人抗原R与血管内皮生长因子-C在非小细胞肺癌中的表达及意义

背景与目的血管内皮生长因子-C(VEGF-C)是介导淋巴管生成的重要分子,参与了肿瘤淋巴道转移的过程。人抗原R(HuR)是最早发现的RNA结合蛋白之一,可增加多种生长因子、细胞因子mRNA的稳定性,从而上调蛋白质表达。本研究的目的是探讨HuR在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其与VEGF-C表达、肺癌临床病理学特征的关系。方法采用免疫组织化学方法(SP法)检测81例NSCLC组织和15例肺良性病变组织中HuR和VEGF-C的表达情况。结果免疫组织化学显示:81例NSCLC的HuR胞浆阳性表达率、HuR胞核阳性表达率、VEGF-C阳性表达率分别为45.7%(37/81)、82.7%(67/81)和70.4%(57/81),与肺良性病变组织比较均有显著性差异(P<0.05)。胞浆HuR表达水平与淋巴结转移、分化程度和pTNM分期密切相关(P<0.05),但与患者的性别、年龄、肺癌组织学类型无明显关系(P>0.05)。胞浆HuR高表达(P<0.05)而不是胞核HuR高表达(P>0.05)与VEGF-C的表达呈正相关。结论胞浆HuR和VEGF-C在肺癌组织中的表达与肿瘤进展有关。HuR可能参与了肿瘤细胞VEGF-C的表达调控。

人抗原R在肿瘤诊断治疗中的研究进展

人抗原R(HuR)是RNA结合蛋白中胚胎致死异常视觉家族的一员,可以结合并稳定在3′非翻译区(UTR)中的富含腺嘌呤和尿嘧啶的序列(AREs),调节mRNA的不稳定性。多种肿瘤细胞质中高表达HuR,并与不良预后和淋巴结转移等密切相关;抑制HuR基因表达可降低肿瘤细胞的增殖和侵袭性。HuR可通过抗凋亡、维持血管生成及逃脱机体抗肿瘤免疫机制等方面促进肿瘤细胞的生长、浸润。HuR有望成为肿瘤诊断、治疗的新靶点。

年龄对大鼠后肢缺血后血管新生的影响及与人抗原R的关系

目的 探讨年龄对大鼠后肢缺血后血管新生的影响及与人抗原R（HuR）的关系.方法 按鼠龄将雄性SD大鼠分为2组：老龄组（18月龄）和青年组（16周龄）,每组6只.建立后肢缺血模型,于术后第14天取缺血后的后肢内收肌组织,免疫组织化学法检测CD31在缺血肌肉组织中表达及新生血管数量,用蛋白印迹法检测HuR蛋白表达及用酶联免疫吸附测定法测定血管内皮生长因子（VEGF）含量.结果 老龄组缺血肌肉组织中毛细血管计数明显低于青年组[（64±7）个/mm2比（144±21）个/mm2,P＜0.05],HuR 蛋白表达明显低于青年组[（1.1±0.1）比（1.5±0.4）,P＜0.05],VEGF含量也明显低于青年组[（260±24） μg/L比（351±78） μg/L,P＜0.05].结论 年龄对缺血后血管新生有明显影响,年龄越大缺血后血管新生抑制作用越强,这一作用可能与年龄增加后HuR蛋白表达下降,导致VEGF表达下降有关.

T细胞受体γ位点反义RNA 1、人抗原R、三元基序家族蛋白21、缺氧诱导因子-1α在结直肠癌组织中的表达及临床意义

目的探讨T细胞受体γ位点反义RNA 1(TRG-AS1)、人抗原R(HuR)、三元基序家族蛋白21(TRIM21)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在结直肠癌组织中的表达及临床意义。方法收集103例结直肠癌患者的结直肠癌组织和癌旁组织,采用免疫组织化学染色法检测HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况,采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测TRG-AS1相对表达量。比较结直肠癌组织和癌旁组织中TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α的表达情况,分析TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况与结直肠癌患者临床特征和预后的关系。结果结直肠癌组织中TRG-AS1相对表达量及HuR、HIF-1α阳性率均明显高于癌旁组织,TRIM21阳性率明显低于癌旁组织,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。不同分化程度、淋巴结转移情况、血管侵犯情况结直肠癌患者结直肠癌组织中TRG-AS1相对表达量比较,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。不同浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中HuR、TRIM21、HIF-1α阳性率比较,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。至随访结束,TRG-AS1低表达患者的累积生存率为55.6%,高于TRG-AS1高表达患者的31.5%(P﹤0.05);HuR阴性患者的累积生存率为56.9%,高于HuR阳性患者的37.0%(P﹤0.05);TRIM21阴性患者的累积生存率为22.4%,低于TRIM21阳性患者的59.0%(P﹤0.05);HIF-1α阴性患者的累积生存率为72.0%,高于HIF-1α阳性患者的36.6%(P﹤0.05)。结论结直肠癌组织中TRG-AS1、HIF-1α及HuR表达均升高,TRIM21表达降低,TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况与结直肠癌侵袭、转移及患者预后密切相关,对评估结直肠癌患者病情及预后具有一定的临床价值。

RNA结合蛋白HuR调控lncRNA DLEU2促进食管鳞癌细胞增殖、侵袭的机制

目的探讨RNA结合蛋白人抗原(Hu)R对食管鳞癌细胞增殖、侵袭的影响及其与长链非编码RNA(lncRNA)淋巴细胞白血病缺失基因(DLEU)2的调控关系。方法收集食管鳞癌组织样本并在体外培养正常人食管鳞状上皮细胞Het-1A及食管鳞癌细胞系KYSE30、KYSE70、KYSE270,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验检测HuR mRNA与DLEU2表达水平。利用Lipofectamime2000试剂对KYSE30细胞进行转染,并随机分组为对照组、pcDNA组、pc-HuR组、sh-NC组、sh-HuR组、sh-HuR+si-NC组和sh-HuR+si-DLEU2组。CCK-8法检测各组KYSE30细胞活性;平板克隆形成实验检测各组KYSE30细胞增殖能力;荷瘤裸鼠实验观察体内肿瘤生长情况;Transwell小室检测各组KYSE30细胞侵袭能力;Western印迹检测各组KYSE30细胞中HuR蛋白表达水平;RNA免疫沉淀(RIP)实验分析HuR与DLEU2的结合关系。结果在食管鳞癌组织和细胞系中,HuR mRNA和蛋白表达及DLEU2水平均显著升高(P<0.05),其中KYSE30细胞系中HuR基因与DLEU2表达水平最高,故选择KYSE30细胞进行转染实验。转染pc-HuR的细胞中HuR蛋白表达明显上调,细胞活性、克隆形成率及细胞侵袭数均显著增加(P<0.05);转染sh-HuR的细胞中HuR蛋白表达明显下调,细胞活性、克隆形成率及细胞侵袭数均显著降低(P<0.05)。RIP实验和qRT-PCR检测发现HuR与DLEU2有相互作用关系。同时转染sh-HuR和si-DLEU2的细胞中DLEU2水平明显降低,细胞活性、克隆形成率及细胞侵袭数均比转染sh-HuR明显更低(P<0.05)。过表达HuR显著增加移植瘤体积和重量,抑制HuR明显减小移植瘤的体积和重量,而同时抑制HuR和DLEU2时移植瘤的体积和重量比单独抑制HuR时明显更小(P<0.05)。结论HuR通过与DLEU2结合,促进食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和移植瘤的体内生长。

人抗原R与乏氧诱导因子1α在肾细胞癌中的表达及临床意义

目的 探讨人抗原R（HuR）与乏氧诱导因子1α（HIF-1α）在肾细胞癌中表达的意义及二者的相关性. 方法 应用免疫组化PV-9000两步法检测2007年1月至2012年7月76例肾癌组织、20例癌旁组织、15例正常肾组织中HuR蛋白及HIF-1α蛋白的表达情况,分析HuR及HIF-1α蛋白表达与肾癌临床病理参数的关系,评价两者在肾癌中表达的相关性.Kaplan-Meier法进行生存分析,采用Spearman等级相关分析、X2检验等进行相关性分析. 结果 HuR在肾癌细胞质中的阳性表达率（38.2％）明显高于癌旁组织（10.0％）和正常肾组织（13.3％）,差异有统计学意义（P＜0.05）;HIF-1α在肾癌胞核中的阳性表达率（48.7％）明显高于癌旁组织（5.0％）和正常肾组织（0）,差异有统计学意义（P＜0.05）.胞质HuR表达水平与肾癌临床分期、病理类型及淋巴结转移有相关性（P＜0.05）;胞核HIF-1α表达水平与肾癌临床分期、病理分级和淋巴结转移有相关性（P＜0.05）.肾癌中胞质HuR表达水平与胞核HIF-1α表达水平呈正相关（P＜0.01）.66例肾癌患者随访6～ 67个月,HuR胞质阴性组及HIF-1α胞核阴性组的总体生存率及平均生存时间明显优于阳性组（P＜0.05）.结论 肾细胞癌组织中HuR及HIF-1α的表达水平和患者的临床病理参数及预后相关,二者有望成为肾癌诊断及预后评估的重要标志物.

血小板源性生长因子诱导下人抗原R对气道平滑肌细胞内转化生长因子β1表达的影响

目的探讨血小板源性生长因子（PDGF）诱导下人抗原R（HuR）对气道平滑肌细胞（ASM）内转化生长因子β1（TGF－β1）表达的影响。方法体外培养ASM以PDGF（20 μg/L）分别在0、6、12和24 h刺激ASM以诱导哮喘状态。实时荧光定量PCR检测各时间点细胞内HuR、TGF－β1 mRNA水平，Western印迹法检测各时间点细胞内HuR、TGF－β1的蛋白水平。利用RNA干扰技术特异性阻断HuR表达，Western印迹法检测干扰组和对照组HuR及TGF－β1在PDGF刺激0、6和12 h的表达水平。酶联免疫吸附法检测干扰组和对照组在PDGF刺激0、6和12 h后，细胞培养上清中TGF－β1的蛋白水平。将细胞依次分为对照组、对照＋PDGF 6 h组、干扰组及干扰＋PDGF 6 h组，然后各组依次加入放线菌素D（10 mg/L）刺激0、4、8和12 h，检测各组TGF－β1 mRNA的半衰期。结果PDGF刺激下HuR表达呈现明显的时间依赖性，0、6、12和24 h细胞内HuR mRNA及蛋白相对表达量分别为1.00±0.00、1.35±0.14、1.73±0.17、2.07±0.10及0.51±0.10、0.67±0.05、0.83±0.07、0.95±0.02（均P〈0.05）。TGF－β1的mRNA及蛋白水平也呈时间依赖性，0、6、12和24 h细胞内TGF－β1 mRNA及蛋白相对表达量分别为1.00±0.00、1.27±0.06、1.60±0.10、1.87±0.10及0.72±0.09、0.87±0.07、1.13±0.12、1.33±0.05（6与12 h、12与24 h两两比较，均P〈0.05）。PDGF刺激0 h，干扰组与对照组HuR表达差异无统计学意义（P〉0.05），PDGF刺激12 h，干扰组HuR表达较对照组降低了21.9%（P〈0.05）。对照组0、6、12 h TGF－β1蛋白相对表达量分别为0.70±0.05、0.89±0.06、1.06±0.05，而干扰组0、6、12 h TGF－β1蛋白相对表达量分别为0.67±0.09、0.77±0.03、0.89±0.05（与对照组相应时间点比较，均P〈0.05）。细胞培养上清TGF－β1含量对照组0、6、12 h依次为（773.33±16.32）、（877.97±16.03）、（3 060.34±82.53）ng/L，而干扰组0、6、12 h依次为（277.33±9.93）、（407.77±7.14）、（828.05±11.67）ng/L（与对照组相应时间点比较，均P〈0.05）。放线菌素D刺激细胞，干扰组TGF－β1的RNA半衰期与干扰＋PDGF 6 h组比较差异无统计学意义（P〉0.05），与对照组及对照＋PDGF 6 h组比较差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论PDGF可上调ASM内TGF－β1表达，HuR通过增加mRNA稳定性参与PDGF诱导的哮喘状态下TGF－β1的表达过程。

人抗原RmRNA与蛋白和环氧合酶-2蛋白在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达及其意义

目的探讨人抗原R(human antigen R,HuR)mRNA与蛋白和环氧合酶-2(COX-2)蛋白在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达及其与卵巢浆液性癌临床病理生物学特征的关系。方法采用RT-PCR技术、免疫组化方法分别检测中国医科大学附属盛京医院2006年1月至2008年2月收集的31例卵巢浆液性癌组织标本、22例卵巢浆液性良性瘤组织标本中HuR mRNA与蛋白和COX-2蛋白的表达,并以8例正常卵巢组织作为对照组。结果 (1)HuR mRNA在卵巢浆液性癌中表达明显高于卵巢浆液性良性瘤和正常卵巢组织(P<0.05)。HuR mRNA的表达与卵巢浆液性癌细胞分化有关(P<0.05),与手术病理分期、淋巴结转移无关(P>0.05)。(2)HuR蛋白相对含量和胞浆表达阳性率在卵巢浆液性癌中的表达显著高于卵巢浆液性良性瘤和正常卵巢组织(P<0.05)。HuR蛋白相对含量和胞浆表达阳性率与卵巢浆液性癌细胞分化有关(P<0.05),与手术病理分期、淋巴结转移无关(P>0.05)。(3)COX-2蛋白相对含量与卵巢浆液性癌手术病理分期有关(P<0.05),与细胞分化、淋巴结转移无关(P>0.05)。依据31例卵巢浆液性癌中免疫组化结果半定量分析,经Spearman等级相关分析发现HuR与COX-2之间呈正相关(r=0.680,P=0.000)。结论卵巢浆液性肿瘤的发展与胞浆中HuR的过表达有一定相关性,HuR与COX-2蛋白在卵巢浆液性癌中的表达呈正相关。

人抗原R在急性肺损伤中的研究

人抗原R（HuR）广泛分布于哺乳动物体内，主要分布于细胞核，在低氧、应激、紫外线等刺激下，可与多种富含Au序列的mRNA结合，增加了mRNA的稳定性。HuR可被p38MAPKMKZ、AMPK和PKC等多条信号通路调节，参与细胞周期、增殖、分化及炎症反应等。在肺的急性炎症反应中，HuR可以和多种炎症因子mRNA结合，如肿瘤坏死因子α、白介素19和白介素8等，影响了mRNA稳定性和蛋白表达。敲除HuR后，炎症因子的mRNA及蛋白表达量均明显减少，表明HuR在急性肺损伤中起了重要作用。

体外研究小鼠心肌细胞自噬过程中人抗原R对溶酶体酸化的作用

目的探讨人抗原R在体外培养的小鼠心肌细胞自噬过程中对溶酶体酸化的作用。方法取1~2d龄C57BL/6小鼠(雌雄不限)20只,分离心脏培养原代心肌细胞,进行以下实验。(1)采用随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为5组,即正常对照组和无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组。正常对照组用DMEM/F12培养基常规培养(常规培养条件下同)54.0h,无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组常规培养53.5、53.0、51.0、48.0h后更换无糖无血清培养基分别处理0.5、1.0、3.0、6.0h,蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白5、腺苷三磷酸酶V1区E1亚基(ATP6V1E1)蛋白表达。(2)将细胞分为正常对照组和无糖无血清3.0h组,相应各组细胞处理同实验(1),激光扫描共聚焦显微镜下观测细胞溶酶体酸化水平。(3)取2个批次细胞,均同实验(1)分组处理,蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白及另一个批次细胞胞质、胞核蛋白中人抗原R蛋白表达。(4)将细胞分为正常对照组、单纯对照小干扰RNA(siRNA)组、单纯人抗原R-siRNA1(HuR-siRNA1)组、单纯HuR-siRNA2组、无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组。常规培养48h后,单纯对照siRNA组及无糖无血清+对照siRNA组加入阴性对照siRNA、单纯HuR-siRNA1组及无糖无血清+HuR-siRNA1组加入HuR-siRNA1、单纯HuR-siRNA2组及无糖无血清+HuR-siRNA2组加入HuR-siRNA2转染6h,8组均继续常规培养48h后,正常对照组及各单纯siRNA处理组更换DMEM/F12培养基、其余各组更换无糖无血清培养基培养3h,蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达。(5)取2个批次细胞,均分为无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组,相应各组细胞处理同实验(4),免疫荧光法观测一个批次细胞人抗原R分布及表达,激光扫描共聚焦显微镜下观测另一批次细胞溶酶体酸化水平。(6)取3个批次细胞,均分为无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组,相应各组细胞处理同实验(4),蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白中组织蛋白酶D、一个批次细胞胞质蛋白中人抗原R及另一个批次细胞总蛋白中ATP6V1E1蛋白表达。(7)将细胞分为正常对照组、无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组,相应各组细胞处理同实验(4),实时荧光定量反转录PCR法检测细胞ATP6V1E1mRNA表达。各实验样本数均为3。对数据进行独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果(1)与正常对照组比较,无糖无血清1.0、3.0、6.0h组细胞总蛋白中LC3Ⅱ、ATP6V1E1蛋白表达显著增加(t=12.16、4.05、4.82,11.64、3.29、8.37,P<0.05或P<0.01),无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组细胞总蛋白中自噬相关蛋白5蛋白表达显著增加(t=6.88、10.56、5.76、9.91,P<0.05或P<0.01)。(2)与正常对照组的1.03±0.08比较,无糖无血清3.0h组细胞溶酶体酸化水平(2.92±0.30)明显升高(t=6.01,P<0.01)。(3)5组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达组间总体比较,差异无统计学意义(F=1.09,P>0.05)。与正常对照组比较,无糖无血清1.0、3.0、6.0h组细胞胞质蛋白中人抗原R蛋白表达显著增加(t=43.05、11.07、5.39,P<0.05或P<0.01),无糖无血清3.0、6.0h组细胞胞核蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=11.18、12.71,P<0.01)。(4)与单纯对照siRNA组比较,单纯HuR-siRNA1组、单纯HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=4.82、4.44,P<0.05)。与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=4.39、6.27,P<0.05)。(5)与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞胞质中人抗原R分布减少、表达水平显著降低(t=10.13,P<0.01)。与无糖无血清+对照siRNA组的1.00±0.06比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞溶酶体酸化水平(0.73±0.06)显著下降(t=3.28,P<0.01)。(6)与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组细胞总蛋白中组织蛋白酶D、胞质蛋白中人抗原R、总蛋白中ATP6V1E1蛋白表达均显著减少(t=4.16、3.99,4.81、5.07,11.68、12.97,P<0.05或P<0.01)。(7)与正常对照组比较,无糖无血清3.0h组细胞中ATP6V1E1mRNA表达显著增加(t=5.51,P<0.05)。与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞中ATP6V1E1mRNA表达显著减少(t=5.97,P<0.05)。结论小鼠原代心肌细胞在体外无糖无血清处理后自噬激活、溶酶体酸化增强、胞质中人抗原R表达增加,人抗原R功能激活并参与维持小鼠心肌细胞自噬过程中的溶酶体酸化。

RNA结合蛋白人抗原R在人脂肪细胞分化中的作用

目的通过检测RNA结合蛋白人抗原R（HuR）与脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（FABP4）、脂肪酸合成酶（FASN）、脂蛋白脂肪酶（LPL）在人脂肪细胞分化过程中的表达变化，并探讨其作用。方法对人脂肪源性间充质干细胞进行成脂诱导分化，油红O染色观察细胞成脂情况，分别以实时定量PCR和Western印迹检测HuR、FABP4、FASN、LPL mRNA和蛋白表达水平的变化；siRNA干扰HuR后，进一步观察细胞成脂变化和成脂相关基因的表达水平。结果人脂肪源性间充质干细胞在成脂诱导分化过程中HuR、FABP4、FASN和LPL的mRNA和蛋白质的表达水平均显著升高（均P〈0.01）。干扰HuR表达后，细胞成脂水平干扰组较对照组下降，FABP4、FASN、LPL mRNA表达水平无明显变化，而其蛋白表达水平均显著下调（均P〈0.05）。结论HuR主要通过调节FABP4、FASN和LPL蛋白水平的变化影响成脂，促进人脂肪细胞的分化。

沉默HuR的表达增加人乳腺癌耐药MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性

目的:研究RNA干扰人抗原R(human antigen R,HuR)基因的表达对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr对多柔比星(doxorubicin)敏感性的影响。方法:构建靶向HuR基因的shRNA表达质粒(pGenesil-siHuR),稳定转染至MCF-7/Adr细胞,real-time PCR检测细胞中MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测MCF-7/Adr细胞中由MDR1基因编码的P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达,MTT法检测pGenesil-siHuR转染后MCF-7/Adr细胞在多柔比星作用后的存活率和IC50,流式细胞术检测MCF-7/Adr细胞的凋亡率。结果:与未转染的MCF-7/Adr细胞比较,pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞中MDR1 mRNA的表达水平明显减低[(0.184±0.029)vs(1.203±0.026),P<0.01],P-gp表达水平明显降低。pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞后,MCF-7/Adr细胞对多柔比星的IC50从未转染的(148.2±2.3)nmol/L降至(42.9±0.4)nmol/L;经多柔比星处理后,pGenesil-siHuR质粒转染组MCF-7/Adr细胞的凋亡率明显上升[(34.6±1.1)%vs(1.1±0.2)%,P<0.01]。结论:RNA干扰HuR的表达能抑制MDR1基因的表达,增加耐药乳腺癌MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性。

细胞间黏附分子-1在ARDS小鼠肺微血管内皮细胞内的表达变化

目的细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）在介导中性粒细胞肺部浸润的过程中起到很大作用。在脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）诱导的急性呼吸窘迫综合征小鼠模型中,观察ICAM-1以及丝裂原激活蛋白激酶2（mitogen-activated protein kinase activated protein kinase 2,MK2）和人抗原R（human antigen R,HuR）在小鼠肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cell,PMVEC）内表达的变化。方法健康清洁型6~8周雄性C57BL/6小鼠,随机数字表法分为对照组和LPS组,每组5只。LPS组腹腔注射LPS 5 mg/kg（溶于100μL的PBS中）,对照组腹腔注射PBS（5mg/kg）,24 h处死全部小鼠。在LPS诱导的小鼠ARDS模型中,用Real-time PCR方法检测小鼠肺组织分离得到的PMVEC内人抗原R（human antigen R,HuR）、ICAM-1的mRNA表达量,用Western blot法检测总MK2、磷酸化MK2、HuR以及ICAM-1表达量的变化,利用流式细胞仪检测PMVEC表面ICAM-1的表达量及肺部浸润的中性粒细胞数量。结果 LPS组小鼠肺组织W/D较对照组高,差异有统计学意义[（6.16±0.40）vs（3.61±0.28）,P〈0.05]。流式细胞术检测LPS组中性粒细胞浸润率较对照组高[（13.92±3.23）%vs（3.24±1.24）%,P〈0.05]。LPS刺激后小鼠肺组织中ICAM-1的mRNA及蛋白表达较对照组明显增加（P〈0.05）,PMVEC表面ICAM-1表达较对照组也明显增加（P〈0.05）。MK2总量无明显变化,磷酸化MK2较对照组明显增加,HuR mRNA及蛋白总量无明显变化,但存在核质转移。结论特异性阻断或减少微血管内皮细胞中HuR的表达可使ICAM-1表达减少,从而减少中性粒细胞的浸润,减轻ARDS病理生理改变,可为临床治疗ARDS提供一个新靶点。

带FLAG标签小鼠HuR真核表达载体的构建及其生物学功能的鉴定

目的构建人抗原R(HuR)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达并初步分析其生物学功能。方法提取NIH3T3细胞总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到小鼠HuR编码序列,酶切后克隆至pcDNA3.1-FLAG载体;重组载体经PCR、酶切、测序鉴定正确后瞬时转染NIH3T3细胞,采用Western blotting分析HuR在细胞中的表达,并采用Real-time PCR检测HuR过表达对DUSP1mRNA水平的影响。结果成功构建了重组质粒pcDNA3.1-HuR-FLAG,Western blotting显示该质粒能在NIH3T3细胞中高效表达,Real-time PCR结果表明HuR过表达可提高细胞内DUSP1基因的mRNA水平。结论成功构建了带FLAG标签的HuR真核表达载体,该载体能在NIH3T3细胞中有效表达,并具有相应的生物学功能,为深入研究肿瘤细胞中HuR对DUSP1基因表达的调控机制奠定基础。

猪苓多糖通过调节HuR介导bcl-2表达诱导T24细胞凋亡

目的研究猪苓多糖(polyporus polysaccharide,PPS)对膀胱癌T24细胞凋亡的作用及其机制。方法 T24细胞常规培养后加入不同剂量PPS,利用Hoechst染色、流式细胞术检测PPS对细胞凋亡的影响,利用q RT-PCR检测PPS对T24细胞bcl-2 m RNA表达水平及其稳定性的影响,通过Western Blot法检测PPS对T24细胞bcl-2蛋白、人抗原R(human antigen R,Hu R)蛋白的表达及对Hu R蛋白胞浆及胞核内分布的影响。结果与对照组比较,中、高剂量的PPS作用24 h后,T24细胞凋亡明显增多(P<0.05),bcl-2 m RNA稳定性降低(P<0.05),bcl-2蛋白及m RNA表达减少(P<0.05),总Hu R蛋白没有明显变化,但胞浆Hu R蛋白表达下降(P<0.05),胞核Hu R蛋白表达升高(P<0.05)。结论 PPS可诱导T24细胞凋亡,其作用可能与影响Hu R在细胞内定位,降低bcl-2 m RNA稳定性及减少bcl-2蛋白表达有关。

pEGFP-HuR真核表达载体的构建及热休克刺激后细胞内定位的改变

目的构建人抗原R(HuR)的绿色荧光真核表达载体,初步探讨其生物学功能。方法克隆构建pEGFP-HuR(绿色荧光蛋白HuR)真核表达载体,并使用脂质体转染的方法将pEGFP-HuR转染入NIH 3T3细胞,Western blotting(WB)检测其表达,并给予热休克处理,利用荧光显微镜观察其在细胞内定位及与应激小体的共定位情况。结果 pEGFP-HuR真核表达载体构建成功,转染入细胞后,利用WB技术及荧光显微镜技术均能观察到其在细胞内高表达,并主要定位于细胞核内,给予热休克处理后,HuR向胞外移出并形成颗粒状小体,与应激小体的主要成分G3BP1蛋白存在共定位。结论 HuR主要定位于细胞核内,给予热休克处理后,HuR向胞外移动并与应激小体形成共定位,提示HuR定位的改变可能在应激时具有重要意义。

激活大麻素受体1诱导的单核巨噬细胞J774A.1的迁移依赖RNA结合蛋白HuR

目的研究大麻素受体1(cannabinoid receptor 1,CB1)在单核巨噬细胞迁移中的重要作用以及RNA结合蛋白人抗原R(human antigen R,HuR)参与其中的可能机制。方法选用单核巨噬细胞系J774A.1,应用琼脂糖凝胶电泳和免疫荧光染色技术鉴定J774A.1中CB1以及HuR的表达;ACEA和AM281分别为CB1的药理学激动剂和拮抗剂,应用Boyden chamber法检测ACEA和AM281对J774A.1迁移活性的影响。HuR的基因干扰用于确定激活CB1诱导的J774A.1迁移功能是否依赖HuR;胞质蛋白的分离用于探究激活CB1是否能引起J774A.1胞质中HuR的富集;RT-qPCR和Western blotting法检测CB1和HuR mRNA和蛋白质的变化情况。结果该研究证明J774A.1在基因和蛋白质水平上均表达CB1和HuR;激活CB1能够促进J774A.1的迁移(P<0.01)并且能够被其药理学拮抗剂AM281所抑制;激活CB1诱导的J774A.1的迁移依赖HuR;激活CB1促进了J774A.1胞质中HuR的富集进一步影响了CB1的表达,由此HuR参与了激活CB1诱导的J774A.1的迁移。结论激活CB1能够诱导单核巨噬细胞系J774A.1的迁移,且此过程依赖RNA结合蛋白HuR。

肝细胞特异性HuR基因敲除小鼠模型的表型研究

目的探讨肝细胞特异性敲除HuR基因对小鼠肝脏功能的影响。方法从美国Jackson实验室引进LoxP标记的人抗原R(human antigen R,HuR)基因小鼠(HuRfl/fl)和Alb-Cre转基因小鼠。杂交后,经数代选育配种,建立肝细胞特异性HuR基因敲除小鼠(HuRLKO)模型。PCR技术鉴别小鼠基因型,蛋白免疫印迹和免疫荧光实验检验小鼠肝脏的HuR表达水平,同时HE染色观察肝脏结构变化。高脂喂养HuRfl/fl/Alb-Cre和HuRfl/fl两组小鼠,观察小鼠体重、肝重和肝体比变化,提取血清检测肝脏损伤和脂肪代谢相关指标。结果 PCR成功检测筛选子代小鼠基因型,包括HuRfl/fl/Alb-Cre和HuRfl/fl小鼠。蛋白免疫印迹实验和免疫荧光实验证明小鼠肝细胞特异性HuR基因敲除成功。HE染色结果提示HuRLKO小鼠的肝细胞出现变性水肿、局部坏死。高脂喂养实验提示两组小鼠在肝重、肝体比、AST、ALT、HDL-C、血糖上的差异具有统计学意义(P<0.05),但在体重、TG、LDL-C的差异没有统计学意义(P>0.05)。结论 HuR基因是维持小鼠肝细胞功能的必要基因,Cre-LoxP技术可成功构建HuRLKO小鼠模型,且特异性高,表型明显,为研究HuR在肝脏各项疾病的发生发展中所扮演的角色,提供了一个很好的疾病模型。

shRNA沉默HuR抑制肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移及侵袭能力

人抗原R (human antigen R,HuR)基因在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达。推测HuR基因也参与肝癌的发展过程。为探索HuR对肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移和侵袭的作用,本研究通过蛋白质印迹实验,检测HuR在肝细胞癌细胞系和正常肝细胞中蛋白质的表达水平。结果显示,肝细胞癌细胞系SMMC-7721 HuR的表达量显著高于正常肝细胞HL-7702。合成特异性靶向HuR基因的shRNA,转染肝细胞癌细胞系SMMC-7721,检测结果发现,HuR基因表达量下调90%。沉默HuR,实时细胞分析技术(real time cell analysis,RTCA)结果显示,细胞增殖能力降低55%,侵袭能力下降75%;细胞划痕实验结果显示,迁移能力下降80%;克隆形成实验中细胞克隆数减少85%;此外,在HuR敲低稳转肝细胞癌细胞系SMMC-7721细胞中过表达Bcl-2,其细胞学现象部分获得逆转。激光共聚焦扫描系统检测结果显示,Bcl-2主要定位于肝细胞癌细胞系SMMC-7721的核膜及胞质。蛋白质印迹法检测结果显示,沉默HuR,Bcl-2下调92%,Survivin下调55%,Twinst1下调69%,N-钙黏着蛋白(N-cadherin)下调48%,E-钙黏着蛋白(E-cadherin)上调1.5倍。以上结果表明,HuR可能通过调控定位于核膜及胞质上的Bcl-2来参与肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移、侵袭及克隆形成过程,HuR基因有望成为临床上治疗肝癌的一个新的潜在靶点。

肝癌组织中HuR和HIF-1α的表达及其相关性

目的观察人抗原R(HuR)和缺氧诱导因子(HIF)-1α在肝癌组织中的表达变化,并探讨其相关性。方法取48例肝癌组织及癌旁组织标本,采用免疫组化染色法检测肝癌组织及癌旁组织中HuR和HIF-1α蛋白的表达,采用荧光定量PCR法检测肝癌组织中HIF-1αmRNA的表达。结果肝癌组织中HuR和HIF-1α蛋白阳性表达率分别为67%和58%,显著高于癌旁组织的19%和10%(P均<0.01)。肝癌组织中HuR与HIF-1α蛋白的表达呈正相关(r=0.723,P<0.01)。HuR蛋白高表达者中HIF-1αmRNA的表达较HuR蛋白低表达者显著上调(P<0.05)。结论肝癌组织中HuR和HIF-1α蛋白表达上调且呈正相关关系,HuR可能增强HIF-1αmRNA的稳定性,从而促进其表达。