人溶菌酶基因治疗奶牛乳腺炎的初步研究

将两种自行构建的表达人溶菌酶基因的重组质粒注射到患病奶牛的乳腺,经CMT试验证明对临床型和隐性乳房炎具有治疗作用。将其中的p205C3LYZ注射入奶牛乳腺,经微球菌溶解试验证明溶菌酶的表达量达到1 18μg/ml以上,表达至少维持8d。不同注射次数、剂量和途径的试验结果表明,重组质粒的治疗作用具有剂量和次数依赖性,3次注射450μg或2次注射400μg的治疗效果相当,乳房基部注射的治疗效果优于乳池注射。以CMT结果为主要指标的对比治疗试验结果表明,重组质粒对隐性奶牛乳房炎的治疗效果与青链霉素合剂接近,有效率分别为19/22(86 4%)和8/9(88 9%),优于中药乳炎消的治疗效果(9/13,69 2%)。3种药物治疗后,奶样中的细菌总数及葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌等代表性致病菌的数量有明显下降,重组质粒和抗菌素治疗组的奶产量上升幅度高于中药治疗组。结果表明,表达人溶菌酶基因的重组质粒对奶牛乳房炎具有可靠、持久的治疗效果,可以代替抗菌素使用。

人溶菌酶cDNA的克隆及其在小鼠体内的表达

根据已发表的人溶菌酶 (human lysozyme,h L YZ) m RNA序列设计引物 ,以人乳腺第 1链 c DNA为模板 ,用 PCR扩增出 1.5 kb h L YZ双链 c DNA,其推导的氨基酸序列与国外发表的从胎盘、巨噬细胞和结肠中克隆的 h L YZ氨基酸序列同源性为 10 0 % ,与从人组织细胞中克隆的 h L YZ仅有 1个氨基酸差异 ,但与从中国人胎盘中克隆的 h L YZ具有6个氨基酸差异。将此 c DNA克隆入乳腺特异表达载体 ,用所获得的基因构件注射哺乳期小鼠 ,经 RT- PCR和微球菌溶解试验证明 ,上述基因构件能有效地驱动目的基因在小鼠乳腺中表达 ,表达量为 6 9.3mg/ L,表达具有较好的组织特异性。这些试验结果表明 ,本研究构建的表达 h L YZ c DNA的基因构件可以用于乳腺生物反应器的研制。

人溶菌酶基因的合成和克隆

用固相亚磷酰胺法合成了人溶菌酶的全基因,全长为409bp,它包括了编码人溶菌酶的结构基因,起始密码子ATG,终止密码子TAA、TGA,以及两端的Bam HI和SphI的识别顺序。整个基因分成24个寡聚核苷酸片段进行合成,每个片段长度分别为26至38个核苷酸,然后用两种方法酶促连接成完整的人溶菌酶基因。基因克隆到M13载体上。用点杂交和限制酶酶切分析确定阳性克隆株。用双脱氧链终止法进行序列分析,证实所合成的人溶菌酶基因序列与设计的完全一致。

巴氏毕赤酵母SMD1168表达人溶菌酶的发酵条件

研究用毕赤酵母SMD1168菌株(MutS,HIS4+)表达人溶菌酶(HLZ)的发酵条件。此菌株具有对胞外分泌的外源蛋白不降解、对反应器氧传递效率的限制不敏感的特性,有利于在常规反应器条件下的过程放大。在培养基中添加复合维生素,在流加甲醇溶液中添加山梨醇或甘露醇可维持细胞正常的生长和代谢,并表达高活性的HLZ。采用恒溶解氧的方式流加甘油溶液以提高细胞密度,在一段时间内使细胞处于碳源半饥饿状态后,使用恒速流加甲醇溶液诱导HLZ表达。HLZ的体积生成速率达到9.6mg/(L·h)左右,上清液中HLZ的含量约为1.6g/L,发酵周期为110h。

工程菌人溶菌酶的纯化和性质

将人溶菌酶工程菌株在发酵培养、菌体经超声破碎、变性和复性后所得的粗酶液经ＥｘｐｒｅｓＩｏｎＳ阳离子交换柱层析，得到电泳纯的酶，比活达到４８０００ｕ／ｍｇ。此酶的最适ｐＨ为６５；等电点为８９１；对溶壁微球菌的米氏常数Ｋｍ＝００３１１ｍｇ／ｍＬ；６０℃保温３０ｍｉｎ，酶活力剩余４８３％。Ｎ末端氨基酸序列除了第一个Ｍｅｔ，其余４个与预期相符。一些重金属离子对酶的活性影响不尽相同，在００１ｍｏｌ／Ｌ的浓度下Ｃｕ２＋可使该酶完全失活。

内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达

将人溶菌酶、内含肽、弹性蛋白3个基因串联插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC-MIELYZ,经Pme I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达,以探讨内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达情况。结果表明:SDS-PAGE和Western blot证实表达的融合蛋白分子量正确,抑菌试验表明融合蛋白对微球菌具有良好的抑菌效果。说明融合基因在毕赤酵母中成功表达,为后继的纯化工作及新型毕赤酵母表达载体的构建奠定基础。

人溶菌酶基因在奶牛乳腺中的表达试验

为了提高牛奶品质 ,降低牛奶细菌含量 ,使其性质更接近于人奶 ,将表达人溶菌酶基因的动物乳腺特异表达载体注射到奶牛的乳区 ,然后根据基因注射前、后奶样的 C.M.T.试验结果和溶菌酶的表达量判定效果。试验结果表明 ,重组质粒在奶牛乳腺中能表达有活性的人溶菌酶 ,表达量达 1.96 μg/ ml,能使奶样的 C.M.T.

毕赤酵母表达人溶菌酶基因的初步研究

为在毕赤酵母中表达人溶菌酶基因,根据已发表的人溶菌酶基因序列设计引物,扩增人溶菌酶全基因片段,将其克隆进巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-LYZ,经Sac I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达。SDS-PAGE证实表达的重组蛋白质分子量正确,抑菌试验结果表明重组hLYZ对微球菌具有良好的抑菌效果。说明人溶菌酶基因在毕赤酵母中成功表达。

人溶菌酶活性两种检测方法的比较研究

为了比较琼脂平板扩散法和RBB-R染料标记比色法测定溶菌酶活性的灵敏度和可重复性,分别以人溶菌酶标准品建立标准曲线,用两种方法对不同稀释倍数的人溶菌酶进行5次重复测定,并分析测定结果的标准差、变异系数和误差率。结果表明:两种方法测定溶菌酶的灵敏度分别为1.5和0.5μg·mL-1,RBB-R染料法标准差、变异系数、误差率均小于琼脂平板扩散法。用RBB-R染料标记比色法测定的正常鸡蛋清中溶菌酶含量为2.84-4.19mg·mL-1,与报道的相符,说明RBB-R染料标记比色法具有操作简便、定量准确和重复性好等优点,适合大批样品及微量样品的检测。

猪克隆胚胎激活方法优化与转人溶菌酶基因克隆猪的生产

为了提高转基因克隆效率和获得转人溶菌酶基因克隆猪,研究了不同电激活参数和化学辅助激活方法对猪克隆胚胎和孤雌胚胎体外发育的影响.结果发现:电场强度会显著影响克隆胚胎的融合率和体外发育能力(P<0.05),电脉冲次数对克隆胚胎体外发育促进作用不显著(P>0.05),而相同电激活条件下克隆胚胎和孤雌胚胎的体外发育能力变化趋势不同;电激活后再利用放线菌酮+细胞松弛素B(CHX+CB)处理4 h能显著提高克隆胚胎的囊胚率(P<0.05),而用二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)处理没有提高克隆胚胎囊胚率(P>0.05),但6-DMAP或CHX+CB处理均可显著提高孤雌胚胎的囊胚率(P<0.05).上述结果表明,最佳的孤雌激活条件并不一定是克隆胚胎的最佳激活条件.本研究中猪克隆胚胎的最佳激活方法为1.6 kV/cm、100μs、2次直流电脉冲间隔100μs,再辅以CHX+CB处理4 h.利用优化的激活条件成功获得了乳腺特异表达人溶菌酶的转基因猪,为猪转基因育种奠定了基础.

人溶菌酶定点突变基因在毕赤酵母中的表达及活性分析

利用PCR法将人溶菌酶(h LYZ)成熟肽与载体信号肽连接处的氨基酸残基进行定点突变,突变基因亚克隆至酵母分泌型表达载体p PICZαA,重组载体线性化后通过电击转化法转化巴斯德毕赤酵母X-33,利用含Zeocine抗生素的YPDS平板筛选高拷贝转化子。转化子酵母经甲醇诱导后取培养基离心上清液进行SDS-PAGE和活性检测。结果显示,突变体h LYZ活力和表达量较野生型均有显著提高。表明定向改变h LYZ信号肽残基性质可以提高其表达量和分泌效率。

用表达人溶菌酶基因的重组质粒防治干乳期奶牛乳腺炎

将人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ)cDNA插入由pcDNA3改造而成的pcDNAK表达载体,用获得的重组载体pcDNAKLYZ转染COS-1细胞,经免疫荧光试验证明能进行正确表达。将重组载体注射于哺乳母鼠,取其乳汁进行溶菌酶活性测定,结果显示,分泌在乳汁中的重组hLYZ高达139mg/L。根据乳汁体细胞检测结果,选择健康奶牛和乳腺炎阳性奶牛,分别在干奶时和产犊前2周2次注射重组质粒pcDNAKLYZ,注射途径为乳腺基部穿刺,注射剂量为300μg/乳区,于产犊后1个月采集奶样进行体细胞检测,结果显示,对前一泌乳期发生的奶牛乳腺炎的治愈率为91.5%,对下一泌乳期奶牛乳腺炎的预防有效率至少为96.97%。由此认为,构建的表达hLYZ基因的重组表达质粒,可以替代抗菌素类油乳剂用于干乳期乳腺炎的防治。

抗菌肽Cecropin B-人溶菌酶融合蛋白表达载体的构建

目的是构建抗菌肽B (CecropinB)和人溶菌酶 (hLyso)的融合蛋白表达载体。从pUC118-hLyso上卸下人溶菌酶基因后 ,通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽B基因 ,并将其融合到人溶菌酶基因的 5’端。将抗菌肽B基因和人溶菌酶基因按正确的阅读框架定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a,终止子位于人溶菌酶基因的 3’端。PCR鉴定及序列分析表明 ,所转化的BL2 1(DE3)菌落中含有插入CecropinB -hLyso基因的重组质粒pET32a -CB -hLyso。

利用体细胞核移植技术生产表达增强绿色荧光蛋白(EGFP)的转人溶菌酶基因(HLY)的猪克隆胚胎

由于生理特性和器官大小的原因,猪在人类疾病模型和器官移植方面具有很大的应用潜力.正因如此,猪基因结构的修饰对农业生产和人类医学两方面都意义重大.研究用脂质体介导的方法转染了猪胎儿成纤维细胞,所用结构为双标的人溶菌酶质粒(pBC1-HLY-GFP-NEO).分别对包含两个品种(五指山猪、长白猪)的5个细胞系(sw7,sw8,slw3,slw6和slw9)进行了转染.经过14d,1000μg/mL浓度G418药物的筛选处理,sw7,sw8,slw3和slw6等4个细胞系的95以上细胞都表达绿色荧光蛋白,而细胞系slw9的转染效率只有49.3.用转染效率高的3个细胞系作为核供体构建猪克隆胚胎,通过电刺激方法进行融合和激活,然后在PZM3中体外培养.48h后,重构胚的平均卵裂率为76.7;经过7d培养后观察,有18.5的胚胎发育到囊胚阶段,其中93.3的囊胚在荧光显微镜下能够发出绿色荧光,但囊胚之间的荧光强度存在差异.研究结果表明,通过脂质体介导的方法可以获得高转染效率的转基因猪胎儿成纤维细胞系,但细胞系之间的转染效率不同;用转基因猪胎儿成纤维细胞构建的重构胚,能够成功发育到囊胚阶段,而且大多数为表达绿色荧光蛋白的阳性胚胎.

毕赤酵母工程菌株表达人溶菌酶-鲎素融合蛋白发酵条件的优化

能分泌表达重组人溶菌酶-鲎素融合蛋白的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌(X33/pPICZαA-human lysozyme-TachyplesinⅠ构建的)。除了基因本身内在特性外,表达条件对外源基因的表达量也有着极显著的影响。本文在摇瓶水平上通过发酵液起始pH、甲醇诱导浓度、诱导时间这3个因素进行表达条件优化。通过生长曲线,Bradford检测以及平板扩散试验分析,获得摇瓶发酵表达人溶菌酶-鲎素融合蛋白的最佳条件为发酵液初始pH 5.0,甲醇诱导浓度为2.0%,诱导时间为72 h;Bradford检测法分析显示表达量最高,平板扩散试验显示融合蛋白对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)抑菌能力最明显,为进一步大规模发酵表达人溶菌酶-鲎素融合蛋白奠定了基础。

人溶菌酶基因的克隆和生物信息学分析

目的:克隆人溶菌酶基因并进行生物信息学分析及构建其原核表达载体。方法:采用RT-PCR法扩增人溶菌酶基因,运用相关生物信息学软件对其理化性质、疏/亲水性、功能结构域及蛋白质二级结构等进行分析。将该基因克隆入载体pET32a,PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定。结果:获得约400 bp的人溶菌酶基因,其序列与GenBank中公布序列完全一致。生物信息学分析显示人溶菌酶基因编码130个氨基酸,分子量为14.7 kDa,理论等电点为9.28,含有一个功能结构域,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成。经PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定,表明重组表达质粒构建成功。结论:该基因的克隆、生物信息学分析及原核表达质粒的构建为进一步研究其功能奠定了基础。

鸡输卵管暂态表达人溶菌酶的研究

目的:建立暂态表达人溶菌酶(hLYZ)的鸡输卵管生物反应器,以寻求一种生产药用hLYZ的有效方法。方法:将hLYZcDNA克隆入鸡输卵管特异表达载体pOV1和pOV2,将获得的重组表达载体pOV1LYZ和pOV2LYZ与一定比例的聚乙烯亚胺混合,经翅静脉注射产蛋鸡,用微球菌平板溶菌试验检测蛋清中的溶菌酶活性。结果:2个重组载体注射鸡的蛋清中均有rhLYZ的表达,pOV2LYZ的表达水平及维持时间优于pOV1LYZ。设立4个试验组,分别以不同剂量或注射次数的pOV2LYZ注射产蛋鸡,蛋清中重组酶的定量测定结果表明,1mg/2次注射组的表达效果较好,最高表达量达750μg/mL蛋清,有效表达维持7d左右,载体注射对鸡的产蛋等生理指标无明显影响。当初次载体注射鸡蛋清中的rhLYZ含量下降到注射前水平时,用同样的方法和剂量进行再次注射。结论:蛋清中的rhLYZ表达水平较初次载体注射有所提高,表达维持时间有所延长。用hLYZ特异抗体进行的Western印迹结果显示,表达在蛋清中的rhLYZ相对分子质量与天然hLYZ相同。

重组人溶菌酶研究进展

与其他来源的溶菌酶相比 ,人溶菌酶具有独特的优越性和多种多样的药理作用效果 ,在临床上具有多种重要应用价值。但天然人溶菌酶来源极其困难 ,利用重组DNA技术进行生产是解决这一难题的有效途径。迄今人们已利用化学合成或从人类细胞组织中制备cDNA等途径获取人溶菌酶基因 ,并在大肠杆菌、酵母菌和真菌表达系统中进行了表达 ,最高水平为 40mg L ,低于人乳中溶菌酶含量 ( 5 0～ 2 5 0mg L) ,虽然距离工业化生产仍有一定距离。但重组人溶菌酶发展前景看好。

家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白的生物信息学分析

目的利用生物信息学方法分析家蝇天蚕素-人溶菌酶融合基因推导的氨基酸序列。方法用ProtParam Tool、CDD、ProtScal、sopma等软件对其理化性质、疏水性/亲水性、信号肽、功能结构域及蛋白质二级结构等重要参数进行预测。结果家蝇天蚕素-人溶菌酶由187个氨基酸组成,预测相对分子质量为20 131.7,理论等电点(pI)为9.69,分子式为C862H1375N277O260S11;半衰期预测结果显示其利于基因工程表达。融合蛋白的氨基酸序列含有天蚕素家族和溶菌酶家族二者的保守结构域,二级结构主要由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成。结论分析结果为家蝇天蚕素-人溶菌酶融合基因的原核表达及表达产物的生物学功能研究奠定了基础。

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测

目的用PCR技术特异扩增人溶菌酶基因hLYZ cDNA序列,克隆至质粒pMD18-T中,获得重组质粒pMD18-T-hLYZ。方法采用EcoRⅠ/NotⅠ双酶切及PCR确认正确后,将人溶菌酶基因cDNA目的片段亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k中,通过电穿孔法转化毕赤酵母菌GS115,获得重组质粒pPIC9k-hLYZ,采用EcoRⅠ/NotⅠ双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确,在毕赤酵母菌中诱导表达产物经SDS-PAGE电泳分析,结果表明表达产物与预期大小的hLYZ蛋白分子量一致,采用微球菌溶解法进行抑菌活性测定。结论证实具有明显的抑菌作用。