miR-27a-3p激活MAPK信号通路促进人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖

背景:目前多项研究证实了丝裂原活化蛋白激酶信号通路参与了细胞的增殖过程,且miRNA参与增生性瘢痕的发生发展,因此深入探讨了miR-27a-3p和丝裂原活化蛋白激酶信号通路在病理性瘢痕形成中的作用。目的:探究miR-27a-3p通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法:收集皮肤标本并分别分离出原代成纤维细胞,倒置显微镜观察原代细胞,免疫荧光予以验证;采用qRT-PCR检测miR-27a-3p在组织中的相对表达水平;利用数据库预测miR-27a-3p的靶基因,再将预测的靶基因进行基因本体功能富集分析及京都基因与基因组百科全书生物通路富集分析;设置分组为:空白对照组、阴性对照组、miR-27a-3p过表达组、miR-27a-3p抑制组、miR-27a-3p过表达+p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂组、miR-27a-3p过表达+细胞外信号调节蛋白激酶抑制剂组、miR-27a-3p过表达+c-Jun氨基末端激酶抑制剂组,Western blot检测细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38激酶总量及其磷酸化水平,采用CCK-8法和EdU检测细胞增殖情况。结果与结论:①与正常皮肤成纤维细胞相比,增生性瘢痕成纤维细胞的增殖活性更强(P<0.05),增殖速度也更快(P<0.001);②与正常皮肤相比,miR-27a-3p在增生性瘢痕中呈高表达(P<0.001);③与阴性对照组相比,过表达miR-27a-3p能促进细胞的增殖活性(P<0.001)和增殖水平(P<0.001);④与阴性对照组相比,敲低miR-27a-3p能抑制细胞的增殖活性(P<0.05)和增殖水平(P<0.001);⑤与阴性对照组相比,过表达miR-27a-3p促进细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平(P<0.05);与阴性对照组相比,敲减miR-27a-3p能抑制细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平(P<0.05);⑥与miR-27a-3p过表达组相比,细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的特异性抑制剂可逆转miR-27a-3p对成纤维细胞的增殖活性(P<0.01)和增殖水平(P<0.001);⑦提示miR-27a-3p通过激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路促进人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。

JAK-STATs通路在CTGF刺激人增生性瘢痕成纤维细胞增殖分化中的作用

目的:探讨JAK-STATs是否参与CTGF刺激人增生性瘢痕成纤维细胞(human hypertrophic scar fibroblast,hHSF)增殖分化过程。方法:原代培养hHSF,将其分为①对照组:hHSF组;②CTGF刺激hHSF组。取0min、5min、10min、20min、30min、45min、60min、90min八个时相点,采用western-blot方法检测各时相点JAK1、JAK2、JAK3、TYK2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6蛋白活化(磷酸化)情况。再对筛选出的蛋白用免疫荧光化学染色和凝胶阻滞电泳(EMSA)方法进一步验证分析其表达及活化情况,以筛选出参与CTGF调控hHSF增殖和分化的JAK-STATs信号分子。结果:通过western-blot、免疫荧光化学染色和凝胶阻滞电泳(EMSA)方法筛选出JAK1、STAT1蛋白在CTGF刺激后蛋白活化程度明显增强。结论:JAK1、STAT1可能参与了CTGF调控hHSF增殖过程。这从一定程度上揭示了CTGF调控hHSF增殖分化过程的信号转导机制,从而为抑制瘢痕纤维化提供了新的研究方向,有助于更深入地调控CTGF的促纤维化作用,为hHSF及其它纤维化疾病的研究及防治提供新的思路。

下调miR-21通过PDCD4抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖并抑制PI3K/Akt信号通路

目的:探讨microRNA-21(miR-21)对人增生性瘢痕成纤维细胞中程序性细胞死亡因子(PDCD4)表达和细胞增殖的影响及机制。方法:利用荧光定量PCR检测正常皮肤成纤维细胞GM0639和人增生性瘢痕成纤维细胞(HSF)中miR-21的表达。构建含有PDCD4-p GC-Fu-GFP慢病毒和空载体对照慢病毒p GC-Fu-GFP感染HSF细胞。将HSF细胞按照不同处理方法分为:空白对照组、转染非特异miRNA的阴性对照组、转染miRNA-21抑制物的mir21 Inhibitor组、转染miR-21质粒的miR-21 mimic组、PDCD4-p GC-Fu-GFP组、pGC-Fu-GFP组和Ly294002组。转染后48h收集细胞,MTT检测细胞增殖情况。采用免疫荧光技术、荧光定量PCR和Western blot检测空白对照组、阴性对照组、miR-21 mimic组和miR-21 Inhibitor组细胞中PDCD4的表达以及基因和蛋白水平。采用荧光定量PCR和Western blot检测PDCD4-p GC-Fu-GFP组、p GC-Fu-GFP组和Ly294002组细胞周期相关蛋白C-MYC,CCND1以及通路相关蛋白p-Akt、JNK1的蛋白表达。结果:HSF细胞中miR-21呈现高表达。与空白对照组相比,抑制miR-21表达可以抑制HSF细胞增殖,上调PDCD4表达。过表达PDCD4可以抑制细胞增殖,下调细胞周期相关蛋白C-MYC,CCND1的表达,同时抑制通路蛋白p-Akt和JNK1的表达。结论:下调miR-21的表达能够促进PDCD4表达,抑制HSF细胞增殖以及PI3K/AKt信号通路。

三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原合成的作用

目的 观察三七总甙对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原合成的作用 ,以寻找治疗人增生性瘢痕的有效药物。方法 体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞 ,分别应用MTT比色法和3H 脯氨酸掺入法检测三七总甙作用后细胞增殖及胶原合成的变化。结果 和对照组相比 ,三七总甙能够显著抑制成纤维细胞增殖及胶原合成 (P <0 0 1)。结论 三七总甙具有体外抗纤维化作用 。

结缔组织生长因子体外促进人增生性瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的研究结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)在人增生性瘢痕成纤维细胞转分化中的作用。方法培养人增生性瘢痕成纤维细胞,分别给予不同剂量CTGF刺激(10ng/ml),以及CTGFASODN转染,48h后用Westernblot方法比较各组间α平滑肌肌动蛋白(αsmoothmuscleactin,αSMA)的表达变化。结果刺激48h后,对照组表达少量αSMA蛋白;小剂量CTGF刺激组和大剂量CTGF刺激组作用48h后,αSMA表达量均显著增多,且成浓度依赖性变化(P<0.01);而CTGFASODN转染组αSMA蛋白表达与对照组比较明显减少(P<0.05)。结论CTGF在体外能促进人增生性瘢痕成纤维细胞向肌成纤维细胞(myofibroblast,MyoF)的转分化,阻断或者抑制其表达可能将更有效的治疗瘢痕挛缩。

A型肉毒毒素可抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原蛋白的合成

背景:A型肉毒毒素伤口周围局部注射可以减少瘢痕的形成,而且对瘢痕的增生挛缩有抑制作用,可以促进瘢痕的萎缩变平。目的:观察A型肉毒毒素对人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原蛋白合成的影响。方法:体外分离、培养人增生性瘢痕成纤维细胞,取对数生长期的细胞接种培养,使用稀释浓度为0.1U/LA型肉毒素DMEM细胞培养基对细胞的生长过程进行干扰,对照组以含胎牛血清的DMEM培养基培养。结果与结论:细胞接种第1～15天,对照组可见梭形的增生性瘢痕成纤维细胞分裂增殖,局部融合成细胞单层,细胞生长旺盛,细胞排列呈现高度一致性。A型肉毒毒素组细胞增殖速度慢,细胞数量少,细胞排列方向散乱,A型肉毒毒素组细胞数为对照组细胞数的79.3%,A型肉毒毒素实验组胶原蛋白合成量为正常对照组的48.4%,差异有显著性意义(P<0.05)。提示A型肉毒毒素可以抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖以及胶原蛋白的合成。

姜黄素对人增生性瘢痕成纤维细胞生长及功能的影响

目的探讨姜黄素对人增生性瘢痕（hyperplastic scar）成纤维细胞（fibroblast,FB）增殖及胶原合成的影响,以寻找治疗人增生性瘢痕的有效药物。方法应用组织块法分离培养瘢痕和正常真皮组织的FB,在倒置相差显微镜下观察细胞形态,应用细胞计数方法绘制细胞生长曲线,测定细胞生长速度;采用不同浓度的姜黄素（0、12.5、25、50和100μmol/L）刺激瘢痕FB,采用四氮甲基唑盐比色法（MTT法）检测姜黄素对FB生长的抑制效应,采用RT-PCR检测姜黄素对FBα1（Ⅰ）前胶原基因的转录活性的影响。结果细胞生长曲线显示：增生性瘢痕FB倍增时间约为5天,正常皮肤FB后细胞倍增时间为4天,两者比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;MTT检测结果显示：12.5μmol/L姜黄素作用于增生性瘢痕FB,表现为增殖倾向,其光吸收值（A值）显著地高于正常对照组。而在25-100μmol/L的浓度范围内,随着姜黄素药物浓度的增加,其抑制作用逐渐增强,50μmol/L和100μmol/L姜黄素能显著抑制瘢痕FB增殖（P〈0.05）;此外,50μmol/L和100μmol/L姜黄素能够显著抑制瘢痕FBⅠ型胶原合成（P〈0.01）。结论较高浓度的姜黄素能有效抑制增生性瘢痕FB增殖和Ⅰ型胶原合成,对增生性瘢痕可能具有治疗作用。

A型肉毒毒素引起人增生性瘢痕成纤维细胞的凋亡

背景:A型肉毒毒素临床上可以治疗增生性瘢痕,体外细胞培养研究发现可以抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。目的:观察A型肉毒毒素对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的抑制作用,以及对人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响。方法:通过消化法分离培养出人增生性瘢痕成纤维细胞,分别用不同浓度的A型肉毒毒素对细胞的生长增殖过程进行干预,通过MTT染色,于酶联免疫检测仪570nm测定吸光度来研究细胞生长增殖情况,计算抑制率。通过Hoechst33342及PI染色检测人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡情况,并计算凋亡率。结果与结论:人增生性瘢痕成纤维细胞生长过程中呈梭形,细胞生长旺盛,细胞融合成单层,细胞排列成高度一致性。经A型肉毒毒素处理后,细胞增殖速度明显减慢,细胞数量减少,细胞排列方向散乱。MTT染色后吸光度减弱,随A型肉毒毒素浓度增加,吸光度明显减弱,与对照细胞比较,差异有显著性意义(P<0.05),半数抑制率出现在0.4IU/L。在荧光显微镜下,人增生性瘢痕成纤维细胞经Hoechst33342和PI染色后细胞核呈现蓝色,细胞核为光滑的圆形或椭圆形外观。A型肉毒毒素干预后细胞核致密浓缩,染色不均匀,折光性增强,核膜皱缩,部分细胞核碎裂,出现碎块,有凋亡小体出现。随着A型肉毒毒素浓度的增加细胞凋亡率逐渐增高,与对照细胞比较差异有显著性意义(P<0.05),半数凋亡率在0.4IU/L。说明A型肉毒毒素可以抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖,其主要通过引起细胞凋亡的途径来抑制成纤维细胞的增殖。

人增生性瘢痕成纤维细胞的改良培养和鉴定

目的:探讨并建立一种简便易行、培养周期短的成纤维细胞改良培养方法。方法:采用组织块贴壁结合胰蛋白酶消化法体外分离培养人增生性瘢痕成纤维细胞。倒置相差显微镜下观察培养的成纤维细胞形态,进行细胞鉴定,作生长曲线观察细胞增殖能力。结果:采用组织块贴壁结合胰蛋白酶消化法体外分离人增生性瘢痕成纤维细胞,细胞培养周期短。分离培养的成纤维细胞波形蛋白呈阳性表达。传代培养的成纤维细胞增殖能力强。结论:采用组织块贴壁结合胰蛋白酶消化法体外分离培养法可以较快、较好地获得稳定培养的增生性瘢痕成纤维细胞,为其形成机制及防治研究提供实验基础。

苦参碱对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

目的 :研究苦参碱 (Matrine,简称 Mat)对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。 方法 :将 Mat以不同浓度梯度作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞 ,测MTT反应的 A0值及 L DH值 ,用免疫组织化学检测 Mat用药前后的细胞核内增殖性抗原 (proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达。 结果 :增生性瘢痕成纤维细胞在 Mat0 .2 5～ 10 0 m g/m l范围内呈剂量依赖性增殖抑制 ,但 L DH值无明显改变 ;PCNA的表达 ,在 Mat作用后明显减弱。 结论 :Mat在体外能明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖而不引起细胞坏死性改变。

原代培养人增生性瘢痕成纤维细胞的生物学行为

背景:增生性瘢痕组织的形成是创面愈合过程中不可避免的,但是增生性瘢痕组织的形成产生很多不良的影响。目的:建立可靠的人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养方法。方法:采用组织贴壁法和消化法分别进行人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养,使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃,体积分数5%CO2,饱和湿度下培养,分别描述其生长曲线、形态及波形蛋白的表达。结果与结论:组织贴壁法人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养成功,20-40d可传第1代,以后每7-10d可传1代,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性;消化法培养人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞成功,15-20d细胞可融合成片,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性。进一步证实两种方法进行人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养均培养成功。

瑞香狼毒提取物对人增生性瘢痕成纤维细胞抑制作用的研究

目的观察瑞香狼毒提取物对人增生性瘢痕成纤维细胞的抑制作用,为烧伤后增生性瘢痕的治疗提供实验依据。方法体外培养烧伤后的人增生性瘢痕成纤维细胞,加入不同浓度的瑞香狼毒提取物,24h后观察细胞形态学,以乳酸脱氢酶(LDH)为指标观察细胞毒性,用MTT法检测其增殖活性。结果不同浓度的瑞香狼毒提取物均能改变成纤维细胞形态,抑制细胞增殖,浓度在500μg·mL-1以下无明显的细胞毒作用。结论瑞香狼毒提取物对人增生性瘢痕成纤维细胞具有抑制作用,并呈剂量依赖关系,具有防治增生性瘢痕的应用前景。

苦参碱对体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞MMP-1、MMP-9表达的影响

目的探讨苦参碱对体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞(HSFb)基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-9)表达的影响。方法将浓度分别为0 mmol/L(对照组)、2.5 mmol/L、5.0 mmol/L、10.0 mmol/L苦参碱作用于体外培养人HSFb,采用酶联免疫吸附试验检测加药后上清液中MMP-1、MMP-9表达量。结果苦参碱作用24 h、48 h时各浓度组MMP-1、MMP-9的表达量均高于对照组(P<0.05),5.0 mmol/L组表达量明显高于2.5 mmol/L组、10.0 mmol/L组(P<0.05)。结论苦参碱可增加HSFb MMP-1、MMP-9的表达,抗瘢痕作用好,在增生性瘢痕防治上具有一定的应用前景。

CTGF刺激人增生性瘢痕成纤维细胞STATs蛋白活化的状况

目的:探讨CTGF刺激人增生性瘢痕成纤维细胞STATs蛋白活化的情况。方法:原代培养人增生性瘢痕成纤维细胞,将其分为:①对照组:人增生性瘢痕成纤维细胞组;②增生性瘢痕成纤维细胞外源性重组CTGF刺激组。取0min、5min、10min、20min、30min、45min、60min、90min八个时相点,分别采用MTT检测细胞增殖,western-blot检测各组之间a-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,a-SMA)的变化趋势以及各时相点STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6蛋白活化(磷酸化)情况。结果:在确定成纤维细胞增殖以及a-SMA表达变化趋势以②-①组顺序递减的前提下(P<0.05),用western-blot观测两组STATs蛋白活化情况,发现:STAT1蛋白磷酸化水平以②-①组顺序递减(P<0.01);STAT2-6均有不同程度的磷酸化,但不以②-①组顺序递减。结论:STAT1可能在CTGF促进人增生性瘢痕成纤维细胞增殖和分化过程中可能发挥着重要作用,以上研究结果为抑制瘢痕纤维化及挛缩提供了新的研究方向。

水蛭素对人增生性瘢痕成纤维细胞作用的实验研究

目的探讨水蛭素对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞(HSFb)凋亡的作用。方法分离培养HSFb取4～7代细胞实验。分别采用免疫细胞化法及Western blot法检测不同浓度水蛭(0 ml、0.25 ml、1.00 ml)对HSFb、Bax、Bcl-2基因表达的影响。结果水蛭素对HSFb的增殖有抑制作用;免疫组化实验及Western blot法检测均表明:水蛭素能增加Bax表达,抑制Bcl-2表达,和对照组比较差别有统计学意义(P<0.05)。结论实验浓度水蛭素对HSFb有显著的抑制作用。

转化生长因子β_3对人增生性瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

目的 :探讨重组人转化生长因子 β3 (rhTGFβ3 )在伤口愈合及瘢痕形成中的作用机制。方法 :取体外培养的人正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞 (normalskinfibroblast,NSFb ;hypertrophicscarfibroblast ,HSFb) ,应用不同浓度rhTGFβ3 ,通过放射免疫和Northernbloting杂交方法观察NSFb和HSFbⅠ、Ⅲ型胶原蛋白及转录水平mRNA表达的变化。结果 :(1)人正常皮肤和瘢痕组织成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原有明显的不同表达 ;(2 )与对照组相比 ,实验组 (分别加rhTGFβ3 ,终浓度为 1、5、10ng·L-1)Ⅰ、Ⅲ前胶原合成明显增加 (P <0 .0 0 1) ,Ⅰ /Ⅲ前胶原的比例变小 ;(3 )实验组rhTGFβ3 对NSFb和HSFb生物学作用的影响呈明显的量效关系。结论 :rhTGFβ3 可有效提高成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成和Ⅰ、Ⅲ型构成比中Ⅲ型胶原的相对含量 。

黄藤乙醇提取物对人增生性瘢痕成纤维细胞抑制作用的研究

目的:研究黄藤乙醇提取物对人增生性瘢痕成纤维细胞的抑制作用。方法:体外培养烧伤后的人增生性瘢痕成纤维细胞,加入不同浓度的黄藤提取物,24h后观察细胞形态学,以乳酸脱氢酶(LDH)为指标观察细胞毒性,用MTT法检测其增殖活性。结果:不同浓度的黄藤醇提取物均能改变成纤维细胞形态,抑制细胞增殖,浓度在300μg/mL以下无明显的细胞毒作用。结论:黄藤醇提取物对人增生性瘢痕成纤维细胞具有抑制作用,并呈剂量依赖关系。

隐丹参酮对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的抑制、凋亡的促进和TGF-β1/Smads信号通路活性的下调

目的探讨隐丹参酮(cryptotanshinone,CPT)对人增生性瘢痕成纤维细胞(human hypertrophic scar fibroblast,HSF)的影响及机制。方法用含有不同剂量(0、25、50、80μg/mL)的CPT培养基培养HSF后,采用EdU染色法和MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫细胞化学染色检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达,ELISA法检测细胞胶原蛋白Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平,羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)测试盒检测HYP含量,Western blot检测TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad4、α-SMA、Bax/Bcl-2水平。结果低(25μg/mL)、中(50μg/mL)和高(80μg/mL)剂量CPT均能使HSF细胞生长抑制率、细胞凋亡率、Bax水平明显升高,增殖细胞比例、Bcl-2、α-SMA、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平和HYP含量降低,TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和Smad4水平也显著降低;而且,较高剂量相比于较低剂量更明显。结论隐丹参酮可有效抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和纤维化,其机制可能与对TGF-β1/Smads信号通路的抑制有关。

猫眼草提取物对人增生性瘢痕成纤维细胞抑制作用的研究

目的:观察猫眼草提取物对人增生性瘢痕成纤维细胞的抑制作用,为烧伤后增生性瘢痕的治疗提供实验依据。方法:体外培养烧伤后的人增生性瘢痕成纤维细胞,加入不同浓度的猫眼草提取物,24h后观察细胞形态学,以LDH为指标,观察细胞毒性,用MTT法检测其增殖活性。结果:不同浓度的猫眼草提取物均能改变成纤维细胞形态,抑制细胞增殖,浓度在500μg/mL以下无明显的细胞毒作用。结论:猫眼草提取物对人增生性瘢痕成纤维细胞具有抑制作用,并呈剂量依赖关系,具有防治增生性瘢痕的应用前景。