人肝细胞生长因子基因表达质粒的构建及其活性研究

目的 :构建一种携带人肝细胞生长因子 (HGF)基因的表达质粒 (pUDKH) ,并对其体外活性进行研究 ,为其体内应用提供依据。方法 :从人胎盘cDNA文库用PCR方法克隆人HGF基因 ,并将其克隆至自行构建的真核表达载体 pUDK上 ,获得表达质粒 pUDKH。将pUDKH体外转染原代培养的骨骼肌细胞 ,分析其转染效率及表达上清中HGF、血管内皮生长因子 (VEGF)的表达水平 ,并采用MTT法分析不同剂量HGF表达产物对人脐静脉内皮细胞的作用。结果 :所克隆构建的携带人HGF基因的质粒 pUDKH可有效转染原代培养的骨骼肌细胞 (0 .0 5 7% ) ,并表达HGF(16～ 18ng/ 4× 10 5cells)和VEGF ,其表达产物对人脐静脉内皮细胞具有明显的增殖刺激活性 (P <0 .0 5 ) ,而且有剂量效应关系。结论 :初步证实本研究构建的质粒

人肝细胞生长因子(hdHGF)基因在毕赤酵母中的分泌表达

研究了hdHGF基因在毕赤酵母中的表达 .以人胎盘mRNA为模板 ,经逆转录、重叠PCR获得hdHGF全长和成熟基因片段 .将该基因片段克隆到pPIC9载体上 ,将重组表达质粒转化巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115,筛选mut+ 表型 ,经甲醇诱导可实现rhdHGF的分泌表达 .经摇瓶培养筛选出 4株表达水平较高的酵母工程菌株 ,SDS PAGE分析和Western印迹试验表明 ,产物分子量约为80kD ,5L发酵罐高密度培养已使生物量达 13 5g L(干重 ) ,发酵液上清总蛋白量为 8 0g L ,电泳结果表明rhdHGF表达水平为总蛋白的 12 3 % .

重组人肝细胞生长因子α的纯化与活性测定

目的纯化重组人肝细胞生长因子α(rhHGFα)包涵体,复性并测定其活性。方法大肠杆菌中表达的rhHGF琢以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的25%。离心分离包涵体,用8mol/L尿素溶解,梯度稀释复性。经SephadexG75凝胶过滤和POROSHQ阴离子交换纯化,噻唑蓝法(MTT)测定活性。结果rhHGF琢纯度达到90%以上,其刺激肝细胞生长的活性达到rhHGF标准品的80%。结论建立了纯化rhHGF琢的技术路线,rhHGF琢具有刺激原代培养大鼠肝细胞生长的作用。

重组人肝细胞生长因子-β链的高效表达及包涵体纯化研究

目的 构建重组人肝细胞生长因子 - β链 (rh HGF- β)的表达体系。筛选高效表达工程菌株 ,分离纯化 rh HGF- β。方法 用工程菌诱导培养技术筛选 rh HGF- β的高效表达菌株。从诱导起始时间、诱导时间、温度、p H值、培养基组分等方面优化 rh HGF-β的表达体系。进一步对 rh HGF-β进行粗纯化 ,采用超声波破菌 ,溶菌酶破菌 ,高速离心反复洗涤获得包涵体。采用凝胶过滤层析纯化 rh HGF-β。结果 经十二烷基硫酸钠 -多丙烯酰胺冻胶电泳 (SDS- PAGE)及扫描分析目的蛋白的表达量达 3 0 % ,经纯化后可获得纯度在 90 %以上的 rh HGF-β。结论 建立了高效稳定的 rh HGF- β表达体系 ,获得实验室水平 rh HGF-

人肝细胞生长因子真核表达质粒的构建

目的 构建肝细胞生长因子 (HGF)真核表达载体 ,为基因修饰肝细胞移植的细胞来源及建立 HGF的工程细胞株提供实验依据。方法 利用 DNA体外重组技术 ,将 HGF c DNA重组入真核表达载体 PEGFP- C1 ,限制性内切酶及测序鉴定聚合酶链式反应 (PCR)鉴定外源基因的导入。结果 重组真核表达载体 PEGFP- C1 -HGF经限制性内切酶分析 ,与理论值相符 ,测序结果与 Gene Bank对比 ,序列正确 ,插入正确。结论 成功构建带有绿荧光蛋白的 HGF基因真核表达载体 PEGFP- C1 - HGF。

四环素诱导性人肝细胞生长因子真核表达载体的构建与鉴定

目的构建四环素诱导性人肝细胞生长因子(HGF)真核表达载体。方法运用基因重组技术,将人HGFcDNA全长序列,定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MluI和SalI之间,限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果重组pBI-L-HGF真核表达载体经限制性内切酶酶切,与理论值相符;测序结果与GenBank比对,序列正确。结论本实验成功构建人HGF四环素诱导性真核表达载体pBI-L-HGF,为今后临床开展HGF基因治疗提供了一种安全可调控的基因治疗策略。

人肝细胞生长因子基因转染治疗脑梗死的实验研究

目的探讨人肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)基因蛋白在缺血半暗带中的表达水平及其治疗脑梗死及人HGF基因对脑梗死后学习记忆功能恢复的机制,为基因治疗缺血性脑血管病及血管性痴呆探索新的途径和方法。方法选择22月龄纯种健康Wistar大鼠60只,随机分为3组:假手术组20只;模型转染质粒组20只;模型转染空质粒组20只。将人HGF基因直接转染至大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠脑缺血半暗带区,利用免疫组化技术测定半暗带区HGF蛋白表达水平,并检测血管内皮细胞CD31的表达,显微镜下血管计数,使用图像分析软件测定梗死体积,利用被动逃避试验测定梗死后学习记忆功能的恢复情况,比较3组大鼠以上各项指标的差异,观察人HGF基因蛋白在缺血半暗带中的表达水平及其对脑梗死的治疗疗效。结果转染质粒组的半暗带区HGF蛋白表达水平和血管计数显著高于转染空质粒组和假手术组(P<0.01),而转染质粒组的梗死面积显著小于转染空质粒组(P<0.01),同时转染质粒组的梗死后学习和记忆功能明显提高(P<0.01)。结论人HGF基因蛋白能够在缺血半暗带区表达,通过增加梗死区的血管数量,明显缩小脑梗死体积,对脑梗死有良好的治疗作用,同时对脑梗死后学习和记忆功能的恢复也有较好作用。

人肝细胞生长因子基因表达对CCl_4损伤的人肝细胞及大鼠肝星状细胞株的影响及其机制

目的:探讨人肝细胞生长因子(hHGF)基因的表达对CCl4损伤的人肝细胞及大鼠肝星状细胞株(CFSC-2G)生物学效应的影响及其对CCl4损伤的人正常肝细胞株(HL-7702)的保护作用,进一步探讨凋亡产生的机制。方法:将获得的稳定转染HL-7702细胞克隆,分为4组,Ⅰ组为转染PCI-neo-hHGF实验组,Ⅱ组为转染PCI-neo空载体对照组,Ⅲ组为仅加入脂质体的对照组,Ⅳ组为空白对照组。采用MTT法测定细胞增殖活性。采用Westernblotting测定转染PCI-neo-hHGF的HL-7702细胞和CFSC-2G细胞中hHGF、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白质的表达。结果:HL-7702细胞转染PCI-neo-HGF并培养48h后,细胞的增殖活性明显高于PCI-neo空载体对照组、脂质体转染对照组和空白对照组HL-7702细胞(P<0.01),而且随着转染PCI-neo-HGF剂量增加,细胞的增殖活性有一定的增长趋势,但各组间比较差异无显著性(P>0.05);PCI-neo-HGF转染的HL-7702细胞caspase-3蛋白质表达量较CCl4损伤的HL-7702细胞和PCI-neo转染的HL-7702细胞明显降低,未检测到caspase-8和caspase-9蛋白质的表达;PCI-neo-HGF转染的CFSC-2G细胞caspase-3蛋白质表达量较CCl4诱导的CFSC-2G增加,caspase-9蛋白质表达也呈阳性。结论:PCI-neo-HGF可促进体外培养的HL-7702细胞的生长增殖,能够抑制CCl4损伤的HL-7702细胞的凋亡,促进大鼠CFSC-2G细胞的凋亡,其作用机制可能与上调caspase-3和caspase-9蛋白质表达有关。

人肝细胞生长因子β链在E.coli中的表达、纯化及活性测定

目的 为获得重组人肝细胞生长因子β(rhHGF-β)的高效表达体系,分离纯化rhHGF-β,以期研究其在生物学和医学中的作用。方法 从人胎肝组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术,对HGF-β基因加工修饰,与载体PBV220重组,构建rhHGF-β的表达载体,转化大肠杆菌,筛选rhHGF-β的高效表达菌株。对rhHGF-β进行粗纯化,透析复性后MTT法检测生物活性。结果 获得了rhHGF-β完整的cDNA序列,重组克隆的酶切结果与设计一致。目的 蛋白的表达量占全菌蛋白的30％,粗纯化后纯度达90％,复性产物能刺激大鼠肝细胞的增殖。结论 建立了rhHGF-β的表达体系,获得了具有生物活性的rhHGF-β,为进一步大量制备和研究HGF的生物学功能提供了重要的实验数据。

人肝细胞生长因子基因肌肉电转染对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用

目的:探讨人肝细胞生长因子(hHGF)基因肌肉电转染对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法:♂SD大鼠20只,随机分为2组,即研究组和对照组,每组10只。研究组大鼠接受hHGF肌肉电转染,在热缺血前3d将含有hHGF基因的质粒用电转染技术转入大鼠双侧胫前肌肉内,3d后建立大鼠肾热缺血模型,测定hHGF的血药浓度,并对缺血再灌注肾脏进行功能和组织学评价。结果:研究组肾组织及血浆hHGF基因表达水平显著高于对照组。研究组血肌酐水平较对照组低。组织学评价结果显示,研究组肾小管细胞凋亡评分显著低于对照组。研究组淋巴细胞、巨噬细胞及中性粒细胞浸润均较对照组少。结论:本研究结果表明hHGF基因肌肉电转染对大鼠肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用,并提示肌肉hHGF基因电转染有可能成为防治移植肾缺血再灌注损伤的安全有效的方法之一。

重组人肝细胞生长因子的纯化及鉴定

目的对重组人肝细胞生长因子（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｏｒ， ｒｈＨＧＦ）进行初步纯化及鉴定。方法 培养上清液经过离心、超滤，在ＦＰＬＣ系统上经肝素亲和层析分离纯化，用ＥＬＩＳＡ法检测、收集ｒｈＨＧＦ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电 泳鉴定纯度和相对分子质量，大鼠原代肝细胞培养法检测ｒｈＨＧＦ的生物学活性。结果ｒｈＨＧＦ主要在０．９～１．３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ 范围内被洗脱，由约６２ ０００和３４ ０００两个亚基组成，明显促进大鼠肝细胞ＤＮＡ合成。结论 经肝素亲和层析分离，从 表达山ＨＧＦ的ＣＨＯ细胞培养上清液中纯化出有活性的ｒｈＨＧＦ。

重组人肝细胞生长因子真核表达的定性及定量检测

将人肝细胞生长因子 ( human hepatocyte growth factor ,h HGF)全长 c DNA重组入 p EE1 4真核稳定表达质粒 ,用 lipofectin脂质体将 p EE1 4 /rh HGF转染入 CHO-K1细胞 ,蛋氨酸亚氨基代砜 ( methioninesulfoximine,MSX)筛选出阳性细胞克隆 .利用 RT-PCR检测 rh HGF m RNA的表达 ,通过 ELISA法测定rh HGF的蛋白表达 ,3H掺入法检测培养上清液对大鼠原代培养肝细胞 DNA合成的影响 .结果表明转染p EE1 4 /rh HGF的细胞可扩增出 h HGF特异的 396bp RT-PCR片段 ,培养上清液明显促进大鼠肝细胞 DNA的合成 ,ELISA法测出上清液中 rh HGF的含量在 8μg/L以上 ,显示 rh HGF在

重组人肝细胞生长因子β链体外生物学活性的测定

目的 建立一种稳定灵敏的方法用于检测重组人肝细胞生长因子β链 (rhHGF β)对原代培养成年大鼠肝细胞的增生作用。方法 利用噻唑蓝 (MTT)比色方法在多种实验条件下对rhHGF β进行生物学活性检测。结果 对于体外原代培养成年大鼠肝细胞 ,rhHGF β可刺激肝细胞的增生 ,且有剂量依赖效应。 结论 确定了原代培养肝细胞检测rhHGF

人肝细胞生长因子mRNA实时荧光PCR定量标准的构建

目的:构建实时荧光定量PCR标准品以定量检测人肝细胞生长因子mRNA的表达。方法:以Trizol裂解抽提法提取新鲜肝组织总RNA。以RT-PCR法制备HGF cDNA目的片段并进行扩增;以A—T载体克隆法将纯化的目的片段与pGEM—T Easy Vector连接成重组质粒并转化E. coli DH5_α。采用碱裂解法提取重组质粒,联合用直接PCR、α互补法和氨苄青霉素筛选法、EcoR Ⅰ限制性酶切和序列分析法鉴定其特异性。用聚乙二醇沉淀法纯化质粒并检测λ260nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备FQ—PCR梯度浓度标准品。结果:HGF cDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性。结论:成功构建了实时荧光PCR定量标准。

人肝细胞生长因子基因重组慢病毒载体的构建及其在成肌干细胞中的表达

目的构建人肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)基因重组pCMV-G﹠NR-U6-hHGF慢病毒载体,并检测其在成肌干细胞系C2C12细胞中的hHGF表达,为治疗失神经喉肌纤维化的研究提供依据。方法采用RT-PCR法扩增并纯化得到hHGF基因片段,并将其克隆到pCMV-G﹠NR-U6上,再将重组慢病毒载体转化入感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性菌落并行BamHI和HindⅢ双酶切鉴定。对筛选后的重组质粒阳性克隆行PCR鉴定和测序,将表达质粒与包装质粒共转染293T细胞包装hHGF慢病毒,荧光显微镜检测病毒滴度,再进一步转染C2C12细胞(分为空白对照组、空载体组、HGF重组慢病毒过表达组),最后行PCR和WB检测HGF的表达情况。结果 PCR鉴定和测序结果显示所构建的慢病毒载体正确无误,包装后的病毒滴度>1×109 IU/mL;慢病毒过表达组的HGF表达量均较空白对照组、空载体组明显增高,而且72h仍有稳定的表达。结论本实验成功构建了慢病毒载体pCMV-G﹠NR-U6-hHGF,并能够在离体培养的成肌干细胞系C2C12细胞中稳定高效表达HGF,为治疗失神经喉肌等骨骼肌纤维化、提高神经修复效果的实验研究提供了依据。

人肝细胞生长因子重组腺病毒枕大池注入对动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α表达的影响

目的观察人肝细胞生长因子重组腺病毒(Ad-HGF)枕大池注入对动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α表达的影响。方法 60只15月龄SD雄性大鼠,随机抽取50只采用肾动脉狭窄术及高脂饲料喂养法制作动脉粥样硬化模型,造模成功大鼠20只;将造模成功大鼠随机分为动脉粥样硬化组、Ad-HGF组,各10只;另10只大鼠为对照组。对照组、动脉粥样硬化组大鼠通过枕大池注入生理盐水(10μL),Ad-HGF组大鼠通过枕大池注入Ad-HGF(10μL,滴度5×109pfu/100μL);之后第10天处死大鼠,用免疫组织化学法检测大鼠脑组织中的IL-6及TNF-α,用image-proplus软件对IL-6及TNF-α在大鼠脑组织中的表达进行半定量分析,同时采用酶联免疫吸附法检测大鼠脑组织中的IL-6及TNF-α。结果免疫组织化学法检测显示,对照组、动脉粥样硬化组、Ad-HGF组大鼠脑组织中的IL-6相对表达量分别为0.216 0±0.068 1、0.331 0±0.043 3、0.174 9±0.010 7,TNF-α相对表达量分别为0.078 6±0.011 2、0.255 1±0.045 8、0.054 4±0.016 6;与对照组相比,动脉粥样硬化组IL-6、TNF-α的表达增加(P均<0.05);与动脉粥样硬化组相比,Ad-HGF组IL-6、TNF-α的表达减少(P均<0.05)。酶联免疫吸附法检测显示,对照组、动脉粥样硬化组、Ad-HGF组大鼠脑组织中的IL-6表达量分别为(50.415±6.690)、(108.302±5.695)、(66.062±9.550)pg/m L,TNF-α表达量分别为(83.836±9.442)、(209.425±15.520)、(85.996±8.445)pg/m L;与对照组相比,动脉粥样硬化组IL-6、TNF-α的表达增加(P均<0.05);与动脉粥样硬化组相比,Ad-HGF组IL-6、TNF-α的表达减少(P均<0.05)。结论动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α的表达增加,Ad-HGF可以减少动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α的表达,即抑制动脉粥样硬化大鼠脑组织炎性反应。

重组腺病毒介导人肝细胞生长因子在病理性瘢痕基因治疗研究中的应用

采用细胞内质粒DNA同源重组方法,将人肝细胞生长因子基因构建于E1,E3区缺失的复制缺陷型5型腺病毒载体上,获得携带人肝细胞生长因子基因(HGF)的重组腺病毒Ad—HGF.在293细胞中扩增后用氯化铯密度梯度离心法扩增制备Ad—HGF和Ad—GFP(携带绿色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒),然后,用Ad—GFP和Ad—HGF体外分别转染原代培养的兔耳瘢痕成纤维细胞,观察体外转染效率及表达,并以新西兰兔耳瘢痕为体内模型,观察局部瘢痕组织中一次性注射Ad—HGF后对已形成瘢痕的治疗作用.结果显示:(i)Ad—GFP感染原代培养兔瘢痕成纤维细胞后,3 d时转染效率为(36.8±14.1)％,并持续表达20 d以上.(ii)用ELISA方法检测Ad—HGF感染原代培养兔瘢痕成纤维细胞后HGF的表达,结果感染后3 d表达量约为76 ng/4.0×105细胞.(iii)用兔耳瘢痕模型观察在瘢痕内注射不同剂量(8.6×109,8.6×108,8.6×107,8.6×106pfu)的Ad—HGF,于注射后第32天肉眼可见Ad—HGF治疗组瘢痕较治疗前明显缩小、变薄,甚至与周围皮肤在同一水平.这一效应呈剂量依赖性:大、中剂量组(8.6×109,8.6×108pfu)治疗前后瘢痕肥大指数的减少有统计学意义(P<0.05),尚可见不同程度再生的丛状新生毛,低剂量组(8.6×107,8.6×106pfu)治疗后瘢痕肥大指数有减小但无统计学意义。

重组人肝细胞生长因子联合粒细胞集落刺激因子对血管新生的影响

有研究表明，重组人粒细胞集落刺激因子（rhG—CSF）和重组人肝细胞生长因子（rhG—HGF）均能诱导下肢缺血区域的血管生成。本实验旨在兔下肢缺血模型上观察rhG-CSF和rhG—HGF联合应用对缺血肢体侧枝血管新生的影响。

人肝细胞生长因子重组腺病毒的构建及其对人胎肝细胞细胞周期的影响

目的 利用AdEasy系统构建人肝细胞生长因子 (HGF)复制缺陷型重组腺病毒 (AdHGF) ,并观察其对人胎肝细胞细胞周期的影响。方法 将质粒 pUCHGF扩增、酶切获得人HGFcDNA片段 ,插入腺病毒穿梭载体质粒 pAdTrack巨细胞病毒 (CMV )启动子下游 ,构建重组穿梭载体pAdTrack CMV HGF ,线性化后与骨架载体AdEasy 1在细菌BJ5 183内同源重组得到腺病毒质粒 pAdHGF ,经 2 93细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒AdHGF ;将AdHGF体外感染人胎肝细胞 ,以RT PCR检测HGF在胎肝细胞的表达 ;同时通过流式细胞仪测定AdHGF对胎肝细胞细胞周期的作用。结果 连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAdHGF ;经 2 93细胞包装 ,3d后观察到绿色荧光蛋白 (GFP)明显表达 ,氯化铯梯度离心纯化最终获得约 4× 10 10 efu/ml滴度的重组病毒 ;AdHGF体外感染人胎肝细胞 3d后 ,HGF表达明显增加 ,流式细胞仪检测结果显示感染后的胎肝细胞由G0 /G1期向S期和G2 /M期转化。结论 利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和HGF的重组腺病毒Ad HGF ;AdHGF体外感染胎肝细胞可显著提高HGF的表达并促进肝细胞增殖 ,这将为肝细胞移植和基因治疗肝纤维化提供新的手段。