棉花抗黄萎病相关基因筛选与亚克隆文库构建

以黄萎病菌诱导下差异表达的棉花抗病相关基因片段PR8为探针，利用杂交方法，对优质、抗病海岛棉品种Pima90—53BAC文库进行筛选。从30336个BAC克隆中筛选到含有PR8基因片段的4个阳性克隆，分别为127K13，128D14，169J3和178C5。用Sau3AI对其中的169J3克隆进行酶切，回收2—4kb的DNA片段并连接到载体pUCI18BamHI—BAP上，构建了含有该基因片段的亚克隆文库，共含有4224个克隆。经电泳检测，插入片段在1．3kb，平均为2kb。该亚克隆文库的构建为克隆PR8基因奠定了基础。

免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库基因的亚克隆与鉴定

目的亚克隆免疫筛选日本血吸虫ｃＤＮＡ文库得到的基因。方法在体外将血吸虫ｃＤＮＡ文库基因的ＰＣＲ产物和ｐＧＥＭＴ载体连接，转染大肠杆菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ，经抗生素及呈色底物Ｘｇａｌ粗筛，再用限制性内切酶及ＰＣＲ方法进一步鉴定。结果成功地将文库中４个大小不同的日本血吸虫基因片段连接到载体中，获得４个重组子。结论为可能编码保护性抗原的血吸虫基因测序和将其亚克隆入真核表达质粒奠定基础。

粉尘螨Ⅰ类变应原的cDNA克隆测序及亚克隆

目的 获得粉尘螨I类变应原 (Derf 1)cDNA克隆及亚克隆 ,并进行测序。 方法 设计合成引物 ,从粉尘螨体内提取RNA ,经逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)获得cDNA ,PCR扩增目的片段经纯化回收后克隆至pMD 18T ,转化大肠埃希菌 (E .coli)JM10 9,经PCR初筛挑选阳性克隆并测序 ,将PCR筛检阳性重组子及pET 3 2a( +)表达载体分别用BamHⅠ和SacⅠ双酶切 ,连接转化至E .coli感受态细胞JM10 9中过夜培养 ,挑选菌落进行酶切鉴定。 结果 从粉尘螨基因组RNA中扩增出Derf 1基因 ,获得pET 3 2a( +) Derf 1亚克隆 ,酶切产物的大小与预期相符。 结论 对粉尘螨Derf 1基因进行体外扩增并获得pET 3 2a( +) Derf 1亚克隆。

苏云金杆菌δ-内毒素基因及3′末端缺失基因在大肠杆菌和农杆菌中的亚克隆和表达

苏云金芽孢杆菌变种Bacillus thuringiensis aizawai 7-29 δ-内毒素基因及其3′末端缺失基因,亚克隆到质粒pUC19上,构建了pUCF33和pUCK63重组质粒。进一步将δ-内毒素基因及其3′端缺失基因,插入到植物表达载体pBI121.2质粒中,构建了pGY61和pGYCK63重组质粒。用^(32)中标记的δ-内毒素3′末端缺失的Kpn I DNA片段的探针,与重组质粒进行DNA-DNA分子杂交,结果阳性。带有全长和3′末端缺失重组质粒,转入大肠杆菌HB101和农杆菌LA4404受体细胞中,其克隆子细胞抽提物,对大菜粉蝶和玉米螟幼虫均具有杀虫生物活性。结果证明δ-内毒素基因不仅能在大肠杆菌HB101中,而且能在农杆菌LA4404中表达。

Rubisco小亚基基因片段的亚克隆及其瞬时表达载体的构建

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶位于植物叶绿体中,是绿色植物中含量最丰富的蛋白,它催化CO2固定和光呼吸作用的第一步。从含Rubisco小亚基基因片段的pGR107-rbcS质粒中亚克隆出Rubisco小亚基基因片段,将PCR产物与pGEM-T Easy载体连接,用EcoRI酶切鉴定酶切重组载体,利用低溶点胶回收大约300bp大小的Rubisco小亚基基因片段,将其回收片段与pSLJ75515瞬时表达载体连接,用EcoRI酶切鉴定,筛选出阳性重组体,即为pSLJ75515-rbcS瞬时表达载体。本实验为进一步研究Rubisco小亚基基因功能和基因沉默机制奠定了基础。

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因在真核表达载体中的亚克隆

目的 将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)基因片段克隆到真核表达载体pBKCMV中,以便对其进行核酸疫苗的研究。方法 特定寡核苷酸引物的设计和合成,TRIZOL试剂提取日本血吸虫成虫RNA,RTPCR法扩增GST基因编码序列,将扩增产物连接pGEMT克隆载体,再亚克隆到真核表达载体pBKCMV中。结果 RTPCR法特异性扩增出SjGST编码基因片段,其大小约为670bp,经双酶切、PCR鉴定表明所构建的质粒pGEMTGST和pBKCMVGST中含有目的基因。结论 pBKCMVGST重组质粒的成功构建,为进一步表达GST及其在血吸虫病免疫诊断、免疫预防中的作用研究提供了条件。

大肠杆菌菌毛抗原K_(99)基因的亚克隆及核苷酸序列测定

利用PCR技术 ,从含有大肠杆菌菌毛抗原K99基因的质粒pX5K中扩增出 0 .4kb的K99菌毛抗原基因 ,然后将其亚克隆到pGEM T easy载体上 ,并转化至受体菌JM10 9中 ,采用碱性裂解法提取质粒DNA后 ,经NcoI和EcoRⅠ双酶切分析和核苷酸序列分析 。

LRP16基因启动子的亚克隆及表达调控载体的构建

目的 :为深入研究LRP16基因的表达调控机制 ,克隆及亚克隆了LRP16基因的启动子序列 ,构建LRP16基因启动子表达调控载体。方法 :在NCBI的人类基因组数据库中截取并下载LRP16基因转录起始位点 5′侧翼区约 3kb的基因组序列设计PCR扩增引物 ,从健康外周血中扩增获得该片段 ,以此序列为基础进行亚克隆 ,分别获得 6条 5’端不等、3’端平齐的片段 ,最后插入用于表达调控研究的 pGL3 Basic载体。 结果 :获得了 7条长度依次差别约为 4 0 0bp的LRP16启动子克隆 ,分别构建了调控荧光素酶报告基因的真核表达载体。结论 :上述载体的成功构建为信息资源与实验手段的有效结合克隆启动子序列提出了一种模式 。

日本血吸虫Mf1和胞质氨基肽酶基因的亚克隆表达与免疫保护效果测定

目的 在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)Mf1蛋白和胞质氨基肽酶 (cytosolaminopeptidase ,CA) ,并对表达产物进行免疫保护效果测定。 方法 将SjMf1基因和SjCA基因亚克隆至 pGEX - 5X - 3载体 ,转化入感受态大肠杆菌ER2 688,在IPTG诱导下进行表达 ,表达产物免疫小鼠 ,免疫用抗原剂量为 50 μg/次 /鼠 ,免疫 3次后进行攻击感染 ,观察诱导产生的减虫效果。结果 在IPTG诱导下 ,表达载体中的SjGST基因与重组的SjMf1基因和SjCA基因在大肠杆菌中获得了高效表达 ,形成SjGST -Mf1和SjGST -CA融虫蛋白 ,用这两种融合蛋白免疫小鼠 ,分别诱导产生了 39 1 5 %和 2 6 57%的减虫率。结论 SjMf1和SjCA基因亚克隆至pGEX - 5X - 3载体后可在大肠杆菌中高效表达 。

卫氏并殖吸虫基因片段的亚克隆及其表达的研究

目的:获得诊断肺吸虫病的特异性重组抗原,以了解其作为免疫诊断抗原的价值。方法:将免疫筛选获得的卫氏并殖吸虫基因克隆双酶切,所得cDNA片段亚克隆入表达载体pRESETB,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Westernblotting)对表达产物进行鉴定。结果:成功地将文库中2个大小不同的卫氏并殖吸虫基因片段连接到载体中。其中Pw-2重组子特异性表达产物是分子质量约为32ku的蛋白带,可被卫氏并殖吸虫免疫兔血清特异性识别。结论:成功构建了编码卫氏并殖吸虫特异性抗原的重组克隆Pw-2。

苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关DNA片段的亚克隆和测序分析

将苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti) 0 4 2B与耐盐有关的 4kbClaⅠDNA片段克隆在 pML1 2 2上 ,用HindⅢ酶切下其 2 4kbDNA片段 ,回收后与 pBBR1 MCS2连接 ,然后转化大肠杆菌 (Escherichiacoli)DH5α,筛选到转化子GS2。将残留在 pML1 2 2上 1 6kbClaⅠ HindⅢDNA片段连同质粒一起回收 ,让其自连 ,转化大肠杆菌S1 7- 1 ,得到转化子GS0。以GS0为供体 ,0 4 2B的盐敏感突变株GZ1 7为受体 ,进行二亲本杂交 ,没有得到接合子。以GS2为供体 ,GZ1 7为受体 ,在辅助质粒pRK2 0 1 3的协助下 ,进行三亲本杂交 ,筛选到接合子GG2 ,获得 2 4kbHindⅢ与耐盐有关的DNA片段。将此片段连接到测序载体 pGEM 7Zf(+)上进行测序。测序结果表明 ,该 2 4kbHindⅢDNA片段含有 3个开放阅读框 (ORF)。在此基础上再一次亚克隆 ,获得 1 9kb与耐盐有关的DNA片段。

鲤鱼（Cyprinus carpio）生长激素基因的亚克隆及其序列分析

本文对ＰＣＲ扩增的６６８ｂｐ的ＤＮＡ片段进行了亚克隆，，然后以Ｓａｎｇｅｒ双脱氧中止法为原理，利用美国ＡＢＩ公司３７０Ａ自动核酸序列分析仪，确定了６６８ｈＰ的核苷酸序列。序列分析表明鲤鱼生长激素基因的开放读框含有６３０ｂｐ，并推测其中包括２２个氨基酸的信号肽和１８８个氨基酸的成熟多肽。鲤鱼生长激素基因的酶切图谱和序列分析的结果都证明我们已获得了全长的鲤鱼生长激素基因。

应用滤纸吸附-PCR法和改进的亚克隆方法快速筛选克隆甜橙细胞壁酸性转化酶基因(CS-CWI)

根据GenBank中已知的植物细胞壁转化酶基因的保守区序列设计一对PCR引物,分别以滤纸(吸附有甜橙基因组噬茵体文库LB平板的噬菌体)和Top agarose(滤纸吸附后的LB平板)的SM洗脱液为模板,仅通过7次PCR就快速、准确、经济地筛选出CSCWI阳性克隆。提取该阳性克隆的DNA并进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,通过PCR方法鉴定阳性酶切条带并回收,利用Taq DNA聚合酶的聚合活性和3’末端转移酶活性,改变该片段使其含有3’腺苷酸(A)突出末端,与pUCm-T载体实现了高效连接。阳性噬菌斑克隆及阳性条带的正确性得到测序的验证,表明滤纸吸附-PCR法和改进的亚克隆方法可正确和高效地应用于PCR筛选文库和亚克隆。

赖型钩体重组质粒pDJH_2亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

为了探讨ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ０１７株钩体ＤＮＡ片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的候选，采用重组ＤＮＡ技术，将ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂＤＮＡ片段分别与ｐＴ７－７，ｐＲＳＥＴ系列重组，转化入大肠杆菌进行亚克隆，ＩＰＴＧ诱导表达。结果显示：阳性亚克隆ｐＤＪｔ．ｐＤＪｒＢ１能在大肠杆菌中高效表达；对其进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可见６８ｋｄ和２３ｋｄ处出现新带，与钩体０１７株外膜同分子量蛋白带位置一致，免疫印迹（特异性抗０１７株外膜抗血清）在６８ｋｄ和２３ｋｄ处分别有印迹；用ｐＤＪｔ亚克隆重组质粒主动免疫豚鼠，可抵抗强毒力株攻击，表现出免疫保护作用。本实验结果提示：（１）ｐＤＪＨ２１．９ｋｂ重组ＤＮＡ片段能以不同质粒为载体，在不同大肠杆菌株中高效表达；（２）该重组ＤＮＡ片段表达产物——６８ｋｄ和２３ｋｄ蛋白，可能是赖型钩体０１７株外膜的保护性抗原。

GNA成熟蛋白基因亚克隆及其原核表达载体构建

雪花莲外源凝集素 (GNA)对刺吸式昆虫和某些咀嚼式昆虫以及多种线虫均有毒性。从含GNA前体蛋白基因的质粒中亚克隆出GNA的成熟蛋白基因MGNA ,将MGNA基因插入大肠杆菌表达载体pET2 2b的不同位点 ,再经测序验证 ,得到了三种不同表达形式的GNA原核表达载体 :2 2bG1 (分泌型融合GNA蛋白 )、2 2bG2 (包涵体型GNA蛋白 )、2 2bG3(分泌型天然GNA蛋白 ) ,这为进一步在大肠杆菌中表达GNA和将GNA制成生物农药奠定了基础。

人免疫缺陷病毒基因的亚克隆

艾滋病相关病毒(ARV-2)是目前应用最广的艾滋病毒分离株之一.其基因组大小为9737碱基.为便于研究工作,作者对其进行了亚克隆.用Kpn I消化pARV-2/7A产生4个DNA片段,其中含有env基因和pUC19序列的大片段自身环化,得到亚克隆质粒pJE332.其余3个片段分别与pUC19连接,得到另3个亚克隆质粒pJG423,pJP 032和pJP163.其中pJG423含有LTR序列、gag基因和部分pol基因,pJp032和pJP163均插入了部分pol基因.这些亚克隆质粒已被用于各项艾滋病研究.

TCR Vβ8+IL-2/pcDNA3.1亚克隆重组质粒的构建

目的:构建TCR Vβ8 ＋IL－2/pcDNA3.1亚克隆重组质粒。方法:先将TCR Vβ8克隆人克隆载体pUC19,分别酶切 IL－2/pUC19和 TCR Vβ8/pUC19,将 IL－2连接到TCR Vβ8/pUC19重组质粒上,然后将 TCRVβ8＋ IL－2基因从 TCR Vβ8+IL－2/pUC19重组质粒上酶切下,克隆入pcDNA3．1表达载体上。结果和结论:经测序证实成功地构建了 TCR Vβ8＋IL－2/pcDNA3．l亚克隆重组质粒。

乙型肝炎病毒的亚克隆及其应用

目的 应用酶切pBP32 2 HBV ,回收HBVDNA ,将其克隆到高拷贝载体 ,获得亚克隆株 pUC19 HBV ,再酶切、HBVDNA标记探针 ,核酸杂交检测临床血清标本 72份 ,与定量PCR ,定性PCR方法对比。方法 由此获得了亚克隆株pUC19 HBV ,用地高辛标记的HBVDNA探针杂交、定量PCR、定性PCR方法同时检测临床血清标本 72份。结果 阳性标本份数分别为 40、5 1、49份 ,阳性率分别为 5 5 6 %、70 8%、6 8 1%。阳性符合率分别为 88 9%、84 6 %、80 8%。结论 3种HBV核酸检测方法的比较 ,以定量PCR法最为敏感 。

虹鳟鱼(Salmo grairdneri Richard)基因文库的构建及生长激素基因的克隆和亚克隆

以噬菌体EMBL3作为载体,构建了虹鳟鱼的全基因文库,制备了包装蛋白效率达4.6×10~8Pfu/μgDNA.基因文库重组噬菌的量为8.2×10~5pfu/μgDNA.同时用含虹鳟鱼生长激素基因cDNA的pAF-51△S作为探针,从该文库中筛选出两个阳性噬斑,复筛获得90％以上的阳性斑。并从阳性克隆中回收虹鳟收生长激素基因片段为6kb,亚克隆到puc-18质粒中,进行了酶切分析。

基因xylE编码的邻苯二酚2，3－双加氧酶在大肠杆菌中的亚克隆与高表达

目的：构建ｘｙｌＥ基因高表达菌株，为快速检测芳香类化合物污染提供可能。方法和结果：通过ＰＣＲ扩增，将位于质粒ｐＴＧ４０２上的ｘｙｌＥ基因进行扩增，克隆于ｐＵＣ１１８Ｎ和ｐＵＣ１１９Ｎ上，经双向测序，证明ＰＣＲ过程中并未发生突变，然后进一步克隆于高表达载体ｐＪＬＡ５０３，转化Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１，经４２℃诱导，获得了高表达的基因产物，表达量占全菌总蛋白的３４．２％。结论：ｘｙｌＥ基因在大肠杆菌中获得了高表达。