珊瑚中异嗪皮啶成分对乳腺癌干细胞中凋亡相关基因通路Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8基因表达影响,进而明确其抑制增殖、迁移和促凋亡的机制。方法:无血清培养法诱导MDA-MB-231细胞株富集乳腺癌干细胞,流式细胞仪分选CD44^+/CD24^(-/low)干细胞群。各组分别给予0、17、50、150、450μmol/L异嗪皮啶,CCK-8法观察给药后24、48、72 h的细胞活力;细胞划痕实验法检测给药后细胞痕道宽度变化值并判断其对细胞迁移能力的影响;Annexin V-FITC/PI染色法检测给药后细胞总凋亡率变化;实时荧光定量PCR测定各组Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8基因的mRNA水平;Western blot检测上述基因的蛋白水平。结果:与对照组比较,50、150和450μmol/L异嗪皮啶组24、48、72 h的细胞活力降低,细胞迁移能力下降。与对照组比较,50、150和450μmol/L异嗪皮啶组细胞总凋亡率高于对照组,Bcl-2基因mRNA和蛋白表达水平降低,Caspase-3和Caspase-8基因mRNA和蛋白表达水平升高。以上结果均呈明显剂量效应关系。结论:异嗪皮啶能通过下调Bcl-2基因表达与激活Caspase基因家族诱导乳腺癌干细胞的凋亡,同时能抑制其增殖与迁移。

β-榄香烯对MCF-7/ADM细胞株中乳腺癌干细胞作用的初步研究

目的探讨乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/ADM与阿霉素敏感细胞株MCF-7/S中乳腺癌干细胞(BCSCs)含量及乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和P-糖蛋白(P-gp)表达的差异,观察中药β-榄香烯(β-ELE)对BCSCs及BCRP和P-gp表达的影响。方法应用无血清细胞培养法培养MCF-7/ADM和MCF-7/S细胞株,形态学观察不同细胞株无血清细胞球培养的成球率,RT-PCR检测两种细胞株中BCRP和P-gp的mRNA水平,流式细胞仪检测BCRP和P-gp的阳性表达率及CD44+CD24-/low细胞比例。应用15μg/mlβ-ELE作用MCF-7/ADM细胞株48h后,检测细胞成球率及BCRP、P-gp基因与蛋白表达的变化。结果与MCF-7/S细胞比较,MCF-7/ADM细胞的成球率及BCRP、P-gp mRNA水平较高。MCF-7/ADM细胞中BCRP和P-gp蛋白的阳性表达率分别为(77.78±9.55)%和(32.33±5.12)%,CD44+CD24-/low细胞比例为(64.79±11.78)%,均高于MCF-7/S细胞的(3.97±1.51)%、(14.26±2.51)%和(18.79±3.28)%,差异均有统计学意义(P<0.01)。β-ELE能明显抑制MCF-7/ADM细胞的成球率及BCRP、P-gp基因与蛋白的表达(P<0.01)。结论 MCF-7/ADM是BCSCs相对富集的一种耐药细胞株且高表达BCRP和P-gp,β-ELE能够抑制MCF-7/ADM细胞中BCSCs比例及其成球率,并降低耐药蛋白的表达。

乳腺癌干细胞向血管内皮细胞分化及血管形成的实验研究

目的探讨乳腺癌干细胞向血管内皮细胞分化的潜力及参与肿瘤血管形成的作用。方法收集人乳腺癌组织样本,检测肿瘤血管中突变型P53、CD31、VEGF的表达及Her-2扩增;制备乳腺癌单细胞悬液,分选出CD44^+/CD24-/low细胞,以培养体系为EGM-2内皮细胞培养基培养,检测其内皮细胞表面标志CD31和CD105的表达和摄取乙酰化低密度脂蛋白的能力,体外进行三维胶培养,观察其脉管样结构。结果乳腺癌组织样本中均可观察到CD31、VEGF、突变型P53的表达,并沿着血管腔或血管球排列;免疫荧光显示乳腺癌组织血管内表达CD31和DAPI信号;在13例所取样本中检测到Her-2阳性扩增4例,未扩增9例。分离成功的乳腺癌干细胞进行免疫磁珠分选,分选前CD44^+细胞比例[(7.5±2.6)%]明显低于分选后[(94.3±4.7)]%,差异具有统计学意义(P<0.05);分选前CD24^+细胞比例[(48.2±9.4)%]明显高于分选后[(4.3±1.6)%],差异具有统计学意义(P<0.05)。乳腺球细胞中CD105^+细胞比例为(4.5±0.9)%,CD31^+细胞比例为(6.2±1.3)%;经内皮细胞培养体系持续培养3代后,CD105^+和CD31^+细胞比例分别为(79.6±9.3)%和(84.1±10.7)%,差异有统计学意义(P<0.05)。经内皮细胞培养体系培养后的细胞能吞噬DiL-Ac-LDL,内皮细胞组可见有脉管样结构形成,而对照组无脉管样改变的趋势。结论乳腺癌干细胞来源的内皮细胞可分化为血管内皮细胞并具有脉管形成的能力,提示乳腺癌干细胞可能参与肿瘤血管的形成。

乳腺癌干细胞培养鉴定及分化过程中微环境的影响

背景:乳腺癌干细胞会对乳腺癌的发生、转移等产生较大的影响。通过模拟肿瘤微环境,可以更好的对乳腺癌干细胞增殖与分化情况进行分析。目的:探讨肿瘤微环境对乳腺癌干细胞分化过程的影响。方法:对乳腺癌细胞及MCF-7细胞进行成纤维细胞上清液和无血清培养液PCM-2原代培养,观察乳腺癌细胞微球体的形成情况,采用MTT比色法检测乳腺癌细胞增殖能力,利用免疫细胞化学方法和RT-PCR方法检测乳腺癌干细胞标记物和上皮间质标记物的表达情况。结果与结论:无血清培养液PCM-2培养的原代细胞微球体直径显著大于成纤维细胞上清液。成纤维细胞上清液培养速度显著快于无血清培养液PCM-2。无血清培养液PCM-2培养第3天原代细胞中ALDH1表达率显著高于成纤维细胞上清液。与无血清培养液PCM-2培养比较,成纤维细胞上清液培养原代细胞中的ALDH1表达出现下调现象,而E-cadherin、Vimentin等上皮间质标记物表达则出现上调现象。在成纤维细胞上清液培养MCF-7细胞中的E-cadherin、VimenT in表达上调,而ALDH1、Oct-4等乳腺癌干细胞标记物表达下调。结果表明肿瘤微环境会对乳腺癌干细胞生存状态和分化过程产生一定的影响,成纤维细胞上清液中分泌的一些因子可以从一定程度上对乳腺癌干细胞样微球体的增殖与分化产生促进作用。

沉默HIF-2α表达对低氧下乳腺癌干细胞微球体富集的影响

目的:探讨沉默低氧诱导因子-2α(hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α)表达对低氧下乳腺癌干细胞(breast cancerstem cells,BCSCs)微球体富集的影响。方法:构建HIF-2αRNA干扰慢病毒载体,并转染至MCF-7细胞,RT-PCR和Western blot检测HIF-2αmRNA及蛋白表达;MTT检测MCF-7细胞在不同氧浓度下增殖活性;显微镜下观察低氧下BCSCs微球体形成情况;有限稀释法检测微球体细胞单克隆形成能力;RT-PCR检测微球体细胞干细胞相关标志物ABCG2、CD44及OCT-4 mRNA表达。结果:成功构建了HIF-2α基因siRNA慢病毒表达载体,RT-PCR和Western blot结果显示干扰组细胞HIF-2αmRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05)。与未转染组及空载体组比较,低氧下RNA干扰组细胞增殖活性及BCSCs单克隆形成能力明显降低(P<0.05);RT-PCR结果亦显示RNA干扰组BCSCs相关标志物ABCG2、CD44及OCT-4 mRNA表达显著降低(P<0.05)。结论:低氧能够诱导和强化MCF-7细胞乳腺癌癌干细胞样特性,而沉默HIF-2α表达可抑制低氧下BCSCs富集,提示HIF-2α有望成为乳腺癌治疗新的靶点。

源于乳腺癌干细胞的内皮细胞参与肿瘤血管形成的实验研究

目的肿瘤干细胞是肿瘤细胞中表达干细胞相关标志的亚群,具有高增殖能力和多向分化潜能。文中探讨源于乳腺癌干细胞的内皮细胞是否参与了乳腺癌的血管形成过程,为乳腺癌发病机制提供部分理论基础。方法收集人乳腺癌组织样本,免疫组化法和免疫荧光法检测肿瘤血管中突变型P53、CD31、VEGF的表达,荧光原位杂交方法检测Her-2扩增情况;制备乳腺癌单细胞悬液,采用免疫磁珠分选方法分选出CD44^+/CD24^(-/low)细胞,以培养体系为EGM-2内皮细胞培养基培养,流式细胞检测其内皮细胞表面标志CD31和CD105的表达和摄取乙酰化低密度脂蛋白的能力,体外进行三维胶培养,观察其脉管样结构。结果乳腺癌组织样本的石蜡切片中均可观察到CD31、VEGF、突变型P53的表达,并沿着血管腔或血管球排列;免疫荧光显示乳腺癌组织血管内表达CD31和DAPI信号;在分离成功的乳腺癌干细胞进行免疫磁珠分选,分选前、后细胞中CD44^+细胞比例分别为(7.5±2.6)%、(94.3±4.7)%;分选前、后细胞中CD24^+细胞比例分别为(48.2±9.4)%、(4.3±1.6)%,CD24^+细胞比例越低则CD24^(-/low)细胞比例越高;乳腺球细胞中CD105^+细胞比例为(4.5±0.9)%,CD31^+细胞比例为(6.2±1.3)%;经内皮细胞培养体系持续培养3代后,CD105^+和CD31^+细胞比例明显提高分别为(79.6±9.3)%和(84.1±10.7)%;经内皮细胞培养体系培养后的细胞能吞噬Di L-Ac-LDL,说明该细胞具有内皮细胞类的功能;内皮细胞组可见有脉管样结构形成,而脂肪细胞无脉管样改变的趋势。结论乳腺癌干细胞来源的内皮细胞可分化为血管内皮细胞,在体外培养中可参与肿瘤血管的形成。

BRCA1在散发性乳腺癌干细胞中的表达及意义

目的探讨乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)在散发性乳腺癌干细胞和分化细胞中的表达及意义。方法选取散发性乳腺浸润性导管癌新鲜标本30例,采用机械分离法将乳腺癌组织块制备成单细胞悬液,通过免疫磁珠两步法从中分离出乳腺癌干细胞(CD44+/CD24-细胞)和分化细胞(CD24+、CD44-、CD24-细胞),应用免疫细胞化学PV6000两步法分别检测两组细胞BRCA1的表达情况。结果乳腺癌干细胞所占比例平均为2.96%,乳腺癌干细胞BRCA1阴性组与阳性组相比,乳腺癌干细胞在乳腺癌中的比例明显升高,其差异有统计学意义(P<0.01);BRCA1在乳腺癌干细胞和分化细胞的阳性率分别为53.3%(16/30)8、3.3%(25/30),差异有显著性(P<0.05)。结论 BRCA1能够抑制乳腺癌干细胞的增殖,某些乳腺癌的癌干细胞在增殖分化过程中出现BRCA1的表达。

乳腺癌干细胞富集与鉴定的初步研究

目的:通过从MCF-7、ZR-75-1、MDA-MB-231乳腺癌细胞系中培养富集及鉴定乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell,BCSC),寻找培养与富集乳腺癌干细胞的方法。方法:贴壁培养MCF-7、ZR-75-1、MDA-MB-231细胞系,倒置显微镜观察各细胞形态;流式细胞仪分别分选收集CD44^-CD24^-、CD44^-CD24^+、CD44^+CD24^-及CD44^+CD24^+细胞,其中CD44^+CD24^-为乳腺癌干细胞,其余三类为对照组; MTT法计数细胞,绘制MCF-7、ZR-75-1、MDA-MB-231细胞系生长曲线; MCF-7细胞系进行无血清悬浮培养1个周期,流式细胞仪检测分子表面标记物CD44^+CD24^-含量,贴壁培养的CD44^+CD24^-乳腺癌干细胞为对照组;将分选的MCF-7(CD44^+CD24^-)和分选的其余MCF-7细胞(非CD44^+CD24^-)进行干性成球实验,鉴定CD44^+CD24^-干性表达。结果:MCF-7、MDA-MB-231细胞系富含表面标志物CD44^-CD24^-的乳腺癌细胞; ZR-75-1细胞系富含分子表面标志物CD44^+CD24^+的乳腺癌细胞;生长曲线显示MCF-7、ZR-75-1、MDA-MB-231均呈持续增长,MDA-MB-231细胞生长较MCF-7、ZR-75-1细胞快;通过无血清悬浮培养CD44^+CD24^-乳腺癌干细胞由19.4%富集到88.9%;成球实验中CD44^+CD24^-表型细胞成球数量较分选的其余MCF-7细胞(非CD44^+CD24^-表型)明显增多,成球率分别为(36.5±1.7)%,(1.1±0.5)%。结论:流式细胞仪可成功分选出分子表面标志物为CD44^+CD24^-的乳腺癌干细胞; CD44^+CD24^-可能不是乳腺癌干细胞唯一的表面标志物; MDA-MB-231细胞系较MCF-7、ZR-75-1细胞系生长快;无血清悬浮培养法可简便、高效地富集乳腺癌干细胞; CD44^+CD24^-乳腺癌干细胞干性表达较强。

Let-7c通过阻断雌激素激活的Wnt信号通路活性而抑制乳腺癌干细胞的自我更新能力

目的:探究Let-7c是否能通过Wnt信号通路调控乳腺癌干细胞自我更新能力。方法:分析乳腺癌临床样本中Let-7家族成员的表达情况,检测Let-7与ERα的相关性,进一步探讨Let-7c与Wnt通路活性分子表达的相关性;在细胞试验中,通过ALDH流式细胞仪分选法及微成球实验分选乳腺癌干细胞;采用免疫印迹、荧光素酶报告试验及免疫荧光实验,验证Let-7c与ERα-3'UTR是否能直接结合。结果:Let-7家族成员在乳腺癌组织中高表达,并且Let-7b和Let-7c的表达与患者临床预后显著相关;Let-7c表达与ERα表达呈负相关,Let-7c表达与Wnt信号通路活性分子呈负相关;Let-7c能够抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞自我更新能力;Let-7c能够直接结合到ERα-3'UTR上,进而抑制ERα的表达和雌激素激活的Wnt信号通路。结论:我们的研究首次证实了Let-7c通过抑制雌激素激活的Wnt通路活性,而对肿瘤干细胞的自我更新能力产生抑制作用。

缺氧对乳腺癌干细胞微球体培养及基因表达的影响

背景与目的三阴性乳腺癌侵袭转移的风险高、预后差。肿瘤转移的关键一是肿瘤干细胞,二是缺氧微环境,该研究拟探讨缺氧对乳腺癌干细胞MDA-MB-231微球体培养及基因表达的影响。方法分别在缺氧和常氧环境下进行乳腺癌干细胞的培养、富集、鉴定和分选,采用细胞因子抗体芯片检测缺氧与常氧乳腺癌干细胞基因表达的差异。结果缺氧条件下乳腺癌干细胞成球率及比例优于常氧条件,细胞因子抗体芯片显示,缺氧乳腺癌干细胞与常氧比有多个基因表达上调。结论缺氧微环境促进乳腺癌干细胞微球体的形成,并有多个基因表达上调。