日本医蛭中一种新抗凝血蛋白质的仿生亲和纯化及鉴定

目的从日本医蛭中快速提取和纯化生物活性蛋白质。方法利用仿生亲和介质库进行配体筛选和1步纯化。结果从日本医蛭中纯化出了1种具有抗凝血活性的新型低丰度蛋白质,命名为NLP-1(New Leech Protein-1)。通过进一步分析,其相对分子质量为13800,蛋白回收率可达到69.2%,其在血浆中含量为0.02 mg/mL时即可产生明显的抗凝血现象。利用MALDI-TOF-TOF分析,在蛋白质数据库中未找到相似蛋白质或多肽。结论从日本医蛭中纯化出的NLP-1蛋白质是1种新型的抗凝血物质,具有很高的开发研究价值。

亲和纯化技术联合质谱分析筛选乳腺癌中p90核糖体S6蛋白激酶4相互作用蛋白

背景与目的:p90核糖体S6蛋白激酶4基因(ribosomal S6 kinase 4 gene,RSK4)作为抑癌基因,能够抑制细胞增殖、迁移并诱导细胞的凋亡,但与其配合发挥相应功能的相互作用蛋白尚不明确。该研究利用Flag标签纯化技术和质谱分析筛选鉴定乳腺癌细胞株MDA-MB-231中的RSK4相互作用蛋白。方法:构建含有RSK4全长和Flag亲和标签的真核表达载体pc DNA3.1/EGFP-RSK4-Flag,将其转染至MDA-MB-231乳腺癌细胞株,72 h后收集细胞蛋白。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白[质]印迹法(Western blot)检测RSK4表达情况。运用标签分离纯化RSK4蛋白,液相质谱/质谱分析技术(liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS)鉴定RSK4相互作用蛋白,通过生物信息学的方法(GO分析和IPA分析)归纳分析互作蛋白以及与RSK4相互作用机制。结果:通过标签纯化联合质谱分析成功鉴定出丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶38(serine/threonine-protein kinase 38,STK38)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶38类(serine/threonine-protein kinase 38-like,STK38L)、MOB激酶致活因子2(MOB kinase activator2,MOB2)、蛋白精氨酸N甲基转移酶5(protein arginine N-methyltransferase 5,PRMT5)等24个RSK4相互作用蛋白。对所鉴定出的互作蛋白进行生物信息学分析,提示RSK4互作蛋白组参与包含细胞凋亡和细胞迁移运动等在内的多种生物信号通路。结论:利用亲和纯化技术联合质谱鉴定成功筛选出RSK4相互作用蛋白并通过生物信息学分析获得了RSK4参与乳腺癌细胞的凋亡、迁移相关生物调控网络。

人红细胞膜DAF的亲和纯化及活性研究

目的 获得纯化并具有生物学活性的人红细胞膜促衰变加速因子。方法 经胰蛋白酶消化、正丁醇抽提及DE3 2离子交换色谱和抗体亲和层析等步骤从人红细胞膜影中分离纯化人红细胞膜DAF。以SDS PAGE及免疫印迹实验检测纯度及抗原特异性 ,以C3转化酶体外组装实验及促衰变加速活性实验检测其补体抑制活性。结果 40 0ml人全血最终可得纯化DAF约 42 0 μg ,回收率达 2 6% ;比活性为 4 5× 10 5U/mg ;纯化产物在SDS PAGE中表现为 70× 10 3 的单一蛋白条带 ,并在免疫印迹实验中可与抗人DAF单抗特异性结合。在生物学活性实验中 ,纯化产物既可促进C3转化酶的衰变 ,也可抑制C3转化酶的形成。

猪膜联蛋白A2多克隆抗体的制备、亲和纯化与鉴定

本研究旨在制备并亲和纯化兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。通过PCR从质粒pA2-EGFP中将编码猪膜联蛋白A2与增强型绿色荧光蛋白融合基因(Annex A2-EGFP)亚克隆到pET-30a(+),构建了原核表达质粒p30a/AE,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导以包涵体形式表达了猪ANNXA2-EGFP融合蛋白,用Ni-Resin HP树脂对表达的目的蛋白进行亲和纯化。用纯化的ANNXA2-EGFP融合蛋白免疫兔,制备兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。将以前纯化的猪可溶性GST-ANNXA2融合蛋白偶联NHS活化琼脂糖凝胶FF,亲和纯化多克隆抗体。用GST-ANNXA2亲和纯化的多抗效价达到1∶12800,Western blot和免疫组化结果证实具有高特异性。制备的高效价和高特异性兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体,为进一步研究膜联蛋白A2在病毒感染中的作用奠定了基础。

流感病毒RNA聚合酶串联亲和纯化方法的建立

为建立流感病毒RNA聚合酶的串联亲和纯化方法,本实验由鸡胚尿囊液中提取病毒核酸,经过RT-PCR和常规PCR方法扩增禽流感病毒株A/Duck/Guangxi/35/01(H5N1)的PB1、PB2和PA的cDNA。分别将PB2基因连接于pcDNATAP载体中,PB1和PA基因连接于pcDNA3A载体中构建了pcDNA-35PB2TAP、pcDNA-35PB1和pcDNA-35PA重组质粒。将构建的真核表达重组质粒共转染293T细胞,经过串联亲和纯化方法获得流感病毒依赖RNA的RNA聚合酶复合体(RdRp)。利用RNA体外合成试验验证获得的RdRp具有生物学活性。

胸腺腺苷脱氨酶免疫亲和纯化和性质研究

用免疫亲和层析结合常规生化方法从人胸腺中纯化腺苷脱氨酶达电泳纯，比活力１４８９８Ｕ／ｍｇ，得率３４．１５％该酶分子质量为４１．３ｋｕ，约由３８０个氨基酸残基构成，等电点为４．９，最适温度３７～４０℃，最适ｐＨ为７．０以腺苷或２－脱氧腺苷为底物，其Ｋｍ分别为８３μｍｏｌ／Ｌ和６１μｍｏｌ／Ｌ．对氯汞苯甲酸能显著抑制酶活性，二硫苏糖醇可使被抑制的活性得到部分恢复．

人端粒酶亲和纯化方法的建立及其初步鉴定

目的：建立一种亲和纯化人端粒酶的手段。方法：酶切鉴定人端粒酶RNA（hTR）质粒，所切下的hTRcDNA片段用生物素标记后与链霉亲和秦琼脂糖珠耦连，用高端粒酶活性的胃肿瘤细胞提取液与之反应，利用端粒酶核糖核蛋白的特性，形成链霉亲和秦琼脂糖珠-生物素标记hTRcDNA－hTR-端粒酶蛋白组份复合物，核酸解离液洗脱后获得亲和纯人端粒酶。其活性用宝灵曼公司端粒酶试剂盒检测，定量利用BeckmanDU－640检测仪进行。结果：酶切鉴定的结果与hTR质粒图谱吻合。生物素hTRcDNA与链霉亲和素琼脂精珠耦连量为31．71μg，耦连率为98．38％。纯化后的端粒酶活性保持良好，相对纯化程度为108．46。结论：本研究中建立的方法是一种可行的端粒酶纯化手段，可用于人端粒酶的深入研究。

草鱼胰蛋白酶的亲和纯化及酶学性质

从草鱼肝胰腺中提取胰蛋白酶,经匀浆、硫酸铵分级沉淀、透析得到胰蛋白酶粗酶液,通过BTI-Sepharose亲和层析一步纯化得到电泳纯的草鱼胰蛋白酶,并进一步研究该胰蛋白酶的酶学性质。结果表明:草鱼胰蛋白酶的分子质量约为27 kDa,米氏常数K_(m)为3.4×10^(-5)mol/L;最适反应温度为60℃,在低于60℃条件下稳定;最适pH值为9.5,酸碱耐受范围为pH 6.0~12.0;Ba^(2+)、Mg^(2+)、Fe^(2+)在0~10 mmol/L范围内对该酶具有一定激活作用,而乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、K^+在0~10 mmol/L范围内对该酶有一定抑制作用,EDTA较K^+对酶的抑制作用更明显。

亲和纯化技术联合质谱鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白

目的:利用亲和纯化技术联合质谱分析筛选鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白,为探讨S100A8和S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供线索。方法:构建含有S100A8和S100A9 CDS区和Flag亲和标签的真核表达载体p3×Flag-CMV-S100A8和p3×Flag-CMV-S100A9,将其转染至HEK293细胞中,48 h后收集蛋白。运用标签分离纯化S100A8和S100A9蛋白,液相质谱/质谱分析技术(liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS)鉴定S100A8和S100A9的相互作用蛋白,通过生物信息学的方法(GO分析)归纳分析相互作用蛋白,免疫共沉淀实验鉴定S100A8和S100A9的相互作用蛋白。结果:通过标签纯化联合质谱分析成功鉴定出PKM,NPM1,e IF5A等14个与S100A8相互作用的蛋白,鉴定出14-3-3ε,PKM等6个与S100A9相互作用的蛋白。对所鉴定的相互作用蛋白进行生物信息学分析,发现与S100A8和S100A9相互作用的蛋白参与糖代谢、细胞黏附、正向调控NF-κB转录因子活性、抗凋亡等在内的生物信号通路,并利用免疫共沉淀证实PKM2与S100A8和S100A9发生相互作用,14-3-3ε与S100A9发生相互作用。结论:利用免疫共沉淀结合质谱技术筛选鉴定的S100A8和S100A9相互作用蛋白PKM2和14-3-3ε,可能为阐明S100A8和S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供重要线索。

甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体的亲和纯化

采用碳二亚胺法将甲氧基有机磷农药通用半抗原与琼脂糖凝胶进行链接,并利用链接产物对相应的多克隆抗血清进行纯化。经鉴定,偶联反应正常,纯化效果良好且产率约为78.5%;纯化后抗体能够保持对5种农药对象的识别活性,且具有更高的亲和活性。应用纯化后的抗体能够建立起更灵敏的免疫检测方法。

串联亲和纯化技术及其应用

串联亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)是一种能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术,经过两步特异性亲和纯化,可快速得到生理条件下与靶蛋白质存在真实相互作用的蛋白质。TAP方法最初用于酵母中,因其具通用性、高效性、高纯度及假阳性低等特点得到了快速发展,至今已成功运用于许多其他生物。现主要介绍TAP方法的原理、TAP标签及其在不同物种中的应用。

将串联亲和纯化标签敲入耻垢分枝杆菌基因组的方法研究(英文)

目的利用pJV53质粒编码的分枝杆菌重组工程系统将串取亲和纯化(TAP)标签敲入耻垢分枝杆菌基因组。方法从质粒pBS1479中扩增出tap片段,从质粒pSMT3中扩增hyg片段,从耻垢分枝杆菌基因组中分别扩增出aasf基因及其5’端非编码区片段AASF5和aasf基因下游3’端非编码区片段AASF3,利用重叠PCR将以上4个片段拼接在一起,形成最终的敲入片段A5THA3;将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,使其表达重组蛋白,制备带有重组蛋白的感受态细胞;将构建好的敲入片段转入感受态细胞,使其重组入耻垢分枝杆菌基因组中,PCR和DNA测序鉴定敲入效果。结果 PCR与DNA测序结果证实带有TAP标签的A5THA3片段已成功敲入耻垢分枝杆菌基因组中。结论成功将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组,为下一步进行目的基因功能研究奠定了基础。

斑点亲和纯化法——一种用于纯化由微量混合抗原产生抗体的方法

斑点亲和纯化法——一种用于纯化由微量混合抗原产生抗体的方法邹静１姜泗长２顾瑞２杨伟炎２由微量混合抗原产生的抗体，不能通过常规方法分离纯化。Ｏｌｓｍｓｔｅｄ、Ｓｍｉｔｈ和Ｆｉｓｈｅｒ等建立了用电转移至偶氮纸或硝酸纤维素（Ｎｉｔｒｏｃｅｌｕｌｏｓｅ，ＮＣ...

串联亲和纯化技术筛选肠病毒71型3D聚合酶的相互作用蛋白

目的利用串联亲和纯化技术筛选与肠病毒71型3D聚合酶相互作用的宿主细胞蛋白。方法利用RT-PCR方法从EV71BrCr株全基因组中获得3D聚合酶全长基因,构建pcDNA3.0-3D-Flag-HA真核表达载体并转染RD细胞,48 h后收集细胞。用Western blot方法检测3D蛋白在RD细胞内的表达情况。串联亲和纯化技术筛选与3D聚合酶相互作用的宿主蛋白并进行质谱分析,确定与3D聚合酶相互作用的蛋白或多肽。并采用免疫共沉淀实验,对候选蛋白CyclinG1与3D的相互作用进行验证。结果成功构建了pcDNA3.0-3D-Flag-HA载体,在RD细胞内检测到3D蛋白的表达。经串联亲和纯化和质谱分析得到LATS2、Nek2、APC5、CyclinG1、PI3K等一系列参与细胞凋亡及细胞周期调控的蛋白。免疫共沉淀实验证实3D蛋白与CyclinG1的相互作用。结论 3D聚合酶可能与宿主细胞内蛋白相互作用,引起细胞凋亡及细胞周期改变。

串联亲和纯化(TAP)技术在蛋白质组学中的应用

蛋白质是各种生命活动的主要执行者 ,因此构建蛋白质相互作用的网络图对于准确理解蛋白质功能、揭开各种细胞活动的奥秘十分重要 .串联亲和纯化 (TAP) ,是近年来发展出来的一种能够快速研究在生理条件下蛋白质相互作用 ,揭示蛋白质复合体相互作用网络的新技术 ,已成为研究蛋白质组学的一个重要工具 .随着该技术的不断完善 ,TAP技术在认识蛋白质相互作用的过程中必将发挥越来越重要的作用 .

转基因牛乳中重组人乳铁蛋白的仿生亲和纯化

目的从转基因牛乳中亲和纯化重组人乳铁蛋白。方法从仿生亲和介质库中筛选亲和配体,进行重组人乳铁蛋白的纯化研究。结果筛选出可以特异性结合重组人乳铁蛋白的固定化β-丙氨酸亲和配体,从转基因牛乳中一步纯化的重组人乳铁蛋白纯度为95.2%,蛋白回收率可达81.9%。经放大实验表明该亲和纯化工艺适合工业上大规模纯化乳铁蛋白。结论固定化β-丙氨酸可从转基因牛乳中纯化出高纯度重组人乳铁蛋白,工艺适合工业化生产。

串联亲和纯化技术筛选Bat3的相互作用蛋白质

目的寻找与Bat3结合的蛋白质。方法采用串联亲和纯化技术,在Bat3编码序列羧基端融合Strep2和FLAG 2个分子标签,以此为诱饵筛选与其特异结合的蛋白质,最后进行质谱鉴定。结果筛选到1种蛋白质分子,命名为Ubl4A,免疫共沉淀结果显示Ubl4A可与Bat3相互结合。结论成功建立了串联亲和纯化技术平台,分离出可与Bat3相互作用的蛋白质Ubl4A。

猪甲状腺激素应答基因SPOT14（THRSP）的原核表达及其融合蛋白的亲和纯化

甲状腺激素应答基因（thyroidhormone responsive SPOT14，THRSP）是受甲状腺激素诱导表达的核内基因，参与脂肪合成代谢途径限速酶的转录调控，对动物脂肪生成具有重要的调控作用。

串联亲和纯化技术在哺乳动物体系中的应用

蛋白质相互作用的研究是阐释基因功能的重要手段,随着蛋白质组学的发展和相应仪器的进步,在不同生物体系中进行的大规模的蛋白质相互作用研究逐步成为生物学领域的一个重要方面。该文介绍当前在大规模蛋白质相互作用研究中应用最为广泛的技术之一串联亲和纯化技术,以及该技术在哺乳动物体系中应用时的技术要点和目前取得的重要进展。

串联亲和纯化技术在研究细胞内相互作用蛋白质中的应用

为了进一步研究蛋白质功能并建立蛋白质在细胞内的相互作用网络,各种研究相互作用蛋白质的方法应运而生,串联亲和纯化(TAP)技术就是其中之一。TAP利用基因重组技术将标签基因融合入靶蛋白基因,转入细胞系后表达带标签的靶蛋白,使用标签的特异性对靶蛋白进行纯化和相关研究,而该技术在实际运用会遇到标签选择、标签位置的选择和重组表达等一系列问题,该文介绍TAP技术在实际使用中的技术要点。