人成纤维细胞转录因子Sp1Sp3对p16^(INK4a)基因的调控

p16 INK4a是一种细胞周期蛋白依赖激酶 (cdk)的抑制因子 ,它通过抑制cdk4与cdk6的活性 ,使视网膜母细胞瘤抑制蛋白Rb处于低磷酸化状态 ,从而使细胞阻滞于G1期 .对p16 INK4aATG上游 6 2 2bp片段进行序列分析发现 ,该区域富含GC ,其中有 5个GC盒 (分别命名为GC Ⅰ～GC Ⅴ ) .将上述片段插入到荧光素酶报告载体pGL3 Basic ,分别对 5个GC盒进行点突变后转染人胚肺二倍体成纤维细胞 (2BS)发现 ,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ位点的突变体显著下调p16 INK4a启动子的活性 ,而Ⅲ、Ⅴ位点突变体无明显作用 .电泳迁移率变动分析 (EMSA)证实 ,GC Ⅰ ,Ⅱ ,Ⅳ能与转录因子Sp1和Sp3结合 ,而且结合条带可被转录因子Sp1和Sp3的抗体所拮抗 .共转染Sp1有助于增加启动子的活性 ,而共转染Sp3则有较弱的抑制作用 ,证明p16 INK4a的转录受到Sp1与Sp3的调控 .

川西獐牙菜醇提物上调HepG2细胞膜转运蛋白MRP3、核转录因子SP1及核受体CPF、PXR表达

目的体外培养HepG2细胞观察川西獐牙菜醇提物(Swertia mussitii Franch)对多药耐药相关蛋白3(multidrug resistance protein 3,MRP3)、核转录因子SP1(specificity protein 1 transcription factor,SP1)及核受体孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)、CYP7A启动子结合因子(CYP7A promoter-binding factor,CPF)表达的影响。方法用MTT比色法检测川西獐牙菜醇提物的最佳作用浓度,再分别于0、12、24、48、72h刺激HepG2细胞,抽提细胞的RNA、总蛋白和核蛋白,采用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测膜转运蛋白MRP3、转录因子SP1及核受体PXR、CPF在转录与蛋白水平的表达变化。每个时间点设立阴性对照DMSO组和阳性对照熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)组。结果川西獐牙菜醇提物可显著诱导HepG2细胞膜转运蛋白MRP3的mRNA和蛋白水平的高表达,其作用强于UDCA(P<0.05)。川西獐牙菜醇提物也可明显上调核转录因子SP1及核受体PXR的mRNA和蛋白表达水平,作用强于UDCA。对CPF表达的上调作用与UDCA相当(P<0.05)。结论川西獐牙菜醇提物可刺激HepG2细胞膜转运蛋白MRP3上调,且有可能是通过核转录因子SP1及核受体PXR、CPF上调其表达。

转录因子Sp1和Sp3对JurkatT细胞端粒酶活性的调节作用

目的探讨转录因子Sp1、p3对JurkatT细胞端粒酶活性和端粒酶逆转录酶(hTERT)的调节作用。方法用脂质体将Sp1、Sp3表达载体转入JurkatT细胞,用Westernblotting方法检测蛋白表达水平;用端粒酶PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性并用银染显示端粒酶活性梯度;用RT-PCR方法检测hTERTmRNA水平。结果Sp1、Sp3载体转化36h的细胞Sp1、Sp3蛋白水平分别升高59.6%(P<0.01)和36.8%(P<0.05);随着Sp1表达水平的增加,端粒酶活性和hTERTmRNA水平明显增加,增加率分别为38.5%(P<0.05)和25.4%(P<0.05)。而Sp3表达载体对端粒酶活性和hTERTmRNA水平无明显影响。结论转录因子Sp1通过调节hTERTmRNA转录水平而调节JurkatT细胞端粒酶活性,Sp3无此作用。

TGF⁃β1对炎症状态下人牙周膜成纤维细胞的调控作用

目的探讨转化生长因子⁃β1(transforming growth factor⁃β1,TGF⁃β1)对在牙龈卟啉单胞菌来源脂多糖(lipopolysaccharide from Porphyromonas gingivalis,Pg⁃LPS)刺激模拟炎症状态下的人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs)的调控作用。方法获取hPDLFs并进行免疫组化鉴定,通过qRT⁃PCR与CCK⁃8确定Pg⁃LPS的刺激浓度。将hPDLFs分成4组:空白对照组,单纯100μg/mL Pg⁃LPS;低浓度组,1 ng/mL TGF⁃β1+100μg/mL Pg⁃LPS;中浓度组,10 ng/mL TGF⁃β1+100μg/mL Pg⁃LPS;高浓度组100 ng/mL TGF⁃β1+100μg/mL Pg⁃LPS。CCK⁃8检测细胞增殖情况;划痕实验与Transwell小室实验检测hPDLFs细胞迁移能力;流式细胞术检测hPDLFs的细胞周期;qRT⁃PCR检测hPDLFs的转录因子叉头盒p3(forkhead/winged helix transcription⁃al factor p3,Foxp3)、白细胞介素6(interleukin⁃6,IL⁃6)及EB病毒诱导基因3(Epstein⁃Barrvirus⁃induced gene 3,EBI3)mRNA表达;Western blot检测hPDLFs的Foxp3、IL⁃6及EBI3蛋白表达。结果免疫组化鉴定显示抗波形丝蛋白阳性及抗角蛋白阴性;Pg⁃LPS浓度为100μg/mL时,hPDLFs中IL⁃6 mRNA表达相比空白对照组显著上升(P<0.0001)且细胞增殖能力下降(P<0.0001),所以选择100μg/mL Pg⁃LPS用于模拟炎症状态。10、100 ng/mL TGF⁃β1能提高炎症状态下hPDLFs的增殖能力(P<0.0001);1、10、100 ng/mL TGF⁃β1能促进炎症状态下hPDLFs的迁移能力(P<0.0001);1、10、100 ng/mL TGF⁃β1可加快炎症状态下hPDLFs的细胞周期(P<0.0001);1、10、100 ng/mL TGF⁃β1可抑制炎症状态下hPDLFs的IL⁃6基因和蛋白表达量(P<0.0001),1、10 ng/mL TGF⁃β1可提高炎症状态下hPDLFs的EBI3基因及蛋白表达量(P<0.0001),1、10 ng/mL TGF⁃β1可提高炎症状态下hPDLFs的Foxp3基因表达量,10 ng/mL TGF⁃β1可提高Foxp3蛋白表达量(P<0.05)。结论TGF⁃β1可促进炎症状态下hPDLFs的增殖及迁移能力、上调EBI3表达,可能与转录因子Foxp3表达有关。

重组人内抑素对兔耳创面瘢痕组织血管内皮生长因子、转化生长因子-β_1和碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的观察重组人内抑素(rh Endostatin)对兔耳创面瘢痕增生及血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)表达的影响,探讨rh Endostatin抑制瘢痕增生的分子机制。方法健康新西兰大耳白兔20只,均分为正常对照组、模型组、生理盐水(NS)对照组、rh Endostatin(5 g/L)治疗组和醋酸曲安奈德(TA,40 g/L)对照组;除正常对照组外其余各组均进行增生性瘢痕动物模型的复制,在兔耳腹侧面制作1cm×1cm大小创面。术后第28天,rh Endostatin治疗组瘢痕皮内注射相应浓度rh Endostatin(100μl),NS对照组注射等量生理盐水,隔日1次,共6次;TA对照组瘢痕块内注入相应浓度曲安奈德(100μl),每周1次,共2次;模型组术后不接受处理。术后第47天摄片并收集瘢痕及正常皮肤标本,应用免疫组织化学方法检测VEGF、TGF-β1和b FGF的表达。结果形态学观察结果显示,术后第47天rh Endostatin治疗组瘢痕皮肤色泽变浅,变软变平,体积减小,与模型组和NS对照组比较有明显差异;免疫组织化学检测结果可见,与模型组和NS对照组相比,rh Endostatin治疗组VEGF和TGF-β1蛋白表达减少,b FGF表达增加,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论 rh Endostatin能有效抑制兔耳创面瘢痕增生,其机制可能与rh Endostatin影响VEGF、TGF-β1和b FGF蛋白的表达有关。

阻塞性肝胆汁淤积下转录因子NR5A2和SP1、胆酸转运蛋白MRP3与肝脏损伤的相关性

目的研究阻塞性胆汁淤积下肝脏中转录因子NR5A2、SP1表达是否上调,以及其表达上调与胆酸转运蛋白MRP3基因的表达是否密切相关;MRP3表达上调是否具有减轻阻塞性胆汁淤积肝脏损伤的作用。方法收集阻塞性胆汁淤积组(胆结石或肝内胆管结石引起的黄疸患者手术切除的肝脏)和正常对照组(排除肝脏疾病的活检肝组织及肝转移癌无黄疸的患者肝脏)肝脏样品各15例。采用半定量PCR和免疫荧光方法检测NR5A2、SP1基因的表达,利用独立样品t检验和线性回归分析阻塞性胆汁淤积肝组织样品中MRP3 mRNA表达上调是否与NR5A2或SP1呈正相关,以及MRP3表达上调与反映肝脏损伤的指标ALT、AST是否存在负相关性。HE染色观察胆汁淤积组肝细胞坏死程度和MRP3蛋白表达高低的关系。结果阻塞性胆汁淤积肝脏中NR5A2和SP1 mRNA表达显著上调,其中NR5A2 mRNA增高3.7倍(P<0.01),SP1 mRNA上升3.2倍(P<0.01)。免疫荧光结果表明,阻塞性胆汁淤积组NR5A2和SP1蛋白表达也显著增加,NR5A2或SP1蛋白与胆酸转运蛋白MRP3 mRNA表达呈显著正相关(分别为r2=0.47,P<0.05和r2=0.51,P<0.01);MRP3蛋白表达与肝细胞坏死程度存在密切相关,并且MRP3蛋白表达量与ALT和AST均呈显著负相关(分别为r2=0.52,P<0.01和r2=0.39,P<0.05)。结论人阻塞性胆汁淤积下NR5A2和SP1表达上调,可诱导胆酸转运蛋白MRP3的表达,而MRP3表达上调可能有减轻肝脏损伤的作用。

FOXP3减少瘢痕疙瘩成纤维细胞的胶原分泌及相关机制初探

目的:探讨在瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid fibroblasts,KFB)中叉头样转录因子3(Forkhead-like transcription factor 3,FOXP3)对真皮胶原蛋白沉积及纤维化的影响及相关机制。方法:免疫组化检测瘢痕疙瘩组织中I型胶原蛋白(Collagen type I,COL1)、Ⅲ型胶原蛋白(Collagen typeⅢ,COL3)、IL-6、TGF-β_(1)、FOXP3的表达。体外分离培养KFB,并采用腺病毒过表达FOXP3或给予TGF-β_(1)抑制剂处理。通过Western blot检测对照组、过表达组以及对照组和抑制剂组的COL1、COL3的表达,ELISA检测TGF-β_(1)、IL-6的表达,Masson染色观察胶原沉积情况。结果:与对照组相比,实验组中的COL1、COL3、IL-6、TGF-β_(1)蛋白水平升高,FOXP3蛋白水平降低。经过表达FOXP3或TGF-β_(1)抑制剂处理后,KFB的TGF-β_(1)和IL-6表达降低,胶原蛋白沉积减少。结论:在KFB中FOXP3可能通过抑制TGF-β_(1)的表达,减少组织纤维化和胶原蛋白沉积。

凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1通过糖原合成酶激酶-3β/信号转导和转录激活因子3通路调控高糖诱导的心肌成纤维细胞纤维化的研究

目的 探讨凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)通过糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)/信号转导和转录激活因子3(STAT3)通路调控高糖诱导的心肌成纤维细胞(CFs)纤维化的相关机制。方法 分离、培养及鉴定CFs,构建LOX-1 RNAi慢病毒载体(LV-LOX-1)及慢病毒空载体(LV-Con)并感染CFs。将细胞分为正常对照(NC)组、25 mmol/L葡萄糖的高糖(HG)组、高渗(HPG)组、LV-LOX-1组和LV-Con组,LV-LOX-1及LV-Con感染CFs后加入HG培养24h,记为HG+LV-LOX-1组和HG+LV-Con组,分别使用10μmol/LSB216763和10μmol/L STATTIC处理HG+LV-LOX-1、HG+LV-Con组24h,记为HG+LV-LOX-1+SB216763组、HG+LV-Con+SB216763组、HG+LV-LOX-1+STATTIC组和HG+LV-Con+STATTIC组。CCK-8法检测CFs活力,q RT-PCR和Western blot法检测LOX-1、I型胶原(COL-I)、硫氧还蛋白5(TXNDC5)、GSK-3β、STAT3、p-GSK-3β、p-STAT3 mRNA和蛋白表达。结果 获得LV-LOX-1感染的CFs,荧光显微镜下呈绿色。与HG、HG+LV-Con组比较,HG+LV-LOX-1组LOX-1、COL-I、TXNDC5m RNA表达降低(P<0.05)。与HG+LV-LOX-1组比较,HG+LV-LOX-1+SB216763、HG+LV-LOX-1+STATTIC组COL-I、TXNDC5 mRNA表达降低(P<0.05)。与HG、HG+LV-Con组比较,HG+LV-LOX-1组p-GSK-3β蛋白表达升高(P<0.05),LOX-1、p-STAT3、COL-I、TXNDC5蛋白表达降低(P<0.05)。与HG+LV-LOX-1组比较,HG+LV-LOX-1+SB216763组p-GSK-3β蛋白表达升高(P<0.05),HG+LV-LOX-1+SB216763、HG+LV-LOX-1+STATTIC组p-STAT3、COL-I、TXNDC5蛋白表达降低(P<0.05)。结论 LOX-1、GSK-3β、STAT3、TXNDC5、COL-I参与高糖诱导的CFs纤维化,LOX-1通过GSK-3β/STAT3通路促进TXNDC5和COL-I表达,抑制LOX-1可抑制高糖诱导的CFs纤维化。

转录因子Sp1对胆酸转运蛋白MRP3、MRP4表达的影响

目的研究胆汁淤积时Sp1对MRP3、MRP4表达的影响,以完善MRP3、MRP4表达调控机制。方法构建Sp1过表达质粒及Sp1 siRNA片段,分别转染HepG2细胞,筛选稳转细胞株。提取细胞总RNA和总蛋白,RT-qPCR检测MRP3、MRP4 mRNA水平的变化,Western blot检测MRP3、MRP4蛋白水平的变化。结果成功构建了Sp1-OE-HepG2和Sp1siRNA-HepG2稳转细胞株。在Sp1-OE-HepG2细胞中,MRP3、MRP4 mRNA和蛋白水平表达均增高,其中MRP3 mRNA水平表达增高2.8倍,MRP3蛋白水平表达增高3.0倍;MRP4 mRNA和蛋白水平分别增高3.2倍和2.5倍;而在Sp1 siRNA-HepG2细胞中,MRP3、MRP4则表达下降,其中MRP3 mRNA表达降低52%,MRP4 mRNA表达降低58%,MRP3蛋白表达降低57%,MRP4蛋白表达降低60%。结论转录因子Sp1能够调控胆酸转运蛋白MRP3、MRP4的表达。

PI3K/Akt信号通路及SP1在VEGF上调胃癌细胞MRP1中的作用

目的:从多药耐药相关蛋白1(multidrug resistanceassociated protein 1,MRP1)基因转录调控入手,初步探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)上调MRP1表达的机制.方法:(1)以人胃癌BGC-823细胞为模型,一组常规培养24 h,另一组VEGF作用24 h,最后一组PI3K/Akt抑制剂LY294002预处理1 h后再加VEGF作用24 h,Western blot法分别检测各实验组MRP1、Akt、p-Akt及SP1蛋白表达水平,EMSA方法检测各实验组转录因子SP1与D N A的结合活性;(2)构建分别含M R P1基因启动子序列及SP1结合位点突变的MRP1基因启动子序列的重组荧光素酶报告基因载体(PGL3-Basic-MRP1w、PGL3-Basic-MRP1m),荧光素酶活性分析突变后的MRP1基因启动子在BGC-823细胞中活性的改变及VEGF对其转录活性的影响.结果:(1)VEGF 32 ng/m L作用24 h组与未处理组相比,MRP1、p-Akt、SP1在蛋白水平均上调,且SP1的DNA结合活性明显增强;LY294002 50μmol/m L预处理1 h再联合VEGF32 ng/m L作用24 h后,与VEGF 32 ng/m L单独作用组相比,MRP1、p-Akt、SP1在蛋白水平均下调,SP1的DNA结合活性明显减弱;(2)在BGC-823细胞中,PGL3-Basic-MRP1m具有启动子活性(110.000±2.603),其转录活性为空载体PGL3-Basic的1.8倍(t=-8.936,P<0.01),但与SP1结合位点突变之前的MRP1启动子(PGL3-Basic-MRP1w)活性(144.000±6.888)相比,其转录活性下降23.6%(t=4.617,P<0.05);V E G F作用12 h后,其活性增强,且呈剂量依赖关系(r=0.911,P<0.01),VEGF作用浓度为32 ng/m L时达最大值(191.000±14.799),与无V E G F作用组(112.000±11.358)相比,活性增高0.7倍(t=-7.335,P<0.01);VEGF作用24 h后,也能以剂量依赖的方式上调SP1结合位点突变后MRP1启动子区的转录活性(r=0.945,P<0.01),与无VEGF作用组(133.000±6.083)相比,最大活性(426.000±7.000)增高2.2倍(t=-56.032,P<0.01).结论:VEGF对MRP1启动子活性的上调作用与激活PI3K/Akt信号通路及增强转录因子SP1的表达及活性相关;MRP1基因启动子区SP1结合位点突变后其启动子活性减弱,VEGF对其活性的上调作用不如突变之前明显.

透骨血竭散对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的作用机制

目的探讨透骨血竭散(TGXJS)对类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)大鼠滑膜成纤维细胞(Synovial fibroblasts,SFs)增殖、凋亡和炎症因子的影响及可能的作用机制。方法培养大鼠SFs,并设置细胞分组,细胞分为5组,分别为对照组(正常培养不做处理,Control),模型组(IL-1β处理24 h,Model),透骨血竭散组(IL-1β和透骨血竭散共处理24 h,TGXJS)、透骨血竭散+sh-ALX3组(转染ALX3基因敲降质粒24 h后,加IL-1β和透骨血竭散共处理24 h,TGXJS+sh-ALX3),透骨血竭散+sh-ALX3+OE-ITGB1组(转染ALX3基因敲降质粒和ITGB1基因过表达质粒24 h后,加IL-1β和透骨血竭散共处理24 h,TGXJS+sh-ALX3+OE-ITGB1)。Western-blot检测各组细胞ALX3和ITGB1蛋白表达情况;CCK8细胞增殖实验检测各组细胞72 h后细胞增殖率;ELISA法检测各组细胞炎症因子IL-6、IL-10和TNF-α水平;流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。结果与对照组比较,模型组ALX3和ITGB1蛋白表达降低,细胞增殖率增高,IL-6、IL-10和TNF-α水平提升,细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,透骨血竭散组ALX3和ITGB1蛋白表达增高,细胞增殖率降低、IL-6和TNF-α水平降低,IL-10水平增加,细胞凋亡率增加,差异有统计学意义(P<0.05);与透骨血竭散组比较,透骨血竭散+sh-ALX3组,ALX3和ITGB1蛋白表达降低,细胞增殖率增高,IL-6和TNF-α水平水平上升,IL-10水平下降,细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05),透骨血竭散+sh-ALX3+OE-ITGB1组ALX3蛋白表达降低,ITGB1蛋白表达上升,细胞增殖率降低,IL-6和TNF-α水平降低,IL-10水平上升,细胞凋亡增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论透骨血竭散通过激活ALX3基因,上调ITGB1表达,抑制RA大鼠SFs增殖、凋亡和炎症反应。

针对SP1的圈套寡脱氧核苷酸抑制NIH_3T_3细胞活力和Ⅲα_1胶原基因表达的研究

目的:研究针对转录因子SP1的圈套寡脱氧核苷酸(Decoy-Oligodeoxynucleotide,Decoy-ODN)对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)的活力和Ⅲα1胶原基因表达的影响,探讨圈套寡脱氧核苷酸用于病理性瘢痕基因治疗的可能性及机理。方法:设计合成针对SP1的特异性哑铃形Decoy-ODN。用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞。分别用流式细胞仪检测ODN转染效率,激光共聚焦显微镜观察ODN在细胞中的分布,电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证ODN与SP1的特异性结合。用WST-8检测ODN对细胞活力的影响。用RT-PCR检测ODN对细胞胶原基因表达的抑制作用。结果:分别转染25nM、50nM、100nM、150nM SP1 Decoy-ODN,48h后,细胞活力依次为0.9331±0.0203、0.7479±0.0868、0.577±0.0347、0.4703±0.0147;转染100nMSP1Decoy-ODN可明显抑制Ⅲα1胶原mRNA的表达(P<0.01),抑制效果达60%。结论:Decoy-ODN可以通过拮抗核转录因子SP1的活性而抑制NIH3T3细胞的活力和Ⅲα1胶原基因的表达。

转录因子SP1和FGF21在妊娠期糖尿病胎盘组织中的表达关系

目的探讨妊娠期糖尿病孕妇胎盘组织中转录因子SP1和成纤维细胞生长因子21(FGF21)水平在妊娠期糖尿病患者胎盘组织中的表达关系。方法选取产科门诊产检并住院分娩的120例妊娠期糖尿病孕妇(妊娠期糖尿病组)为研究对象;同期选取109例耐糖量正常的孕妇作为对照组。两组患者一般资料分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测孕妇胎盘组织中SP1、FGF21水平;分析胎盘组织中SP1、FGF21水平与一般资料中相关指标的相关性;logistic回归分析影响妊娠期糖尿病发生的因素。结果两组孕妇年龄、孕周、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)比较,差异均无统计学意义(P>0.05);妊娠期糖尿病组SP1、FGF21、体质指数(BMI)、糖化血红蛋白(HbA1C)、空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)显著高于对照组(P<0.05),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)显著低于对照组(P<0.05);妊娠期糖尿病患者胎盘组织中SP1、FGF21水平呈正相关,且与BMI、HbA1C、FPG、TG呈正相关,与HDL-C呈负相关(P<0.05);SP1、FGF21、FPG升高是影响妊娠期糖尿病发生的危险因素,HDL-C升高是影响妊娠期糖尿病发生的保护因素。结论妊娠期糖尿病患者胎盘组织中SP1、FGF21水平升高。提示SP1、FGF21可能与妊娠期孕妇糖尿病疾病的发生有关,并与患病的严重程度有关。SP1、FGF21水平对评价妊娠期孕妇患糖尿病的早期危险性有重要参考意义。

γ射线对肺成纤维细胞中转录因子SP1,AP1和Smad3-Smad4活性的影响及意义

目的检测不同剂量γ射线照射对大鼠肺成纤维细胞(ratlungfibroblast,RLF)中转录因子SP1,AP1和Smad3Smad4活性的影响并探讨其意义。方法进行大鼠肺成纤维细胞的原代分离培养,应用3、5和8Gyγ射线照射,通过凝胶阻滞电泳(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)、免疫印迹和免疫组织化学等方法检测照射后转录因子SP1,AP1和Smad3Smad4活性的变化及Ⅰ型胶原和Ⅰ型组织纤溶酶原激活物抑制剂(typeⅠplasminogenactivatorinhibitor,PAIⅠ)的表达变化。结果正常RLF中AP1和Smad3Smad4形成弱阻滞条带,SP1无阻滞条带形成,3、5和8Gyγ射线照射后,3种转录因子所形成的阻滞条带明显增强,PAIⅠ和Ⅰ型胶原的表达增多。结论一定剂量γ射线能促进大鼠肺成纤维细胞中转录因子SP1,AP1和Smad3Smad4的活化,并进而促进PAIⅠ和Ⅰ型胶原的表达。

Sp3对β-catenin基因转录调控作用初探

目的:观察转录因子Sp3对β-catenin启动子转录活性的影响,探讨Sp3与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法:采用脂质体法将Sp1和(或)Sp3转录因子表达质粒单独/共同与β-catenin启动子(-410/-1bp)报告基因质粒瞬时转染HEK293T细胞;通过双萤光素酶报告基因实验检测报告基因转录活性的变化。结果:(1)Sp1表达质粒在0.4μg剂量时能提高启动子的活性2.4倍,Sp3表达质粒在0.4μg剂量时能显著提高启动子的活性5.3倍。(2)0.4μg总量的Sp1与Sp3表达质粒共转染293T细胞,随着Sp3/Sp1比例的递增,β-catenin启动子转录活性无明显变化。(3)共同转染Sp1 0.3μg与Sp3 0.1μg时,启动子活性提高3.5倍,比单独转染的转录活性强。结论:Sp3能促进β-catenin基因启动子(-410/-1 bp)的转录,Sp1的转录激活作用则较弱;在转录过程中Sp1和Sp3可能存在协同作用;Sp3可能在转录水平调控β-catenin的表达从而影响Wnt/β-catenin信号通路。

miR-199-3p通过靶向调控SP1促进成纤维细胞增殖对心房颤动心房重构的影响

目的:探讨miR-199-3p与心房纤维化的关系及其对心房成纤维细胞增殖的影响。方法:连续入选2018年11月-2019年11月在云南省第一人民医院心内科住院的心房颤动(AF)患者100例,以基线资料相匹配的非AF患者50例作为对照,利用qRT-PCR检测2组患者外周血中miR-199-3p的表达差异;利用受试者工作特征曲线(ROC)分析miR-199-3p对AF的诊断价值;采用Pearson相关分析miR-199-3p和左房纤维化的相关性;利用CCK-8测定miR-199-3p对成纤维细胞增殖的影响,qRT-PCR检测细胞周期调控因子Ki67和Cyclin D1及CollagenⅠ和CollagenⅢ表达变化;最后利用双荧光素酶报告基因实验确定miR-199-3p的靶基因。结果:miR-199-3p在AF患者外周血[(0.38±0.31)∶(1.25±0.89),P<0.01]和心房组织中[(0.48±0.03)∶(1.00±0.12),P<0.01]表达都下调,且在持续性AF患者中表达低于阵发性AF[(0.42±0.20)∶(1.08±0.48),P<0.01];ROC曲线分析miR-199-3p表达下降鉴别AF的曲线下面积(AUC)为0.90,其敏感性为81%,特异性为86%,鉴别持续性AF的AUC为0.91,其敏感性为98%,特异性为73%;Pearson相关分析显示miR-199-3p表达水平和左房纤维化程度呈负相关(r=-0.863,P<0.01);与对照组相比,沉默miR-199-3p表达可促进成纤维细胞增殖和纤维化,但过表达miR-199-3p可抑制细胞增殖和纤维化(P<0.05);荧光素酶报告基因实验和Western blot证实SP1是miR-199-3p的直接靶基因。结论:AF患者中miR-199-3p和左房纤维化呈负相关,且miR-199-3p通过靶向SP1的表达负性调控成纤维细胞增殖和纤维化,进而参与AF心房重构。因此,miR-199-3p有望成为临床AF潜在的非侵入性诊断标志物和纤维化的预测标志物。

信号传导及转录激活蛋白3与肿瘤相关成纤维细胞共同影响卵巢上皮性癌患者化疗耐药及预后的研究

目的探讨信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)与肿瘤相关成纤维细胞(CAF)共同影响卵巢上皮性癌(卵巢癌)化疗耐药的机制及对患者预后的影响。方法收集2009年9月—2017年10月在中国医学科学院肿瘤医院接受手术治疗且术中留取肿瘤组织标本的高级别卵巢浆液性癌患者共119例,其临床病理资料及随访资料完整,采用多因素Cox回归模型对预后影响因素进行分析。制备本院患者的卵巢癌组织芯片,采用免疫组化EnVision二步法检测组织芯片中STAT3、CAF活化的特异性标志物——成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CAF分泌的Ⅰ型胶原蛋白(COL1A1)的表达水平,分析STAT3、FAP、COL1A1蛋白表达与卵巢癌化疗耐药及患者预后的关系,并分析3种蛋白之间表达的相关性;结合国际公共数据库——基因表达综合(GEO)数据库中GSE26712数据集收录的人卵巢癌组织的基因表达及患者预后信息,对本院卵巢癌患者的检测结果进行验证。结果(1)本院资料的多因素Cox回归模型分析显示,化疗耐药是影响卵巢癌患者总生存时间(OS)的独立危险因素(P<0.001)。(2)本院化疗耐药患者的卵巢癌组织中STAT3、FAP、COL1A1蛋白的表达水平均显著高于化疗敏感者(P均<0.05)。本院的卵巢癌组织芯片中STAT3、FAP、COL1A1蛋白高表达患者的OS均显著短于低表达患者(P均<0.05);对GEO数据库中GSE26712数据集收录的卵巢癌资料的分析显示,高表达STAT3、FAP、COL1A1基因的卵巢癌患者的OS也均显著短于低表达患者(P均<0.05),其验证结果与本院卵巢癌患者的检测结果均一致。(3)相关性分析表明,本院的卵巢癌组织芯片中,STAT3蛋白与FAP、COL1A1蛋白的表达均呈显著正相关(r=0.47,P<0.001;r=0.30,P=0.006);对GEO数据库中GSE26712数据集收录的卵巢癌资料的分析显示,STAT3基因与FAP、COL1A1基因的表达也均呈显著正相关(r=0.31,P<0.001;r=0.52,P<0.001)。结论STAT3与CAF共同作用,可能促进卵巢癌的化疗耐药,进而导致卵巢癌患者的预后较差。

转录因子 Sp1在人肾小球系膜细胞 IP3 R1表达中的作用

目的探讨转录因子Sp1在肿瘤坏死因子（ TNF-α）上调人肾小球系膜细胞（ HMCs ） IP3R1表达中的作用，进一步阐明肝肾综合征（ HRS）肾小球滤过率（ GFR）下降的分子机制。方法用实时定量PCR和免疫印迹检测TNF-α刺激HMCs后，IP3R1 mRNA、IP3R1蛋白及Sp1蛋白表达的情况，重组质粒PGL3-IP3R1 promoter瞬时转染HMCs，应用荧光素酶报告基因检测TNF-α对IP3R1启动子活性的影响；应用Sp1和DNA结合抑制剂光辉霉素（ Mithramycin A ）及Sp1-siRNA质粒瞬时转染预处理HMCs后，检测IP3R1蛋白表达的变化。此外，免疫印迹法检测肿瘤坏死因子受体（ TNFR）对Sp1的活化及IP3R1蛋白表达的影响。结果 TNF-α作用HMCs后，IP3R1 mRNA、IP3R1蛋白和Sp1蛋白表达均明显增加，TNF-α显著增强IP3R1基因启动子的活性，Mithramycin A呈剂量依赖性阻断TNF-α诱导IP3R1蛋白表达上调，Sp1-siRNA预处理HMCs后，IP3R1蛋白表达明显下降。 TNFR1抗体＋TNF-α组和TNFR2抗体＋TNF-α组，IP3R1蛋白表达均有不同程度的下降。 TNFR1抗体＋TNF-α组Sp1蛋白表达明显下降，而TNFR2抗体＋TNF-α组，Sp1蛋白表达无明显变化。结论 TNF-α能上调人系膜细胞IP3R1的表达，TNF-α可能通过TNFR1/Sp1上调IP3R1的表达。

转录因子Sp1在三氧化二砷抑制人胆囊癌细胞生长中的作用

转录因子Sp1是一种基本的、参与真核生物转录起始的转录因子，与肿瘤的发生发展密切相关。三氧化二砷（As2O3）在治疗白血病取得了突破性成果，实体瘤中的研究结果显示它能减少大鼠肝癌肝移植后的肿瘤复发。本研究旨在观察转录因子Sp1在As2O3抑制人胆囊癌细胞生长中的作用。

JAK2/STAT3信号通路选择性抑制剂AG490对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物行为学影响及可能机制

目的：观察JAK2/STAT3信号通路选择性抑制剂AG490对人瘢痕疙瘩成纤维细胞（HKF）生物行为学的影响及可能机制。方法将体外培养的人正常真皮成纤维细胞（HSF）、HKF分别用浓度为12.5、25、50、75、100μmol/L AG490处理为实验组，以不加AG490组为阴性对照组。CCK-8检测各实验组和阴性对照组HSF和HKF培养24、48、72 h后的细胞增殖抑制率；流式细胞仪检测各组HKF培养24 h后的细胞周期分布及细胞凋亡；RT-PCR检测各组HKF培养24 h后，STAT3、细胞周期蛋白D1 mRNA的表达情况，同时检测不予任何药物处理的HSF、HKF中STAT3 mRNA表达；Western印迹法检测各组HSF、HKF培养24 h后STAT3、p-STAT3蛋白表达情况。结果 CCK-8法显示，随AG490药物浓度的增加和作用时间的延长，AG490对HSF、HKF增殖的抑制率增加，且该抑制作用呈浓度和时间依赖性（均P〈0.05）。在相同浓度AG490作用相同时间的情况下，HKF增殖抑制率大于HSF（P〈0.05）。流式细胞仪显示，随AG490药物浓度的增加，HKF G1期细胞比例逐渐增加（P〈0.01）， G2期细胞比例逐渐减少（P〈0.01），S期细胞无明显变化（P〉0.05），细胞凋亡率逐渐增加（P〈0.01）。RT-PCR显示，在不予任何加药处理的情况下，体外正常培养HSF、HKF 24 h后，HKF组STAT3 mRNA相对表达量显著高于HSF组（P〈0.05）。AG490作用HKF 24 h后，STAT3、细胞周期蛋白D1 mRNA相对表达量随AG490浓度的增加而逐渐降低。相关分析显示，经AG490处理的HKF细胞中细胞周期蛋白D1 mRNA的表达量与STAT3 mRNA的表达量呈正相关（r=0.855，P〈0.01）。Western印迹显示，随AG490药物浓度的增加，HSF、HKF中STAT3、p-STAT3的表达均逐渐降低（P〈0.05），且HKF中STAT3、p-STAT3蛋白表达量低于HSF（P〈0.05）。结论 AG490可通过选择性阻断JAK2/STAT3信号通路，有效抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。