锌离子对CHO细胞IgG2抗体表达及二硫键异构体分布的影响

目的:研究Zn^(2+)对中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)生长、IgG2表达及其二硫键异构体分布的影响。方法:补料分批培养外分泌IgG2的CHO细胞株中,分别添加不同浓度的葡萄糖酸锌,每天监测细胞密度以及活率;培养14 d后离心除细胞得上清液,通过生化分析仪测定上清液中IgG2含量,之后应用蛋白A磁珠亲和得到IgG2纯化样品,非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(nrCE-SDS)、阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测IgG2二硫键异构体分布。结果:25~200μmol/L浓度条件下,Zn^(2+)对于CHO细胞生长,活率维持以及IgG2抗体的表达均有一定的负面影响,并与Zn^(2+)浓度具有负相关性;而Zn^(2+)的添加能够显著提高IgG2二硫键异构体中IgG2-B亚型的比例,下调IgG2-A和IgG2-A/B两种亚型比例。其中100μmol/L Zn^(2+)效果最明显,IgG2-B比例提高近10个百分点。结论:Zn^(2+)能够抑制CHO细胞生长以及IgG2表达,同时Zn^(2+)对二硫键异构体的调控至关重要。

帕尼单抗中二硫键异构体的鉴定及生物活性分析

目的帕尼单抗是一种IgG2亚类抗体,已用于转移性结肠癌的临床治疗。然而尚没有研究对帕尼单抗中二硫键异构体的构成和活性进行分析鉴定。本实验将建立对帕尼单抗二硫键异构体鉴定并富集的方法,进一步分析异构体间的生物学活性差异。方法利用反相色谱分析帕尼单抗中二硫键异构体的构成;通过氧化还原处理富集A型和B型,并利用分子筛色谱对分离得到的异构体进行分析鉴定;进一步利用细胞杀伤实验对异构体的生物学活性进行评估。结果反相色谱结果表明,帕尼单抗中A型、B型和A/B型比例分别为38%、32%及30%;分子筛色谱结果显示A型的分子半径较之B型更大;细胞杀伤实验表明帕尼单抗的A型具有较B型更强的抑制肿瘤生长效能。结论本实验建立了对帕尼单抗二硫键异构体进行鉴定、富集及分析的方法,有助于进一步增进对IgG2亚类二硫键异构体结构和功能的理解,为IgG2亚类治疗性抗体的生产工艺优化和质量控制提供有益参考。

α-芋螺毒素TxID异构体对人类乙酰胆碱受体的活性研究

研究α-芋螺毒素Tx ID 3个二硫键异构体对人类α3β4与α6/α3β4乙酰胆碱受体的阻断活性。采用Fmoc固相合成法,分别合成α-芋螺毒素Tx ID的3个二硫键异构体的线性肽,利用2步氧化法进行氧化折叠,获得具有定点连接二硫键的异构体多肽。利用非洲爪蟾卵母细胞表达人类α3β4与α6/α3β4乙酰胆碱受体亚型,测定3个异构体对该乙酰胆碱受体的电流与洗脱速率的影响情况。α-芋螺毒素Tx ID的3个二硫键异构体对人类α3β4与α6/α3β4乙酰胆碱受体亚型的阻断活性差异很大,阻断是可逆的,洗脱速率较快。其中具有天然构象的球状异构体活性最强,其半数阻断剂量(IC50)仅约为9.3 nmol/L;其次是带状异构体具有很微弱的抑制活性,其IC50大于5μmol/L;而珠子状异构体几乎没有阻断活性,其IC50大于10μmol/L。成功合成了α-芋螺毒素Tx ID的3个二硫键异构体,并获知了3个二硫键异构体分别对人类α3β4与α6/α3β4乙酰胆碱受体亚型的阻断活性,为α-芋螺毒素Tx ID后续海洋新药研发提供理论基础。

类胰岛素生长因子-1的C结构域不影响胰岛素二硫键的热力学稳定性

胰岛素和类胰岛素生长因子-1（IGF-1）都属于胰岛素超家族,两者不但一级、三级结构有较高的同源性,而且生理功能也有少量交叉.然而两者的折叠行为却有很大的差别:胰岛素及其重组前体（PIP）只折叠成一种热力学稳定的二硫键配对,而IGF-1却折叠成两种热力学稳定的二硫键异构体.为了了解两者折叠行为差异的分子机制,制备了由胰岛素的A,B 链和IGF-1的C结构域构成的单链杂交分子——[B10Glu]Ins/IGF-1（C）,研究了该杂交分子二硫键的热力学稳定性以及它在含有少量流基试剂的变性剂中的解折叠程度,同时还纯化了该杂交分子一种主要的非天然二硫键异构体,并研究了它的再折叠情况.观察到IGF-1中C结构域的引入并未改变胰岛素分子的折叠热力学,但是影响了折叠的动力学过程.

α-芋螺毒素TxIB异构体对大鼠和人类α6/α3β2β3乙酰胆碱受体的拮抗活性研究

目的研究α-芋螺毒素TxIB 3个二硫键异构体对大鼠和人类α6/α3β2β3乙酰胆碱受体(nAChRs)的拮抗活性。方法采用Fmoc固相合成法,分别合成TxIB的3个二硫键异构体。利用非洲爪蟾卵母细胞分别表达大鼠和人类的α6/α3β2β3n AChRs,分别测定3个异构体对它们的拮抗活性。结果成功合成了TxIB的3个二硫键异构体,并通过超高效液相色谱(UPLC)与基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱进行了鉴定,且为正确。α-芋螺毒素TxIB的3个二硫键异构体在UPLC的洗脱出峰时间差异明显,其亲水性顺序分别为球状异构体(globular)>带状异构体(ribbon)>珠子状异构体(bead)。质谱鉴定它们的相对分子质量完全一样,且与理论相对分子质量一致。大鼠与人类α6/α3β2β3 nAChRs在非洲爪蟾卵母细胞中获得了有效表达,并用该技术体系测知了TxIB的3个二硫键异构体的拮抗活性。其中,TxIB的球状异构体活性最强,对大鼠与人类α6/α3β2β3 nAChRs的拮抗活性极其相似,其半抑制浓度(IC_(50))分别为28.2与32.0 nmol·L^(-1)。而带状异构体和珠子状异构体对大鼠与人类α6/α3β2β3 nAChRs几乎没有拮抗活性,其IC_(50)>10μmol·L^(-1)。结论本实验人工合成的TxIB球状异构体对大鼠与人类α6/α3β2β3 nAChRs具有高选择性强拮抗活性,这为后续TxIB新药研发提供了研究基础。