稀土盐与泡沫分离强化乳酸乳球菌生产乳链菌肽

乳链菌肽(Nisin)是一种重要的食品防腐剂,但其工业应用却受限于较低的生产效率。该研究拟采用稀土盐和泡沫分离强化乳酸乳球菌生产Nisin。利用摇瓶试验研究了8种稀土盐对菌体生长和Nisin生物合成的影响。以Nisin的回收率和发酵液的总Nisin效价为指标,利用单因素试验和响应面优化试验获得了发酵与泡沫分离耦合操作的最佳工艺条件。结果表明,所选的8种稀土盐中,添加氯化铥(TmCl_(3))至发酵培养基能够大幅增加菌体生物量和Nisin产量。在发酵9 h添加1×10^(-4)mol/L的TmCl_(3),发酵液的Nisin效价达到(5643.23±156.57)IU/mL。在发酵与泡沫分离初始耦合时间18.50 h,气体分布器孔径300μm和气体体积流率135 mL/min条件下,Nisin的回收率和发酵液的总Nisin效价分别为(89.43±2.35)%和(6159.00±89.35)IU/mL。综上,适量添加稀土盐和执行泡沫分离,能够在促进菌体生长的同时缓解产物抑制,实现Nisin的高效生产。该研究提出的外源辅因子刺激和产物原位分离方法对于强化Nisin的工业生产具有重要意义。

乳链菌肽产生菌的选育及其发酵性能研究

乳链菌肽是某些乳链球菌产生的一种多肽物质,对引起食品腐败的大多数革兰氏阳性菌有很好的抑制作用,是一种高效、无毒副作用的天然生物防腐剂。本文从鲜奶中筛选到一株乳链菌肽产生菌——乳链球菌P-99,并研究了该菌株的发酵适宜条件及其发酵过程动力学。结果表明,该菌株在M17培养基、30℃、起始pH6.5条件下发酵良好,通气量和某些金属离子对其细胞生长与产乳链菌肽无明显影响,但锰离子对乳链菌肽的产生有促进作用,而铜离子有较强的抑制作用;发酵动力学分析表明,该菌株产乳链菌肽表现出初级代谢动力学特征。

乳链菌肽抗性菌株的定向筛选及鉴定

利用乳链菌肽抗性菌株中乳链菌肽抗性和乳糖发酵紧密连锁的原理,在含有乳链菌肽、乳糖和溴甲酚紫的选择培养基上,从205个新鲜的牛奶样品中定向筛选乳链菌肽抗性菌株。对筛选到的4株菌分析鉴定结果表明:4株菌均为革兰氏阳性菌,产乳酸,过氧化氢酶试验阴性;通过质粒的抽提和电泳,发现Lactococcuslactissubsp.lactisZL2009,ZL2010,ZL2024,ZL2030分别含有1,7,5,3条质粒带,且4株菌的质粒DAN分子大小不完全相同。

琼脂扩散法测定乳链菌肽效价的优化

对影响琼脂扩散法测定乳链菌肽效价的四个主要因素:琼脂浓度、Tween20、培养温度、预培养进行了研究。结果表明,0.75%琼脂的效价检测培养基、0.5% Tween20的添加以及30℃培养条件,可提高乳链菌肽效价测定的灵敏度和精确性;4℃预培养有利于乳链菌肽在琼脂中的扩散。

乳链菌肽产生菌的定向筛选及发酵产物的鉴定

利用乳链菌肽产生菌中nip^+nis^rsuc^+紧密连锁的原理,在添加乳链菌肽、蔗糖及溴甲酚紫的选择培养基上,从牛奶样品中定向筛选乳链菌肽产生菌。对筛选到的L. lactis1409菌株发酵产物的分析鉴定结果揭示:该产物对多种革兰氏阳性菌有强烈抑制作用,而对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌无效,在pH值低的条件下对热稳定,对α—胰凝乳蛋白酶敏感,具有生物活性的蛋白质的分子量与乳链菌肽相当,而1409菌株的质粒分布与L. laclisATCC11454和L. lactis 7962不同,说明筛选到的L. laclis 1409菌株确是一株新的乳链菌肽产生菌。

乳链菌肽高产菌株的选育及其基因定位

以乳酸乳酸球菌7962为原始菌株,用紫外线、LiCl、(60)~Co及8-MOP+NUV等多种理化诱变剂对其进行诱变处理,获得一株乳链菌肽高产突变株AL2。其效价稳定在2300～2500Iu/ml。经DNA杂交证实,编码乳链菌肽的前体基因位于染色体上,其遗传性状是稳定的。毒理试验表明AL2及其产物属于实际无毒类物质。

乳酸乳酸球菌AL2产生的乳链菌肽的提纯和性质

用NaCl饱和的乳酸乳酸球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis)AL2发酵液经正丙醇提取和CM-Sephadex C-25柱层析,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的乳链菌肽组分,比活力从24427IU/mg提高到39865IU/mg,活力回收为41.7％。α—胰凝乳蛋白酶可使乳链菌肽丧失活性;在低pH条件下,乳链菌肽对热较稳定;对许多革兰氏阳性菌有强烈抑制作用,而对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌没有作用。

乳链菌肽前体基因(nisZ)在乳酸乳球菌中的克隆和表达

用ＰＣＲ技术从克隆有完整乳链菌肽生物合成基因簇（来自于乳链菌肽高产菌株Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ＡＬ２）的重组噬菌体λＨＪ－３中扩增了编码乳链菌肽的前体基因，与ｐＭＧ３６ｅ连接得到重组质粒ｐＨＪ２０１，用电击转化法将ｐＨＪ２０１转化到Ｌ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ９８００中，经活性测定和Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳证实乳链菌肽前体基因获得了功能表达．ＤＮＡ序列分析表明乳链菌肽高产菌株Ｌ ｌａｃｔｉｓ ＡＬ２产生的是ＮｉｓｉｎＺ．发现ｐＨＪ２０１在Ｌ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ９８００中有良好的稳定性。

乳链菌肽高产菌株AL2的发酵条件研究

对乳链菌肽高产菌株ＡＬ２的发酵条件进行了研究，发现３０℃是产乳链菌肽的最适温度；蔗糖和酵母膏是最佳的碳、氮源，浓度分别为０．５％和１％。发酵培养基起始ｐＨ为６．５；锰离子对乳链菌肽的产生有促进作用，而铜离子却有严重的抑制作用。

分光光度法快速测定乳链菌肽效价

为了解决琼脂扩散法测定乳链菌肽效价时间长的问题,引进了分光光度测定法。确定的测定工艺为:藤黄微球菌接种接种龄为指数期的中后期、接种量为10%的,加入待检样品在温度33℃、转速150r/min的摇床培养5h,600nm波长下测定吸光度值,通过乳酸菌肽浓度与检测菌吸光度之间的函数关系准确测量乳酸菌肽的效价。重复测定的最大相对误差在±5%以内。

乳酸乳球菌发酵液中乳链菌肽的分离纯化

对乳酸乳球菌乳酸亚种SQ80随pH的改变吸附乳链菌肽的规律进行了研究,pH6.5时吸附率达91.5%,pH3以下吸附率为0。通过调整pH,使乳酸乳球菌选择性地吸附、释放乳链菌肽,达到了较好的分离纯化效果,HPLC检测显示单一尖峰,乳链菌肽回收率58.2%,纯化倍数75。

乳链菌肽发酵玉米浆-糖蜜培养基的优化制备

采用单因素试验方法对影响乳链菌肽效价的培养基组分进行了考察。结果表明,影响乳链菌肽效价的主要因素为糖蜜、玉米浆、K2HPO4、MgSO4。在此基础上,采用Box-Behnken设计及响应面分析法确定主要影响因子的最佳质量浓度。结果表明,当玉米浆质量浓度为233 g/L,糖蜜质量浓度为27 g/L,K2HPO4质量浓度为5.0 g/L,MgSO4质量浓度为0.1 g/L时,乳链菌肽效价为2491.8 IU/mL,与预测值2511.1 IU/mL基本一致。

乳链菌肽的研究现状及应用进展

对乳链菌肽分子的结构和特性、抑菌机理、生物测定方法及其在食品中的应用研究进行了综述,并对其应用前景进行了展望,为乳链菌肽的进一步研究提供参考。

乳酸菌的细菌素及乳链菌肽在食品工业中的发酵与应用

乳酸菌的细菌素是具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物 ,其中乳链菌肽是一种广泛应用的高效、无毒的天然食品防腐剂。

乳链菌肽发酵工艺的研究

对于乳链菌工艺，考察了发酵温度、接种量、发酵液初始pH值、发酵过程pH值变化等的影响。实验结果表明，发酵温度30℃，接种量5％～6％（vol），发酵液初始pH值7．5时，乳链菌肽发酵液效价较高。采用流加浓度为5mol／L的NaOH溶液，将发酵液pH值控制在6．20～6．25，发酵液效价可稳定于6500-7500IU／mL，是没有流加碱液发酵的2．5倍。

乳链菌肽在乳制品防腐保鲜中应用的研究

叙述了乳链菌肽这种天然食品防腐剂在奶制品中的应用及注意事项

乳链菌肽发酵的主要影响因子

采用中心组合实验设计方法（ＣｅｎｔｒａｌＣｏｍｐｏｓｉｔｅＤｅｓｉｇｎ），运用ＳＡＳ统计分析软件，得到了乳链菌肽发酵单位与主要影响因子之间的回归方程：ＹＩＵ＝１０８７．１７＋６２．８６Ｘ１＋７６．１８Ｘ２＋５５．４１Ｘ４－２３．３５Ｘ１１．６２Ｘ－１５．６７Ｘ２Ｘ４．根据方程及其岭岭分析结果，设计出含氮量较低的培养基ＳＹＳ３．同ＣＭ培养基相比，原料成本相差不大，但发酵单位提高了６４％．同ＭＲＳ培养基相比，虽然氮源含量降低了约５０％；发酵水平却相当，同时发酵液中残留的杂蛋白减少可以降低杂蛋白对Ｎｉｓｉｎ提取的干扰作用．

应用统计学分析方法优化乳链菌肽发酵培养基

以 CM 培养基为基础,采用 Plackett-Burman 设计法对影响乳链菌肽液体发酵培养基的组分(蔗糖,蛋白胨,酵母膏,K_2HPO_4,NaCl 和 MgSO_4·7H_2O)进行了筛选,发现影响乳链菌肽效价的关键因素为蔗糖,蛋白胨和 K_2HPO_4,然后采用最陡爬坡实验逼近3个关键因素的最大响应区域,得出合适的中心点为蔗糖15.8 g/L,蛋白胨19.0 g/L,K_2HPO_4 18.3 g/L。在此基础上,采用 Box-Behnken 设计结合响应面法对影响乳链菌肽效价的关键因素最佳水平作了进一步的研究,最优的培养基组分为蔗糖17.3 g/L,蛋白胨17.0 g/L,K_2HPO_423.0 g/L,酵母膏10.0 g/L,NaCl 2.0 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.2 g/L。在此培养条件下.得到乳链菌肽效价为6 033 IU/mL,是优化前的4.48倍。

乳酸乳球菌AL2基因文库的构建及乳链菌肽生物合成基因簇的筛选

用本实验室获得的乳链菌肽高产菌株乳酸乳球菌AL2总DNA为供体 ,以λEMBL3为载体 ,构建了该菌株的基因文库 ,共获得 390 0多个噬斑。通过Southern杂交、PCR扩增及DNA序列测定 ,证实从该文库中筛选到一个含有完整乳链菌肽生物合成基因簇的重组噬菌体λHJ 3。