宫颈癌病人血清微小RNA-145表达及与人乳头瘤病毒16型感染的关系

目的探究宫颈癌病人血清微小RNA-145(miR-145)与人乳头瘤病毒16型(HPV16)感染相关性。方法选取2015年5月至2019年5月三亚市中医院收治的宫颈癌病人83例,另选取同期在该院体检显示健康者83例为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测所有入组者血清miR-145表达水平,采用多重PCR技术检测宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒16型E6蛋白(HPV16 E6)DNA表达水平,采用logistic回归模型进行危险因素分析,采用Pearson法进行相关性分析,采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)进行miR-145诊断价值分析。结果宫颈癌组病人流产次数>1比例、宫颈脱落细胞HPV16阳性率及HPV16 E6 mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05)。宫颈癌组血清miR-145水平(0.37±0.11)显著低于对照组(1.02±0.31)(P<0.05)。宫颈癌高、中、低分化病人血清miR-145水平分别为(0.42±0.16)、(0.35±0.12)、(0.33±0.08),不同分化程度病人血清miR-145水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期、Ⅲ/Ⅵ期病人血清miR-145水平分别为(0.45±0.14)及(0.29±0.07),有淋巴结转移及无淋巴结转移病人血清miR-145水平分别为(0.47±0.18)及(0.31±0.08),HPV16阴性及阳性病人血清miR-145水平分别为(0.44±0.15)及(0.32±0.09),FIGO分期Ⅲ/Ⅵ期、有淋巴结转移、HPV16阳性病人血清miR-145水平明显低于FIGO分期Ⅰ/Ⅱ期、无淋巴结转移、HPV16阴性病人(P<0.05)。宫颈癌病人血清miR-145与宫颈脱落细胞中HPV16 E6 mRNA表达水平呈负相关(r=−0.372,P<0.05)。流产次数>1、HPV16阳性、miR-145低表达是影响宫颈癌发生独立危险因素(P<0.05)。结论宫颈癌病人血清miR-145水平降低,宫颈脱落细胞HPV16阳性及HPV16 E6 mRNA表达水平升高;miR-145通过与HPV16相互作用,影响宫颈癌发生发展。

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

背景与目的:人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirus16,HPV16)的早期基因E6、E7可分别诱导p53的泛素化降解和pRb的高磷酸化失活,与宫颈癌的发生发展关系密切。本研究通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达,探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。方法:利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞,利用RT-PCR和Westernblot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化,利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。结果:转染携带HPV16型E6、E7反义基因的质粒后,SiHa细胞的E6、E7基因的mRNA和蛋白表达均明显下调;MTT结果显示转染后细胞的增殖活性(0.50±0.05)与转染空载体细胞(1.01±0.06)和未转染细胞(1.28±0.06)比较明显降低(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示转染后细胞凋亡率(59.3±11.3)%与转染空载体细胞(9.4±1.8)%和未转染细胞(2.1±0.4)%比较有显著性差异(P<0.05)。激光共聚焦显微镜结果示转染后细胞凋亡明显增多。结论:HPV16型E6、E7基因反义RNA可降低宫颈癌细胞中E6、E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡。

宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E6、人乳头瘤病毒16型E7蛋白表达及DNA病毒载量与调节性T细胞浸润的相关性分析

目的 探究宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6、HPV16 E7蛋白表达及DNA病毒载量与调节性T(Treg)细胞浸润的相关性及临床意义。方法 选取成都医学院第一附属医院2018年1月至2020年1月84例行手术治疗的宫颈癌患者的癌组织作为宫颈癌组,选取同一医院同期手术治疗的42例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者的宫颈组织作为CIN组,另选取42例因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者的正常宫颈组织作为正常组。对比分析三组组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达及DNA病毒载量、Treg细胞浸润的情况。结果 宫颈癌组HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量、Treg细胞占CD4~+T细胞比例均高于CIN组、正常组,CIN组上述指标均高于正常组(P<0.05);宫颈癌组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量与Treg细胞占CD4~+T细胞比例呈正相关(P<0.05);HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量、Treg细胞占CD4~+T细胞比例与患者临床分期呈正相关,与组织学分级呈负相关(P<0.05)。结论 宫颈癌组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达及DNA病毒载量与Treg细胞浸润具有正相关关系,且均与患者临床分期、组织学分级显著相关,可能对宫颈癌进展有联合预测价值。

人乳头瘤病毒16型E6和E7基因及其突变体转化活性的研究

为筛选出可用于研制HPV治疗性疫苗的HPV16型E6和E7基因突变体 ,故将HPV16型原型株 (德国株 )E6和E7基因及其各种突变体分别转染Balb/c3T3细胞 ,观察转染后的细胞在软琼脂培养中的集落形成能力和在裸鼠体内的成瘤能力。结果表明 ,单独转染和共转染HPV16野生型E6和E7基因的Balb/c3T3细胞系 ,在软琼脂中呈集落样生长 ,并在裸鼠体内成瘤 ;而转染E6基因突变体mE6 (5 0G)、E7基因的两种突变体mE7- 1(2 4G2 6G)和mE7- 3(2 4G2 6G6 7R)以及共转染mE6和mE7- 1的Balb/c3T3细胞 ,在软琼脂培养中极少形成集落 ,也不能在裸鼠体内成瘤。提示经结构改造后的HPV16E6和E7基因已失去了对Balb/c3T3细胞的转化活性 ,而保留了免疫原性 ,可用于HPV16相关肿瘤治疗性疫苗的构建。

人乳头瘤病毒16L1-减毒志贺氏杆菌为载体疫苗的构建及免疫效应初步鉴定

为预防高危型人乳头瘤病毒16型(HPV16)诱发宫颈癌,制备以减毒志贺氏杆菌为载体的HPV16预防疫苗,以期载体可介导机体产生粘膜免疫反应,达到预防HPV16感染的目的。为此构建了以HPV16L1为免疫原的减毒志贺氏杆菌苗,并初步鉴定候选疫苗的减毒特性和免疫效果。利用基于志贺氏杆菌virG/icsA基因的表达载体(pHS3199),将HPV16L1基因插入后构成pHS3199-hpv16L1质粒,电穿孔法将其转入减毒志贺氏杆菌sh42,经筛选获得重组减毒sh42-HPV16L1工程菌。用免疫印迹法检测HPV16L1蛋白表达,连续传代法确定其传代和目的蛋白表达的稳定性;豚鼠角膜巩膜炎症试验检测细菌的毒力和菌苗的免疫效果;小鼠红细胞凝集抑制试验检测免疫血清对病毒样颗粒(VLP)的中和活性。免疫印迹检测证实,重组菌株sh42-HPV16L1可稳定表达HPV16L1;豚鼠角膜巩膜炎症试验证实,该候选菌苗无致病性。减毒sh42-HPV16L1经结膜囊途径免疫豚鼠,可以产生特异性体液免疫应答,免疫动物体内的血清、肠道、阴道分泌物中抗HPV16L1VLPIgG、IgA含量显著高于对照组,并且sh42-HPV16L1免疫动物血清可明显抑制HPV16L1VLP引起的小鼠红细胞凝集。因而sh42-HPV16L1将是一种潜在的HPV16候选预防疫苗。

人乳头瘤病毒16型甲基化水平与子宫颈病变程度关系的研究

目的定量检测位于人乳头瘤病毒16(HPV16)L1基因3′端和LCR基因18个CpG甲基化水平,了解HPV 16甲基化与子宫颈病变的关系。方法选取本院就诊HPV16阳性正常/低度病变、高度病变、子宫颈癌标本各10例患者,采用重硫酸盐-焦磷酸测序方法分析HPVl6甲基化与子宫颈病变的关系。结果 Ll基因3′端的位点7089在正常/低度病变标本的甲基化率最高,其次是子宫颈癌,高度病变标本的甲基化率最低,3组比较差异有统计学意义(P=0.006);3组在位点7 134中甲基化率差异有统计学意义(P=0.01),与正常/低度病变标本比较,子宫颈癌及高度病变甲基化率差异均具有统计学意义(P分别为0.038、0.017)。结论 HPVl6 L1基因3′端甲基化位点7089、7134的甲基化水平与子宫颈病变程度存在相关性,HPVl6型DNA甲基化检测可用于临床上子宫颈病变筛查。

人乳头瘤病毒16E7限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究

目的:利用穿膜肽人免疫缺陷病毒(HIV)-Tat49-57的穿膜能力,设计穿膜肽人乳头瘤病毒(HPV)16E7限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位(第49～57位氨基酸)的融合肽疫苗,并在体外研究其诱导特异性CTL的应答能力。方法:应用多肽固相合成技术,分别合成含HIVTat49-57和人类白细胞抗原(HLA)-A2.1限制性CTL优势表位HPV16E749-57的18肽,和该CTL表位的9肽,并用一无关肽作对照,在体外用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验分别检测了上述18肽和9肽在HLA-A2阳性健康者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导的表位E749-57的特异性CTL活性。结果:经质谱分析,上述多肽成功合成,纯度均在95%以上。与9肽相比,18肽能在体外诱导出明显增强的特异性CTL活性(P<0.05)。结论:在HPV16E7HLA-A2.1限制性CTL表位(49～57)的N-末端加上HIV-Tat49-57序列,不会影响表位的提呈效率,而且在体外能有效激发针对E749-57特异性的CTL应答,为新型抗肿瘤及细胞内感染的多肽疫苗设计提供了新思路。

靶向人乳头瘤病毒16型-E6的siRNA对宫颈癌肿瘤生长的影响

目的研究靶向HPV16-E6的小分子干扰RNA抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长。方法建立裸鼠宫颈癌模型,HPV16-E6siRNA瘤体内多点注射观察肿瘤的生长情况,使用HE染色方法观察肿瘤组织细胞在pSiRNA或pCON治疗后的病理学改变;免疫组化采用SP法。结果靶向HPV16-E6的小分子干扰RNA能显著抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长。结论利用宫颈癌裸鼠移植瘤模型,证明靶向HPV16-E6的siRNA能够显著抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长。

宫颈癌患者人乳头瘤病毒16型E6基因的克隆及序列分析

目的 分析中国陕西地区宫颈癌患者人乳头瘤病毒 16型 (HPV16型 )E6基因的结构特点。方法 采用PCR技术扩增了 1例HPV16阳性宫颈癌患者癌组织中HPV16E6基因 ,并对其进行了克隆及全序列分析。结果 成功地克隆了HPV16E6基因 ,与GenBank收录的原型相比 ,E6基因中有 2个碱基发生突变 ,推导其编码的氨基酸有 1个发生了变化。

人乳头瘤病毒16型E6蛋白高表达下调LPS诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β

目的将人乳头瘤病毒16型(HPV 16)E6蛋白真核表达载体pcDNA3.1(-)/E6转染巨噬细胞,观察E6蛋白瞬时高表达对LPS诱导的THP-1巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β的影响,为进一步研究HPV16E6蛋白的致病机制奠定实验基础。方法将质粒pcDNA3.1(-)/E6通过SuperFectTM脂转染试剂转染巨噬细胞24h后,用LPS刺激巨噬细胞,利用Western-blotting鉴定E6蛋白在巨噬细胞中的表达,ELISA检测pcDNA3.1(-)/E6转染的巨噬细胞不同时间(12、24及48h)培养上清液中TNF-α与IL-1β的含量,统计软件SPSS12.0分析所得数据。结果Western-blotting结果显示pcDNA3.1(-)/E6能在巨噬细胞中表达约18kD的目的蛋白,即E6蛋白;pcDNA3.1(-)/E6+LPS组培养上清中TNF-α与IL-1β的量明显低于巨噬细胞+LPS组和pcDNA3.1(-)+LPS组,pcDNA3.1(-)/E6+LPS组与巨噬细胞+LPS组和pcDNA3.1(-)+LPS组比较,差异具有显著性(P<0.01)。结论HPV16E6蛋白瞬时高表达下调LPS诱导的THP-1巨噬细胞分泌TNF-α与IL-1β。

人乳头瘤病毒16型感染及其高危因素分析

目的检测天津市市区健康筛查女性中人乳头瘤病毒(HPV)16型感染率,分析HPV16感染的危险因素。方法通过问卷调查方式对2 000例天津市市区健康普查女性进行相关因素调查,同时收集入组女性的宫颈脱落细胞。通过巢式PCR扩增和焦磷酸测序技术进行HPV型别检测,采用χ2检验和多因素Logistic回归分析HPV16感染的高危因素。结果 2 000例筛查标本中,HPV阳性271例(13.55%),其中前3位为HPV16型阳性占39.5%(107/271),HPV58型阳性占15.13%(41/271),HPV18型阳性占9.59%(26/271)。HPV16感染率吸烟者高于不吸烟者,首次性交年龄≤25岁者高于>25岁者,性伴侣数≥2者高于<2者,怀孕次数≥2者高于<2者,流产次数≥3者高于<3者,避孕方式为非避孕套者高于避孕套者(均P<0.05);HPV16感染率在不同年龄、饮酒史、教育水平、以前妇科体检等因素间差异无统计学意义。吸烟史和首次性交年龄≤25岁为HPV16感染的独立危险因素。结论天津市市区健康普查妇女HPV感染以HPV16型最常见。避免高危因素的暴露,制止女性过早发生性行为,同时改变不良生活习惯是预防HPV16感染及降低宫颈癌发生的有效措施。

人乳头瘤病毒16E6基因沉默对鼻咽癌细胞侵袭转移能力及细胞周期的影响

目的观察针对人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16E6基因的RNA干扰(RNA interfering,RNAi)对人鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)HNE-1细胞侵袭转移能力及细胞周期的影响,探讨HPV16E6基因作为鼻咽癌基因治疗标靶的可行性。方法根据基因库上的HPV16E6mRNA序列,设计合成针对HPV16E6的siRNA,转染HNE-1细胞,采用RT-PCR及Westernblot分析E6基因的表达,利用侵袭实验检测细胞的侵袭能力,MTT法检测细胞的生长增殖,流式细胞术检测细胞周期。结果针对HPV16E6的siRNA下调鼻咽癌HNE-1细胞株E6mRNA和蛋白表达水平,分别下调66.3%、56.7%(P<0.05);侵袭实验结果显示,siRNA转染组的穿膜细胞数为(45.3±4.0),显著低于阴性对照组[(147.7±4.7),P<0.05];转染组细胞的增殖受到抑制,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞术显示细胞阻滞于G0/G1期。结论siRNA可以有效干扰鼻咽癌HNE-1细胞内HPV16E6基因的表达,进而影响HNE-1细胞的侵袭转移能力,并抑制肿瘤细胞的生长增殖,使细胞周期重新分布。

人乳头瘤病毒16型L1基因乳酸杆菌表达载体的构建

目的:构建含人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1基因的乳酸杆菌分泌表达载体。方法:从培养的CasKi细胞中提取DNA为模板,经PCR得到HPV16L1衣壳蛋白基因,将其连接入乳酸杆菌分泌表达载体pVE5523质粒中,并转化入Top10菌中保存。结果:构建的HPV16L1-pVE5523重组表达载体经PCR鉴定正确;获得的目的基因片段经测序与GenBank公布的HPV16L1基因序列符合。结论:成功构建了HPV16L1-pVE5523表达载体。

外源性人乳头瘤病毒16型E7癌基因导入对HeLa细胞cdc25A表达的影响

目的:研究HPV16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期调节因子cdc25A mRNA表达的影响,探讨E7癌基因和cdc25A在宫颈癌发生发展中的作用。方法:用含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测感染前后HeLa细胞cdc25A mRNA表达的差异。结果:感染后HeLa细胞cdc25A的mRNA含量较感染前显著增加(感染前灰度值0.2306±0.0964,感染后0.8739±0.2188,P<0.01)。结论:HPV16E7癌基因促进细胞周期调节因子cdc25A的表达,可能是宫颈癌发病机制中的重要分子事件。

人类疱疹病毒6型及人乳头瘤病毒16型感染与宫颈癌发生、发展关系的研究

目的 :研究人类疱疹病毒 6型 (hHV 6 )及人乳头瘤病毒 16型 (hPV 16 )感染与宫颈癌发生、发展的关系。方法 :应用巢式多聚酶链反应 (nested PCR)检测hHV 6及多聚酶链反应 (PCR)检测hPV 16在 16份正常宫颈、2 0份宫颈炎症、6份宫颈上皮内瘤样病变 (CIN)Ⅰ～Ⅱ级及 34份宫颈癌组织中的感染情况。结果 :宫颈癌组织中hHV 6DNA阳性率为 6 1.76 % (2 1/34) ,明显高于正常组、炎症组及CINⅠ～Ⅱ级组 (P <0 .0 1)。宫颈癌组织中hPV 16DNA阳性率为 76 .4 7% (2 6 /34) ,明显高于正常组的 12 .5 0 %和炎症组的15 .0 0 % (P <0 .0 1)。 2 1份hHV 6DNA阳性组织中的hPV 16DNA也全部阳性 ,二者在宫颈癌组织中呈高度一致性。随着宫颈癌临床期别的增加 ,hHV 6和hPV 16DNA阳性率均呈递减趋势 ,但差异不显著 (P >0 .0 5 )。结论 :hHV 6感染与宫颈癌的发生密切相关 ,可能是宫颈癌的致病因子 ,作为“促进子”(promoter)与hPV 16协同促使宫颈癌进展。

人乳头瘤病毒16型L1和L2基因表达产物的鉴定

目的 :构建人乳头瘤病毒 (humanpapillomavirus,HPV) 16型晚期基因L1及L2的原核表达质粒 ,并验证目的蛋白的表达。方法 :用限制性酶切及连接的方法构建原核表达质粒 pET3a 16L1和 pET3a 16L2 ,通过SDS PAGE及Westenblot检测目的融合蛋白的表达。结果 :在大肠菌中诱导表达的L1蛋白分子量约为 5 7KD ,L2蛋白分子量约为 90KD。结论 :该实验结果为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研制和诊断试剂的研究开发奠定了基础。

人乳头瘤病毒16型L1基因重组表达质粒的构建及在E.Coli宿主中的表达与鉴定

构建 pGEX4T 1 HPV16L1重组表达系统 ,为进一步研制基因工程疫苗奠定基础 ,采用PCR方法扩增HPV16中国分离株L1外源基因片段 ,pGEX4T 1为表达载体 ,构建pEGX4T 1 HPV16L1重组表达系统 ,在大肠杆菌宿主BL(2 1)中 ,经IPTG诱导 ,表达融合蛋白GST L1,经SDS PAGE电泳和Westernblot进行鉴定结果表明 ,成功构建pEGX4T 1 HPV16L1重组表达质粒并获得高效表达并经Westernblot鉴定为L1外源蛋白。提示 :所构建的 pGEX4T 1

重庆地区1例宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6,E7基因的结构和变异

目的 报告 1例重庆地区宫颈癌组织人乳头瘤病毒 16型E6、E7基因的结构及其变异。方法 应用聚合酶链式反应(PCR)从宫颈癌组织扩增出人乳头瘤病毒 16型重庆株E6、E7基因 ,分子克隆技术进行基因的克隆 ,测序。结果 成功地扩增出重庆地区宫颈癌人乳头瘤病毒 16型株E6、E7基因 ,并克隆于质粒载体pBKS( +)。结论 该例宫颈癌组织中人乳头瘤病毒 16型E6、E7与标准株HPV16E6、E7基因的长度相同 ,E6基因无变异 。

人乳头瘤病毒16型转换基因的序列分析

为了解中国地区宫颈癌病人中人乳头瘤病毒16 型E6E7 基因结构特点，从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取组织DNA，经HPV 多重引物PCR 法鉴定标本中感染HPV 型别，选单纯感染HPV16 型两例标本DNA为模板进行PCR 扩增，获得HPV16 E6E7 基因后，重组入pALTER-1 载体，进行双向测序、分析。DNA 序列分析表明:两例标本的HPV16 E6E7 序列全长均为776bp， 与已发表的德国标准株长度相等，两例均为变异株，共检出5 处核苷酸变异位点，其中4 处可导致氨基酸改变。中国山东地区宫颈癌病人中HPV16 E6E7 的基因结构与德国标准株的HPV16 E6E7 基因之间存在差异。

人乳头瘤病毒16型L1-E7c嵌合基因的构建表达及免疫学效应的研究

目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16) L1-E7c嵌合基因并表达融合蛋白,以期获得防治HPV16感染及相关肿瘤的疫苗。方法以HPV16型的中国人野毒株为模板,利用PCR克隆技术制备HPV16 L1-E7c嵌合基因,并转入原核表达载体pET28a(+),获得pET28a(+)-L1-E7c表达质粒。以Western blot方法鉴定融合蛋白与HPV16L1和E7抗体的特异性结合。应用蛋白纯化仪纯化HPV16 L1-E7c融合蛋白,经过复性后,电镜观察病毒样颗粒(cVLP)的形态结构。纯化的蛋白免疫动物,测定疫苗抗肿瘤的细胞免疫及抗体产生情况。结果经过序列分析和酶切鉴定表明成功构建了HPV16 L1-E7c嵌合基因,并在大肠杆菌中可高效表达L1-E7c融合蛋白。此融合蛋白具有HPV16 L1和E7的抗原性,纯化的蛋白复性后可形成嵌合病毒样颗粒(cVLP),纯化的蛋白免疫动物后,产生特异性细胞和体液免疫反应,具有抗肿瘤活性。结论构建的嵌合基因HPV16 L1-E7c可有效表达HPV16 L1-E7c重组蛋白并形成cVLP。此蛋白在动物实验中具有疫苗的免疫保护作用,为HPV16疫苗的研究奠定了实验基础。