家畜反刍动物瘤胃产甲烷菌研究进展

甲烷是温室气体之一,其来源之一是反刍动物瘤胃产甲烷菌利用二氧化碳、氢气、乙酸和甲基类等物质发酵产生;在畜牧业中,甲烷排放量的增加也预示着饲料的利用率降低。研究反刍动物瘤胃产甲烷菌群落结构有助于明确瘤胃产甲烷菌的甲烷代谢机理,进而为如何降低养殖中甲烷等温室气体的排放量、提高饲料的利用率提供理论基础。本文主要是对反刍动物瘤胃产甲烷菌群落结构研究方法、菌群群落组成、甲烷代谢机理和影响群落结构因素等方面进行综述,并对未来研究内容提出展望。

新型产甲烷菌系提高极限含水油藏采收率技术

我国东部老油田已整体进入特高含水开发阶段,呈含水上升快、采油速度低、水驱效益低等开发特征,现有提高采收率技术已无法实现原油的经济采出,亟需建立接替技术。为此,以胜利油田某聚驱后油藏为试验区,开展了油藏菌群结构分析、新型产甲烷菌系的激活产气、油藏适应性及驱油性能研究,探索新型产甲烷菌系在这类油藏的应用潜力。研究结果显示,试验区油藏具有丰富的石油烃降解菌,有利于生物气化技术的实施。模拟试验区油藏条件下,新型产甲烷菌系与油藏内源微生物有较好的相容性,90 d每克原油的产气量达到3.12 mmol,是单独激活油藏微生物产气量的4.5倍,且产生的气体中甲烷气占比达到78%。菌群结构分析显示,新型产甲烷菌系占比达到35.9%,是产气速率大幅提升的关键。适应性研究结果显示,在油藏温度低于65℃、原油黏度小于1 356 mPa·s条件下,新型产甲烷菌系均展示了良好的产气性能。利用实验室设计的物理模型,评价了该菌系产气提高驱油性能,结果显示,注入该菌系后产气作用有效动用了模型顶部的剩余油,极限含水条件下驱油效率提高5.4个百分点;在此基础上提出了生物气化技术提高极限含水油藏采收率的机理。

产甲烷菌中汞甲基化研究进展与展望

微生物作用是无机汞转化为甲基汞最主要的方式.其中,硫酸盐还原菌和铁还原菌被认为是主要的汞甲基化微生物,近年来的研究表明,产甲烷菌在汞甲基化过程中同样发挥重要作用.产甲烷菌参与沉积物、水体和土壤等多种环境中的汞甲基化过程,并在部分环境中主导甲基汞的生成;在实验室纯培养体系中,多个产甲烷菌能将10%以上的无机汞转化为甲基汞.产甲烷菌对于甲基汞的生成至关重要,然而目前缺乏对产甲烷菌汞甲基化作用的系统总结.本文分别从原位环境、纯培养和共培养的角度,详细阐述了产甲烷菌在汞甲基化中的作用.在此基础上,对产甲烷菌可能的汞甲基化途径进行探讨,提出汞甲基化过程与一碳代谢极大可能存在功能上的关联性,并展望了后续研究的方向和重点.

鸟岛湿地土壤产甲烷菌群落对不同降水梯度的响应

产甲烷菌在湿地CH4排放过程中发挥着重要作用,降水格局的改变已经并将持续影响湿地生态系统的结构与功能,进而对湿地CH4排放过程产生影响。本研究以青海湖鸟岛湖滨湿地为研究对象,设置5个降水梯度处理,并利用mcrA扩增子测序技术对土壤产甲烷菌进行检测,探究鸟岛土壤产甲烷菌群落特征对不同降水梯度的响应。结果表明,鸟岛土壤产甲烷菌群落的优势菌目为甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales)。FAPROTAX功能预测显示土壤中氢营养型产甲烷菌占优势,由此推测H_(2)/CO_(2)还原为鸟岛土壤CH_(4)产生的主要途径。LEfSe分析表明,5个降水梯度共存在31个差异菌群,以增雨50%处理下差异菌群数量最多,从目水平到种水平共有10个差异菌群。整体而言,鸟岛土壤产甲烷菌的群落多样性较为稳定,而群落结构对降水变化的响应较为敏感,部分菌群的相对丰度发生了显著变化(P <0.05)。研究结果可为预测降水变化对鸟岛湿地土壤碳循环的影响提供一定的参考依据。

不同进料频率对丙酸产甲烷菌群富集的影响

针对厨余垃圾在低频进料模式下进行厌氧消化过程中易积累丙酸导致系统失稳的问题,以丙酸钠为唯一碳源,在不同进料频率(R1、R2、R3和R4四组试验,分别为每天、每2 d、3 d和4.5 d进出料100、200、300和450 mL)下采用半连续进料模式驯化富集丙酸产甲烷菌群,探究不同进料频率对厌氧消化系统运行过程中产气量、TAN浓度、挥发性脂肪酸等组分变化以及微生物群落结构的影响;同时利用修正的Gompertz模型分析不同进料频率下厌氧消化系统累计产甲烷动力学特性。结果表明:每3 d进料频率系统能够克服较大的丙酸负荷〔1.5 g/(L·d)期间〕冲击,平均日产甲烷量为409.82 mL,优于其他进料频率。比较各组模拟的动力学特性发现,在参数研究范围内,丙酸厌氧消化系统迟滞时间随着进料频率的升高而减小。不同进料频率下微生物群落结构分析表明,在第60天时R1、R2、R3和R4四组中具有丙酸氧化功能的菌属的相对丰度从5.19%分别增至13.55%、13.64%、9.31%和8.41%,氢养型产甲烷菌Methanoculleus在R1、R2、R3和R4四组厌氧消化系统中的相对丰度分别为33.63%、29.96%、41.77%和41.47%。研究显示,与每天进料频率的厌氧消化系统相比,每2 d、每3 d和每4.5 d进料频率的系统在较大丙酸瞬时负荷冲击下均有效地促进了丙酸产甲烷菌群的富集和保留,且综合评估后,每2天或每3天进料系统的促进效果较优。

不同日龄内蒙古白绒山羊瘤胃及粪便产甲烷菌多样性研究

本试验旨在测定不同日龄内蒙古白绒山羊瘤胃及粪便产甲烷菌的多样性。选取10、30、50、150日龄内蒙古白绒山羊各3只(每只为1个重复)进行屠宰,采集瘤胃液及粪便。采用特异性引物扩增瘤胃和粪便产甲烷菌总DNA片段,用Illumina Miseq PE300平台进行测序。结果表明:24个样品共获得419970条优化序列,每条序列平均长度为416 bp;瘤胃和粪便中的产甲烷菌总OTU数目在30日龄时稍有降低,共同产甲烷菌OTU数目随日龄逐渐减少,且同日龄瘤胃中产甲烷菌OTU数目均大于粪便;30日龄时瘤胃中产甲烷菌多样性高于粪便(P<0.05);10、30、50、150日龄时,瘤胃及粪便门水平产甲烷菌优势菌均为Norank_d_细菌和广古菌门;瘤胃中广古菌门主要由甲烷短杆菌属、Norank_甲烷微菌目组成,粪便中主要由甲烷球形菌、甲烷短杆菌属组成;150日龄时瘤胃广古菌门丰度高于10、50日龄组(P<0.05),Norank_甲烷微菌目丰度高于其他日龄组(P<0.01),而Norank_d_细菌丰度低于50日龄组;10、30、50、150日龄时粪便中丰度最高的菌群均为Norank_d_细菌;门、属水平上,10日龄瘤胃和粪便中未分类菌丰度均高于其他日龄组(P<0.05);LefSe分析发现,150日龄时瘤胃中富集了Norank_甲烷微菌目(P<0.05)。由此可见,随着羔羊的生长发育,瘤胃产甲烷菌主要为广古菌门,且以氢营养型产甲烷菌为主,而粪便以甲基营养型产甲烷菌为主;瘤胃和粪便中很多丰度较高且未分类的物种及其随日龄的变化规律需要进一步研究。

高产和低产奶牛甲烷产量和产甲烷菌多样性的比较研究

试验通过探究高产和低产奶牛不同泌乳阶段甲烷产量和产甲烷菌多样性的变化规律,从瘤胃微生物菌群结构变化的角度揭示高产和低产奶牛甲烷产量不同的原因,并将产甲烷菌的相对丰度与甲烷产量、产奶量和乳品质进行相关性分析。试验采用双因素试验设计,选用36头健康状况良好,体重、胎次和饲养管理条件相近的荷斯坦奶牛,按泌乳性能(高产、低产)和泌乳阶段(前期、中期、后期)分为高产泌乳前期组、高产泌乳中期组、高产泌乳后期组、低产泌乳前期组、低产泌乳中期组和低产泌乳后期组,每组6头奶牛。所有奶牛饲喂相同的全混合日粮。选用甲烷产量预测模型计算甲烷产量,运用高通量测序技术测定瘤胃产甲烷菌多样性。结果显示,高产奶牛甲烷产量显著低于低产奶牛(P<0.05),奶牛泌乳前期甲烷产量显著高于泌乳中期和后期(P<0.05)。高产奶牛瘤胃产甲烷菌Shannon指数显著低于低产奶牛(P<0.05),Ace指数、Chao指数和Simpson指数与低产奶牛无显著差异(P>0.05)。高产奶牛瘤胃甲烷球形菌属相对丰度显著高于低产奶牛(P<0.05),甲烷短杆菌属相对丰度显著低于低产奶牛(P<0.05)。奶牛泌乳前期和中期瘤胃甲烷球形菌属相对丰度显著高于泌乳后期(P<0.05),奶牛泌乳后期甲烷短杆菌属相对丰度显著高于泌乳前期和中期(P<0.05)。奶牛瘤胃甲烷球形菌属相对丰度与甲烷产量和乳脂率等呈显著负相关(P<0.05),与产奶量呈显著正相关(P<0.05)。研究表明,高产奶牛甲烷产量、瘤胃甲烷短杆菌属相对丰度低于低产奶牛,奶牛泌乳前期甲烷产量高于泌乳中期和后期。

碳酸氢盐对嗜氢和嗜乙酸产甲烷菌的影响机制

分别以H_2/CO_2和乙酸盐为底物,研究了HCO_3~–浓度([HCO_3~–])对厌氧活性污泥中嗜氢产甲烷菌(HM)和嗜乙酸产甲烷菌(AM)活性的影响,并从群落结构、反应动力学和热力学等方面进行了分析.结果表明,0.05~0.20mol/L的[HCO_3~–]对HM的产甲烷活性具有刺激作用,刺激浓度随着系统氢分压的升高而降低.但高[HCO_3~–](0.05~0.20mol/L)对AM的产甲烷反应有抑制作用.HM中的Methanobacterium formicium和AM中的Methanosarcina mazei是厌氧活性污泥的优势菌群.随[HCO_3~–]的升高,M.formicicum的丰度逐渐增加,而M.mazei的丰度则呈现先增加([HCO_3~–]￡0.10mol/L)后降低([HCO_3~–]30.15mol/L)的趋势.[HCO_3~–]可显著改变发酵体系的p H值和产甲烷反应的吉布斯自由能变化,进而影响HM和AM的产甲烷效能.

外源产甲烷菌降解褐煤产气实验

为研究外源菌降解褐煤产气能力,从厌氧消解污泥中提取产甲烷菌群,以褐煤为碳源进行菌种驯化,开展产气实验,并对驯化后菌群的产气影响因素进行实验研究。驯化实验发现:驯化后该菌群初始产气时间由驯化前的12 d缩短为6 d,且30d内产气总量增加了29.2%;经检测,生成气体主要为CH4和少量CO2,未检测到重烃气。产气影响因素实验表明:该菌群最佳产气初始培养基pH值为7.0,产气量分别约为初始pH值为6.4、7.4时的1.9倍和2.4倍;煤的粒径也是影响产气量的因素之一,表现为粒径越小,产气量越大,但产气量随粒径变小变化不明显;培养基本身产气量约占总产气量的50%,原因可能是其中添加了微量L-半胱氨酸(0.5g/L)和酵母浸出液(1 g/L)。

不同水稻土甲烷氧化菌和产甲烷菌数量与甲烷排放量之间相关性的研究

对不施用任何肥料的浙江黄松土 (发育于河流沉积物母质的水稻田土 )、老黄筋泥田土 (发育于第四纪红壤母质的水稻田土 )、青紫泥田土 (发育于滨海盐土母质的象山青紫泥水稻土 )中甲烷氧化菌、产甲烷菌种群数量及甲烷排放量之间关系作了研究。结果表明 ,甲烷氧化菌种群数量范围在 1 0 6～ 1 0 8cfu/g干土之间 ,其变化在 2个数量级范围内。产甲烷细菌种群数量变化较大 ,其范围在 1 0 3～ 1 0 7cfu/g干土之间。水稻田土壤的甲烷排放量受到甲烷氧化菌、产甲烷菌种群数量及其活性及土壤理化性状的影响。提出了当水稻田土壤的甲烷氧化菌种群数量在 1 0 8cfu/g干土、产甲烷菌种群数量在1 0 5cfu/g干土时 ,水稻田土壤几乎没有多余的 CH4 气体排放这一甲烷形成与甲烷氧化两类群微生物之间的数量关系。甲烷排放量也与土壤砂粒 (<0 .0 2 mm的砂粒 )含量呈正相关性 ,土壤砂粒含量越高 。

温度对产甲烷菌代谢途径和优势菌群结构的影响

产甲烷菌是严格厌氧的古菌,由其完成的产甲烷过程通常是厌氧微生物生化代谢中最重要的限速步骤。温度作为影响产甲烷菌的产甲烷速率重要因素,其变化会改变生物环境中的产甲烷的代谢途径和优势菌群分布。目前已知甲烷生物合成有3条途径:乙酸代谢途径、CO2还原途径和甲基营养型途径。理论上乙酸途径生成的甲烷约占甲烷生成总量的2/3,CO2还原产甲烷途径则约占1/3,甲基营养型途径只在少数情况下考虑其影响,例如盐湖。在低温条件下产甲烷菌以利用乙酸代谢为主;在中温条件下,产甲烷途径以乙酸代谢和H2/CO2还原一定比例存在;在高温和超高温条件下,以只利用CO2还原途径的菌群为主。

双季稻田甲烷排放与土壤产甲烷菌群落结构和数量关系研究

为揭示南方双季稻田甲烷排放与土壤产甲烷菌群落结构和数量的关系,监测了双季稻田甲烷排放规律,并采用PCR-DGGE和荧光原位杂交法(FISH)分别分析了水稻不同生育期土壤产甲烷菌群落结构和数量的变化特征。结果表明:早晚稻生育期内的甲烷排放总量分别为9.28g·m-2和7.78g·m-2。早晚稻生育期内产甲烷菌的群落结构和种群数量均存在一定的季节变化,以水稻生长旺盛期群落结构复杂、数量多,其中水稻移栽20d左右土壤产甲烷菌数量最多,早、晚稻分别为1.14×107个·g-1干土和6.72×106个·g-1干土,均显著高于当季其他生育期。早稻生育期内产甲烷菌的群落结构多样性比晚稻复杂,数量比晚稻多,这与双季稻田的甲烷排放规律一致。稻田甲烷排放量与稻田土壤产甲烷菌的数量存在显著的正相关关系,而与群落结构没有显著相关性。因此,控制稻田产甲烷菌数量可以有效减少甲烷的排放量。

褐煤中天然产甲烷菌富集培养与生物气产出模拟

采用厌氧培养方法,在云南省昭通褐煤样品中成功地培养富集了活性厌氧细菌,并进一步开展了为期60天的生物气生成模拟实验,分析了生物气的生成规律、物质组成和成因机制。结果揭示:3件褐煤样品中均有活性厌氧细菌存在,以纤维素分解菌为主,活性硫酸盐还原菌极其微少,说明昭通盆地褐煤层具有较强还原性的生化环境,有利于产甲烷菌的繁盛;生物气的生成经历了生气量缓慢增长、显著增高、趋于减缓三个阶段,表明产甲烷菌在经历了第一阶段缓慢繁殖后,其数量和活性在第二阶段达到较高水平;3件煤样生气量和生气历程存在一定差别的原因,可能在于原煤中活性产甲烷菌数量以及显微组分组成方面存在差异,褐煤生物气生成过程至少存在两个以上的生气高峰阶段。模拟实验中产生的生物气几乎全部由CH4和CO2组成,且CH4占主要部分,几乎没有检测到重烃气。甲烷气体δ13C1和δD的平均值均处于生物甲烷碳、氢同位素组成的正常分布范围。

产甲烷菌的生理生化特性

目前已经分离鉴定的产甲烷菌已有200多种,Fe、Co、Ni、Mo、Se,维生素B2,维生素B12等微量元素对其活性有促进作用;然而,无机毒性物质(重金属离子、Na+、K+、pH、氧化还原电位等)、有机毒性物质(硝化物、抗生素、氰化物和氯仿、芳香族化合物等)、氨氮,氮氧化物等对产甲烷菌活性有抑制作用。已建立了产甲烷微生物利用H2/CO2、甲醇和醋酸为基质的产甲烷生化代谢模型,产甲烷菌含有氢化酶、辅酶F420、辅酶M、甲基呋喃、四氢甲基喋呤等独特的酶。

一株生长pH较宽的产甲烷菌分离与系统发育分析

采用Hungate厌氧操作技术,从造纸厂阴沟污泥中分离到一株生长pH范围为5.5～9.5的产甲烷菌株SH4.该菌对酸碱具有良好的适应性,培养3d后,在初始pH值6.0～8.0的培养基中甲烷产量相差不大,且基本达到最大产量.SH4革兰氏染色阳性,短杆状,多数单生,不运动;菌落近圆形,微黄;利用H2+CO2或甲酸盐作为唯一碳源生长,不利用乙酸盐,对氯霉素非常敏感.该菌最适生长pH为7.0,最适生长温度为35℃,最适NaCl浓度为0～1.5%.实验表明,与仅添加厌氧污泥作为接种物相比,添加SH4菌液可使产甲烷启动时间缩短1/3,甲烷总产量亦有大幅提高.形态、生理生化特征以及16S rDNA序列分析表明,该菌为嗜树木甲烷短杆菌(Methanobrevibacter arboriphilus).

FACE环境下不同秸秆与氮肥管理对稻田土壤产甲烷菌的影响

产甲烷菌是土壤中与甲烷产生和碳素循环有关的微生物菌群,大气CO2浓度升高可能对它们的数量产生影响。利用江都市小记镇的稻-麦轮作FACE平台,采用最大可能(MPN)法,在2004年水稻生长季研究了不同施肥情况(施常规氮量和低氮量)、不同秸秆还田情况(秸秆全还田、秸秆半还田、秸秆不还田)下,土壤中的产甲烷菌数量在大气CO2浓度升高条件下随时间的变化情况。结果表明,大气CO2浓度升高在秸秆全还田情况下对产甲烷菌数有明显的促进作用,在其他2种秸秆还田情况下,FACE与对照差异不显著。常氮处理仅在水稻生长初期促进产甲烷菌数,而在其他生长季不同氮肥处理之间无明显差异。总之,常氮处理产甲烷菌数量FACE比对照平均高104%～116%,低氮处理平均高101%～126%,进一步证实大气CO2浓度升高会促进稻田CH4的排放。

古菌细胞膜类脂化合物分析与初步应用——柴达木盆地沉积地层盐度与产甲烷菌分布

生物气是产甲烷菌代谢的产物,其在沉积地层中形成及分布预测一定程度上要依赖产甲烷菌分布规律的研究。目前研究地层中产甲烷菌分布的主要技术方法是地层水中产甲烷菌记数法。考虑产甲烷菌对环境要求苛刻,微小变化均会改变菌群结构,导致测量结果与实际之间偏差明显;另新鲜地层水样系统采集实现起来也是困难重重。这导致该方法实际操作中的不可实现性。而利用沉积物中产甲烷菌特征化合物浓度来反应一定时间阶段内产甲烷菌的分布可以弥补细菌记数法的不足,而且方法简单、可操作性强。本文利用该方法系列分析了柴达木盆地三湖地区两口井中古细菌醇的变化规律,结果可见盐度无论在横向上还是纵向上均控制着产甲烷菌的分布:盐度相对高的沉积凹陷区,浅层(400m以上)产甲烷菌受到明显抑制,随后产甲烷菌活跃性增强,而且持续深度深达2000m;而凹陷边部涩北1号气田区,盐度相对较低,浅层抑制作用稍弱,产甲烷菌主要分布范围在1000m以上,1000m以下则由于埋藏过程中产甲烷菌的持续活动导致有机质大量消耗致使产甲烷菌活动减弱。最后,结合该区沉积古环境和盐度特征,划分出不同深度产气区分布规律。

产甲烷菌研究进展

产甲烷菌是重要的环境微生物,在自然界的碳素循环中起重要作用。迄今已有5种产甲烷菌基因组测序完成。基因组信息使人们对产甲烷茵的细胞结构、进化、代谢及环境适应性有了更深的理解。目前已知的甲烷生物合成途径有3种,它们以乙酸、甲基化合物、氢/二氧化碳为起始,通过不同的反应途径都形成了甲基辅酶M,在甲基辅酶M还原酶的催化下最终形成甲烷。

闽江河口区淡水和半咸水潮汐沼泽湿地土壤产甲烷菌多样性

为认识盐度对河口潮汐沼泽湿地土壤产甲烷菌的影响,应用PCR-RFLP技术及测序分析对闽江河口区淡水-半咸水盐度梯度上分布的4个短叶茳芏潮汐沼泽湿地土壤产甲烷菌群落结构进行研究。闽江河口区短叶茳芏潮汐沼泽湿地土壤产甲烷菌群落结构受盐度影响明显,位于下洋洲和塔礁洲的短叶茳芏潮汐淡水沼泽湿地土壤产甲烷菌的香农-威纳多样性指数值分别为2.81和2.65,位于蝙蝠洲和鳝鱼滩的短叶茳芏潮汐半咸水沼泽湿地土壤产甲烷菌香农-威纳多样性指数值分别仅为2.33和2.27。系统发育分析表明:短叶茳芏沼泽湿地土壤产甲烷菌类群主要有甲烷杆菌目(Methanobacteriales),包括Methanobacterium、Methanobrevibacter和Methanobacteriaceae;甲烷微菌目(Methanomicrobiales),主要有Methanoregula,以及甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales),主要有Methanosarcina和Methanococcoides。闽江河口区短叶茳芏潮汐淡水沼泽湿地土壤主要的优势产甲烷菌有Methanoregula、Methanosarcina和Methanobacterium,而短叶茳芏潮汐半咸水沼泽湿地土壤主要的优势产甲烷菌则转化为仅以Methanoregula为主。

产甲烷菌的诱变及其对煤层气产出的影响

为获取高效降解褐煤产甲烷菌,以试验室超低温冰箱中保存的产甲烷菌为出发菌株,硫酸二乙酯(DES)作为诱变剂,粒度0.109～0.180 mm的褐煤为底物,在不添加培养基及营养成分的条件下进行诱变参数的优化,获取最佳诱变试验条件。试验结果表明,诱变的最佳试验条件为DES浓度1.8%、诱变时间30 min、诱变温度34℃;在此条件下经过40 d厌氧降解,产气量平均提高了40.00%。采用扫描电镜观察降解前后褐煤表面形态变化发现,与降解前相比,降解后褐煤表面变得疏松,孔隙和裂隙明显增多。