利用乳酸乳球菌发酵大豆蛋白产低聚肽的研究

筛选可以发酵分解大豆蛋白的食源性微生物,对分解产生的多肽进行分子量分析,通过分离纯化获得低聚肽并研究其抗氧化活性。结果表明:从自制泡菜中分离到一株食源性乳酸菌PZ1,经形态和16S rDNA鉴定为乳酸乳球菌;全基因组分析PZ1菌株具有多种肽酶和蛋白酶基因,具备分解蛋白的潜在能力;利用PZ1发酵大豆分离蛋白,采用凝胶渗透色谱分析发酵产生的多肽,分子量1000 Da以下占比达85%;通过超滤纯化获得300~1000 Da的低聚肽;研究大豆低聚肽的抗氧化活性,发现低聚肽对DPPH自由基、羟基自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O_(2)^(−)·)均有较好的清除作用,浓度为2 mg/mL时,清除率分别为79.31%、78.27%和84.62%。因此乳酸乳球菌PZ1能够高效降解大豆蛋白,可作为益生菌应用于大豆功能产品的开发。

表面展示SARS-CoV-2抗原蛋白乳酸乳球菌工程菌的构建

利用乳酸菌表达系统构建表达抗原蛋白的工程菌是探讨抗原应用的重要手段之一。本研究利用融合PCR技术将信号肽-细胞壁锚定蛋白结构域序列(Usp45-3LysM)分别与绿色荧光蛋白(GFP)、Omicron变异株上S1蛋白的受体结合位点结构域(RBD)序列融合,构建表达载体pNZ8149-GFP、pNZ8149-2RBD、pNZ8149-3RBD,转化乳酸乳球菌NZ3900(Lactococcus lactis NZ3900)构建了GFP、2RBD、3RBD表面展示工程菌菌株。结果表明工程菌受Nisin诱导表达GFP的最佳浓度和时间分别为20 ng/mL和20 h。蛋白质免疫印迹法(Western blot)和间接免疫荧光检测结果证明,3种目的蛋白都成功表达并展示于工程菌的细胞壁上,表明表面展示SARS-CoV-2抗原蛋白乳酸乳球菌工程菌已构建成功。本研究为新冠病毒或其他动物病毒的新型乳酸菌口服疫苗的研制及其相关产品的研发打下基础。

猪表皮生长因子在乳酸乳球菌中的表达及其生物活性研究

【目的】构建表达猪表皮生长因子(pEGF)的乳酸乳球菌原核表达系统,并探究其对断奶仔猪腹泻的影响。【方法】以pUC57-SP45-LEISSTCDA-pEGF序列为模板,利用PCR扩增获得缺失LEISSTCDA片段的融合产物,将其与酶切pNZ8149表达载体连接后电转至乳酸乳球菌NZ3900,以LacF为筛选标记获得重组菌pEGF-NZ。用nisin诱导重组菌pEGF-NZ表达重组蛋白pEGF,并通过Tricine-SDS-PAGE检测其表达情况。改良实验室及工业发酵条件以提高pEGF表达量。利用猪回肠上皮细胞(IPEC-J2)增殖试验体外验证表达的pEGF生物活性。通过动物试验验证重组蛋白pEGF对小鼠及断奶仔猪腹泻的影响。【结果】试验成功构建重组菌pEGF-NZ,并分泌表达pEGF蛋白。体外试验结果显示,pEGF蛋白能促进细胞增殖。pEGF-NZ重组菌及其表达的pEGF蛋白能延缓小鼠腹泻发生时间,降低腹泻率,保护小鼠肠绒毛的完整性。与对照组相比,pEGF-NZ重组菌处理后,小鼠结肠中乳酸菌数显著增加(P<0.05),大肠杆菌数、肠球菌数显著降低(P<0.05),白细胞介素-1α(IL-1α)、IL-1β含量显著降低(P<0.05),IL-13含量显著升高(P<0.05)。饲粮中添加pEGF-NZ重组菌后,断奶仔猪腹泻情况明显缓解,平均日增重有升高趋势,但差异不显著(P>0.05)。【结论】pEGF-NZ重组菌及其分泌表达的pEGF能够修复肠道屏障,抑制病原菌黏附,调控肠道菌群,其主要通过下调部分促炎因子、上调抑炎因子表达发挥抑炎效果,从而保护断奶仔猪肠道健康,有效缓解腹泻。

表达胸腺肽和干扰素融合蛋白的重组乳酸乳球菌作为鸡新城疫病毒活疫苗免疫佐剂的初步研究

为评估以滴鼻方式免疫表达鸡胸腺肽和鸡干扰素融合蛋白的重组乳酸乳球菌能否作为新城疫病毒(NDV)活疫苗的免疫佐剂及对其免疫效力的影响,本研究以表达鸡胸腺肽和鸡γ干扰素融合蛋白(cTα1-cIFN-γ,后简写为Tα1-IFN)的重组乳酸乳球菌(Tα1-IFN/r-L.lactis)与NDV活疫苗混合后(Tα1-IFN/r-L.lactis+NDV活疫苗)滴鼻免疫14日龄SPF鸡,同时设NDV活疫苗组、L.lactis+NDV活疫苗组及PBS阴性对照组。分别于免疫后不同时间(3 d、7 d、14 d、21 d、28 d)采血,于免疫后14 d、21 d、28 d分别检测各组鸡血清中的HI抗体效价;采用间接ELISA测定免疫后3 d、7 d及14 d各组鸡血清中主要细胞因子的分泌水平;分离各组鸡免疫后21 d及28 d外周血单个核细胞(PBMC)和外周血白细胞,分别通过CCK-8法检测各组鸡PBMC和白细胞中抗原递呈细胞(APC)的增殖活性。HI抗体检结果显示,分别在免疫后14 d、21 d,Tα1-IFN/r-L.lactis+NDV活疫苗组鸡的NDV HI抗体效价与NDV活疫苗组以及L.lactis+NDV活疫苗组均无显著差异;但免疫后28 d,该组鸡血清中的NDV HI抗体效价极显著高于其余两组(P<0.0001)。细胞因子检测结果显示,在免疫后各时间点Tα1-IFN/r-L.lactis+NDV活疫苗组鸡血清中IFN-γ及IL-2(Th1型细胞因子)和IL-4(Th2型细胞因子)的分泌水平基本均显著或者均极显著高于NDV活疫苗组、L.lactis+NDV活疫苗组及阴性对照组(14 d的IL4除外)。Tα1-IFN/r-L.lactis+NDV活疫苗组鸡血清中IL-1β(促炎因子)和IL-10(抗炎因子)的分泌水平在免疫后3 d、7 d、14 d均极显著高于其余各组(P<0.0001)。细胞增殖活性的检测结果显示,免疫后21 d和28 d,Tα1-IFN/r-L.lactis+NDV活疫苗组鸡PBMC的增殖活性均极显著高于其余各组;免疫后28 d,该组鸡PBMC的增殖活性均极显著高于L.lactis+NDV活疫苗组和阴性对照组(P<0.0001),但与NDV活疫苗组差异不显著(P>0.05);免疫后21 d和28 d,Tα1-IFN/r-L.lactis+NDV活疫苗组鸡外周血白细胞中APC的增殖活性均极显著高于其余各组(P<0.0001);免疫后28 d,该组鸡白细胞中APC的增殖活性极显著高于NDV活疫苗组(P<0.01),但与L.lactis+NDV活疫苗组和阴性对照组均无显著差异。上述结果表明,本研究采用表达Tα1-IFN的重组乳酸乳球菌与NDV活疫苗同时滴鼻免疫SPF鸡后,可诱导其产生较高水平的体液免疫及细胞免疫反应,增强SPF鸡免疫系统的应答能力,同时又能维持鸡体内的免疫稳态。有望成为一种新型的、有潜力的免疫佐剂,为新型免疫佐剂的开发提供了重要实验数据及参考依据。

乳酸乳球菌荧光单碱基突变报告系统的建立

乳酸乳球菌是乳品工业中重要的发酵剂,被广泛应用于奶酪和发酵乳的生产过程中。文章通过向乳酸乳球菌NZ9000中插入增强型绿色荧光蛋白(eGFP)终止标记,开发出荧光单碱基突变报告系统。研究基于实验室已有的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9基因编辑质粒pYSH,构建含突变eGFP基因(将第550位的有义密码子CAG突变为终止密码子TAG,记作eGFP-C550T)的基因编辑质粒pYSH-C550T,并将eGFP-C550T电转入NZ9000菌株中,获得工程菌NZ9000Δldh:eGFPC550T;在荧光显微镜下检测显示其不发荧光,表明单碱基突变报告系统构建成功。该报告系统可用于碱基编辑器的编辑效率检测,为乳酸乳球菌碱基编辑技术的开发奠定牢固的基础。

乳酸乳球菌的单菌包埋技术及在胃肠道环境中的性能评价

由于益生菌对消化系统的强酸和高浓度胆汁盐环境较为敏感,并且在肠道中定殖能力较低,因此开发新颖有效的益生菌包埋体系用于解决上述问题很有必要。本研究使用羧甲基化β-葡聚糖(m GN),通过金属-酚醛网络结构(Fe-TA)的桥联作用,将其黏附在乳酸乳球菌(LL)表面,构建乳酸乳球菌的包埋体系LL@Fe-TA@mGN,并评价LL@Fe-TA@mGN对胃液与胆盐的抗性及其在体内的滞留能力。结果表明:当mGN的质量浓度为0.12 mg/mL时,LL@Fe-TA@mGN体系的粒径和zeta-电位都达到峰值,表明该质量浓度为mGN包埋单个乳酸乳球菌的最佳质量浓度。在MRS液体培养基中,LL@FeTA@mGN的生长曲线与LL的生长曲线没有显著性差异,说明mGN的毒性可以忽略不计。在扫描电镜与透射电镜分析中均可清晰地看到一层“膜”完整地包覆在乳酸乳球菌表面。经2 h模拟胃液与胆盐的孵育,mGN包埋后的LL抗胃液能力与抗胆盐能力相比于未包埋的LL分别提升14.63倍与1.94倍。体内荧光成像实验证实LL@Fe-TA@mGN具有更强的肠道滞留能力。综上,本研究开发的乳酸乳球菌单菌包埋技术能够显著提升乳酸乳球菌的胃肠道抗性与体内滞留能力。研究结果可为益生菌包埋系统的开发与利用提供新的思路和策略。

纤维二糖水解酶在乳酸乳球菌中的表达

为在乳酸乳球菌中表达纤维二糖水解酶II(CBH II)基因,对绿色木霉(T.reesei)CBH II基因序列进行密码子优化和合成,通过PCR及T4 DNA连接酶将人工合成的序列插入到表达载体pNZ8148中,获得重组质粒pNZ8148-CBH II,重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后,将正确的重组质粒通过电击转化进入乳酸菌NZ3900感受态细胞,通过选择性抗生素氯霉素筛选阳性克隆,放大培养后使用终浓度为20 ng/mL的Nisin进行诱导表达,诱导后的菌液经SDS-PAGE鉴定,有符合预期大小的条带,说明CBH II基因在乳酸乳球菌NZ3900中表达。研究为乳酸乳球菌的改造及开发临床应用奠定基础。

基于代谢组学的豆乳中乳酸乳球菌乳酸亚种发酵特性分析

目前,国内外关于乳酸乳球菌乳酸亚种的应用研究主要集中于其在牛乳发酵中的特性,而其在豆乳发酵中的应用研究较少。本研究基于发酵指标,采用代谢组学和感官评价对乳酸乳球菌乳酸亚种菌株在豆乳中的发酵特性进行分析。结果表明:具有优良蔗糖代谢特性的DYNDL21-2、DYNDL1-2和FJNDD18M83株乳酸乳球菌乳酸亚种菌株展现出良好的生长和产酸能力;在乳酸乳球菌乳酸亚种发酵豆乳中,菌株DYNDL21-2、FJNDD18M8发酵能明显下调己醛和多种呋喃类杂环化合物的丰度,有效降低豆腥味强度;菌株FJNDD18M8发酵能明显上调乙醛、乙偶姻及2,3-丁二酮等物质丰度,增强发酵豆乳产品的乳香和奶油风味,有效改善豆乳风味。综上,乳酸乳球菌乳酸亚种菌株在豆乳发酵过程中具有优良的发酵特性和较强的代谢能力,但菌株间存在一定的差异。

异源果聚糖蔗糖酶在乳酸乳球菌中的分泌表达

为了实现果聚糖蔗糖酶简便有效的纯化,文章将来源于解淀粉芽孢杆菌的基因sacB添加组氨酸标签后与信号肽基因usp45融合形成基因片段usp45-sacB,然后插入质粒pNZ8048中,导入乳酸乳球菌(L.lactis)NZ9000构建重组菌株L.lactis(pNZ8048-usp45-sacB)。通过电泳验证纯化蛋白的分子量为51 kDa,符合预期大小,确定果聚糖蔗糖酶成功表达。为了进一步提高果聚糖蔗糖酶的产量,该研究对诱导时间和诱导剂的质量浓度进行优化,得出最优的表达条件为:诱导时间48 h,诱导剂nisin质量浓度2μg/L。

基于pyrF的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建

基于pyrF筛选标记和来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)的基因组DNA为表达元件,构建L.lactis食品级表达载体,用于食品和药用多肽的表达和生产。首先,利用NZ3900 pyrF基因列构建同源重组突变盒,构建NZ3900 ΔpyrF突变株;然后,分别以来源于L.lactis的repA和repC基因为复制元件、pyrF基因为筛选标记、P_(32)和P_(8)为启动子、以及Tusp_(45)和TpepN为终止子,构建食品级表达质粒pLD;最后以绿色荧光蛋白ZsGreen为报告基因,验证ZsGreen在NZ3900 ΔpyrF突变株的表达及pLD-ZsG的遗传稳定性。实验结果表明,原养型ZsGreen阳性转化子可在普通Elliker培养基中正常生长,在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光信号;此外,PCR和Western blotting也证实ZsGreen能在NZ3900中表达且能稳定传代至30代,说明pLD食品级表达载体构建成功且使得外源蛋白在L.lactis中稳定表达。综上所述,基于pyrF营养缺陷型标记构建的L.lactis食品级表达载体的方法切实可行,可为推动L.lactis在食品和药用多肽生产中的应用提供研究基础。

乳酸乳球菌乳酸亚种inm3113的益生特性及体内效果评价

为从天然发酵乳样本中筛选出具有降胆固醇功能的乳酸菌,采用MRS-胆固醇培养基培养后,通过邻苯二甲醛比色法进行初步筛选,再通过气相色谱法对菌株的降解胆固醇能力进行复检。采用16S rDNA基因序列分析菌株种属信息,对菌株的抗生素敏感性及上清液抑菌性进行测定,并利用小鼠模型对菌株的体内降解胆固醇能力进行评估。结果表明:乳酸乳球菌乳酸亚种(inm3113)的胆固醇复筛降解率达30.03%,是嗜酸乳杆菌ATCC43121的2.3倍;inm3113菌株对四环素最为敏感,其上清液对大肠杆菌等常见致病菌有较好的抑制作用。小鼠模拟试验结果表明,inm3113菌株可以延缓高脂饲料喂养小鼠体质量上升的速度,降低血清胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的浓度。

乳酸乳球菌对伴放线菌团聚杆菌的作用

目的:研究乳酸乳球菌(L.lactis)对伴放线菌团聚杆菌(A.actinomycetem)生长及生物膜形成的影响,为L.lactis牙周疾病防治应用提供理论基础。方法:厌氧条件下培养L.lactis及A.actinomycetem,琼脂扩散实验检测L.lactis对A.actinomycetem的抑菌圈直径;琼脂板竞争实验检测L.lactis与A.actinomycetem之间的拮抗相互作用;A.actinomycetem单独培养生物膜为对照组,L.lactis与A.actinomycetem共培养为实验组,结晶紫染色法(CVS)及扫描电子显微镜(SEM)检测L.lactis对A.actinomycetem生物膜形成的影响。对细菌生物膜量进行比较。结果:琼脂扩散实验结果显示,L.lactis对A.actinomycetem的抑菌圈直径为(3.53±0.26)mm。琼脂板竞争实验显示,L.lactis提前接种组、L.lactis与A.actinomycetem同时接种组A.actinomycetem生长受抑制,表现为靠近L.lactis菌落的A.actinomycetem菌落细菌密度降低。CVS结果显示,A.actinomycetem单独培养生物膜量多于与L.lactis共培养组,差异有统计学意义(P<0.05)。SEM结果显示,A.actinomycetem单独培养组与共培养组生物膜均较薄。结论:L.lactis可能抑制A.actinomycetem生长及生物膜形成。

响应面法优化乳酸乳球菌固态发酵羽毛粉发酵条件

通过单因素试验探讨不同发酵温度、固液比、接种量、初始pH和发酵时间对乳酸乳球菌固态发酵羽毛粉降解率和菌落数的影响,采用响应面试验设计优化影响羽毛粉降解率较大因素。结果表明,①随发酵温度、固体含量、乳酸乳球菌接种量、初始pH和发酵时间增加,发酵羽毛粉降解率和乳酸乳球菌菌落数呈先增后降趋势。②各因素对乳酸乳球菌菌落数影响强度顺序为:发酵时间>接种量>固液比>发酵温度>初始pH。③优化后发酵条件为发酵温度30℃,固液比6.5:3.5,接种量7%,初始pH 6.0、发酵时间47 h。④优化条件下发酵羽毛粉实际降解率为39.22%,乳酸乳球菌菌落数为10.61lg(cfu·g^(-1))。试验明确乳酸乳球菌固态发酵羽毛粉最优条件,该方法是一种提高羽毛粉饲用价值的有效方式。试验填补乳酸乳球菌固态发酵羽毛粉研究空白,为开发优质、低成本蛋白饲料提供新思路。

重组猪EGF乳酸乳球菌对断奶仔猪生长性能、肠道免疫和肠道微生物的影响

文章旨在研究重组猪EGF乳酸乳球菌对断奶仔猪生长性能、肠道免疫和肠道微生物的影响,试验将120头仔猪随机分为4组,每组3个重复,每个重复10头仔猪,其中对照组只饲喂基础日粮,试验1、2、3组在基础日粮中添加10%、15%和30%的乳酸乳球菌试剂。试验结果表明,添加了乳酸乳球菌试剂的仔猪日增重比对照组提高了9%、19%、14%;仔猪对粗蛋白质、粗纤维等的消化率较对照组得到了显著提升(P<0.05)。同时乳酸乳球菌还降低了仔猪腹泻率,比对照组分别降低了47.2%、65%和51%。说明添加乳酸球菌的饲料能显著提高仔猪肠道内的益生菌,降低有害微生物,提高仔猪的肠道免疫能力。综上所述,在日粮中添加15%的乳酸乳球菌能提高仔猪生长性能和肠道免疫能力,降低仔猪肠道有害菌数量。

口服表达胸腺肽和鸡干扰素融合蛋白的重组乳酸乳球菌对鸡肠道菌群影响的研究

为构建表达胸腺肽和鸡γ干扰素融合蛋白(Tα1-cIFN-γ)的重组乳酸乳球菌并检测其作为口服免疫增强剂对鸡外周血单个核细胞(PBMC)的增殖活性及鸡肠道菌群的影响,本研究将鸡胸腺肽(Tα1)和鸡干扰素(cIFN-γ)的编码基因序列(去除干扰素信号肽编码基因序列),并按照宿主菌乳酸乳球菌NZ3900株的基因组优化密码子后,以经G4S-linker连接的Tα1-cIFN-γ基因为模板,采用PCR扩增携带表达载体p NZ8149同源臂及HA标签的目的基因序列(Tα1-cIFN-γ-HA);通过PCR扩增携带Tα1-cIFN-γ-HA基因序列同源臂的全长p NZ8149载体序列,利用同源重组的方式将这两段基因连接构建重组质粒p NZ8149-Tα1-cIFN-γ-HA,并经PCR和测序鉴定正确后电转化乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中,构建重组乳酸乳球菌p NZ8149-Tα1-cIFN-γ-HA/NZ3900(r L.lactis-Tα1-cIFN-γ)并经PCR和测序鉴定;将重组乳酸乳球菌r L.lactis-Tα1-cIFN-γ经乳酸链球菌素(Nisin)诱导6 h~7 h,离心超声破碎后取上清采用western blot鉴定Tα1-cIFN-γ的表达。结果显示,r L.lactis-Tα1-cIFN-γ经PCR扩增到3185 bp的目的基因片段,测序结果显示目的片段完全正确;且在约25 ku处出现特异性条带,与目的蛋白Tα1-cIFN-γ大小相符,利用BCA蛋白测定试剂盒构建标准曲线,对Tα1-cIFN-γ绝对定量显示其含量为31μg/m L。以重组乳酸乳球菌裂解液(含重组蛋白40μg/m L,重组菌2×10^(9)cfu/mL)经口服免疫21日龄SPF鸡,并于28日龄加强免疫一次,于首免后2周、4周、7周采血分离PBMC,并分别采用Con A+Ionomycin、Con A+PMA及LPS刺激后,采用CCK-8法检测鸡PBMC的增殖活性。结果显示,经刺激后的各实验组鸡于首免后2周、4周、7周PBMC的增殖活性均极显著高于阴性对照组(口服PBS的鸡)(P<0.001、P<0.0001、P<0.0001);7周后剖杀各组鸡取其盲肠粪便样品经PCR扩增16S rDNA基因的保守区V3~V4基因序列,采用高通量测序并采用SIMCA软件、MOTHUR程序、AMDIS软件等对测序结果进行beta多样性、alpha多样性、菌群结构组成以及菌种重要性的LEf Se分析。beta及alpha多样性分析结果显示,实验组和阴性对照组鸡盲肠粪便样品测序结果分散于不同象限;且两组间样品的alpha多样性存在明显差异,表明实验组鸡具有更大的菌种丰度。菌群结构和组成分析结果显示,口服r L.lactis-Tα1-cIFN-γ显著改变了鸡盲肠肠道菌群门水平和属水平的结构和组成,其中厚壁菌门的乳酸杆菌属、普拉梭菌属和黏液真杆菌属等有益菌群显著增加;而拟杆菌门中的瘤胃菌属、另枝菌属等机会致病菌属显著减少。菌种重要性的LEf Se分析结果显示,与阴性对照组相比,口服r L.lactis-Tα1-cIFN-γ对SPF鸡肠道菌群的组成有显著影响,来自杆菌纲、乳杆菌目、乳杆菌科、乳杆菌属和厚壁菌门等有益菌成为肠道菌群内的重要菌种。上述结果首次表明,口服r L.lactis-Tα1-cIFN-γ不仅显著提高鸡PBMC的增殖活性等细胞免疫反应,而且还可以改善肠道菌群结构和组成,提高有益菌属的丰度,降低机会致病菌的丰度。本研究为天然绿色新型口服免疫增强剂和免疫佐剂的研制奠定了基础。

补料策略优化促进乳酸乳球菌HB03发酵合成Nisin

为提高乳酸乳球菌HB03发酵合成Nisin的效率,本研究基于乳酸乳球菌发酵生长期间存在的氧化胁迫效应和胞外氨基酸消长规律,分析了肽水解酶系、UMP从头合成和肽聚糖合成代谢在转录组水平的表达差异,确定对数中后期Nisin合成限制因素为半胱氨酸(cysteine,Cys)和精氨酸(arginine,Arg)供应不足,并通过氨基酸单因素和碳氮源补加优化,确定10 L发酵罐水平优化的补料策略为:11、13.5、17、19.5 h分别加入0.15 mmol/L的Cys,12 h补入蛋白胨(15 g/L),10~24 h补入蔗糖(1.5 g/(L·h)),12~21 h流加Arg(0.25 g/(L·h))。在此条件下Nisin效价达到了8963 IU/mL,比只补加Cys发酵效价(6993 IU/mL)提高了28.2%,研究结果可为Nisin工业发酵提供重要参考。

仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道源乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的分离鉴定及其益生特性分析

利用MRS固体培养基从南移仿刺参肠道中分离得到1株优势乳酸菌,命名为AJC-XP-15,其最适生长温度为30℃,最适生长pH为6.5;其表面疏水性和自聚率分别为34.56%和35.61%,经16S RNA基因序列分析,并结合形态学和生理生化特性将其鉴定为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。拮抗实验结果显示,菌株AJC-XP-15及其发酵上清液对塔氏弧菌(Vibriotubiashii)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus,VP)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等病原菌具有很好的抑制作用;体外益生实验表明,菌株AJC-XP-15对人工胃肠液的耐受性很好,在pH3.0的模拟人工胃液处理3 h后的存活率为71.43%,在pH 6.8的模拟人工肠液处理3 h后的存活率为92.1%;抗氧化能力结果显示,菌株AJC-XP-15的无细胞提取物对DPPH自由基和羟自由基的清除能力最强,分别为(82.67±6.92)%和(15.36±2.95)%,其发酵上清液对超氧阴离子自由基的清除能力最强,为(26.36±2.58)%;药物敏感性分析结果显示,菌株AJC-XP-15对四环素、恩诺沙星、盐酸多西环素等抗生素敏感,对氟苯尼考、复方新诺明、庆大霉素等抗生素不敏感。研究结果可为仿刺参肠道源乳酸菌的分离鉴定和候选益生菌种筛选提供参考依据。

基于底物消耗规律优化乳酸乳球菌增殖发酵工艺

为了提高乳酸乳球菌发酵生物量,该文首先筛选了最优碳氮源,分析了乳酸乳球菌偏好利用的氮源特征,定向制备了酪蛋白肽,进一步分析酪蛋白肽的添加对菌株增殖的影响;然后通过测定菌株生长速率被抑制时的碳氮消耗比和耐渗透压能力确定了初始发酵培养基的碳氮源添加比例和添加量。结果表明,葡萄糖是乳酸乳球菌的最佳碳源,酪蛋白肽和酵母浸粉FM 803以1∶2的质量比复合为最佳氮源,进一步优化微量元素的添加量和恒pH分批培养策略,得到最优培养基和培养工艺。乳酸乳球菌CCFM 1093的最优培养基:葡萄糖137 g/L、复合氮源53 g/L、MgSO_(4)·7H_(2)O 0.043 g/L、MnSO_(4)·H_(2)O 0.03 g/L、吐温-801 mL/L;乳酸乳球菌CCFM 1032最优培养基:葡萄糖106 g/L、复合氮源51 g/L、MgSO_(4)·7H_(2)O 0.043 g/L、MnSO_(4)·H_(2)O 0.03 g/L、吐温-801 g/L,活菌数分别可达到(1.01±0.06)×10^(12)CFU/mL和(9.78±0.38)×10^(11)CFU/mL,是MRS培养基静置培养的12.6倍和12倍。该研究结果将会显著提高乳酸乳球菌的工业生产效率。

乳酸乳球菌生产2'-岩藻糖基乳糖的途径构建及发酵培养基优化

2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose, 2’-FL)是一种含量最丰富的人乳寡糖,微生物全细胞合成是生产2’-FL的重要方法。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)作为一种可直接用于乳制品的食品级微生物,目前还没有用于生产人乳寡糖的报道。首先,在两种常用L. lactis底盘NZ3900和NZ9000中利用含有基因fkp、futC、lacF的重组质粒pNZ8148-2f构建2’-FL补救合成途径,在添加10 g/L岩藻糖和5 g/L乳糖的发酵培养基中,测得2’-FL的摇瓶产量分别为0.16 g/L与0.4 g/L,结合对二者生长状况等综合分析,选取NZ9000作为优势底盘。然后,在NZ9000中构建2’-FL从头合成途径,利用同源重组技术并借助L. lactis中特有的敲除整合载体p NZ5319,在敲除非必需基因upp的同时将基因manA、manB、gmd和wcaG整合到染色体上,借助载体pNZ8148-1将基因manC、futC和lacF以质粒的形式引入到细胞中,同时利用不同启动子P32、Pnis对酶的表达水平进行组合调控。获得最优菌株NZ9000 6,在添加20 g/L葡萄糖和5 g/L乳糖的发酵培养基中,测得2’-FL的摇瓶产量为0.28 g/L。最后,在发酵培养基中对氯化高铁血红素、胰蛋白胨和酵母粉的浓度进行了优化,在添加2.5μg/mL氯化高铁血红素、15 g/L胰蛋白胨、6 g/L酵母粉时2’-FL的摇瓶产量达到1.58 g/L,为相关报道的较高水平。该研究证实了L. lactis合成2’-FL的可行性,为2’-FL的生产提供了新思路。

表达猪传染性胃肠炎病毒S基因的重组乳酸乳球菌的构建及免疫原性分析

根据猪传染性胃肠炎病毒纤突(S)蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,进行PCR扩增,获得含有TGEVS基因4个主要抗原位点的约2000bp的目的片段,将其与分泌表达的载体质粒pNZ8112进行连接,通过电击转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,在乳链菌肽(Nisin)的诱导下进行表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,表明TGEVS蛋白在乳酸乳球菌中获得表达,所表达的TGEVS蛋白具有与TGE病毒一样的抗原特异性。间接免疫荧光试验表明重组菌表达蛋白定位于菌体表面。将表达TGEVS蛋白的重组乳酸乳球菌及空质粒菌株分别口服免疫BALB/c小鼠,收集粪便样品进行抗体检测,结果表明分泌型的重组菌pNZ8112-Sa/NZ9000免疫小鼠能够产生明显的抗TGEVsIgA抗体。