周期性机械拉伸对人肺上皮细胞增殖的影响

为了研究周期性拉伸应变对人肺上皮细胞DNA合成的影响 ,应用流式细胞术对拉伸应变下的细胞增殖动力学变化进行了分析。结果表明 :在应变为 15 % ,频率为 2 0次 /min、4 0次 /min的拉伸刺激下 ,在 2 4h ,正常人支气管上皮细胞H72 7的增殖活性指数明显降低 ,细胞的DNA合成受到显著抑制 ;4 8h后 ,人肺腺癌细胞A5 49的增殖活性明显降低 ,且拉伸时间越长 ,抑制作用越强。提示周期性拉伸应变抑制人肺上皮细胞的增殖。

阿托伐他汀对脂多糖诱导的人肺上皮细胞分泌PGE_2和IL-6的影响

目的 :探讨阿托伐他汀 (atorvastatin)对经脂多糖 (LPS)诱导人肺上皮细胞 (A5 4 9)的炎症细胞因子PGE2 和IL 6分泌的影响。方法 :对LPS诱导的人肺上皮细胞给予不同浓度的阿托伐他汀干预 ,同时设置对照组 ,分别收集其培养上清液 ,采用ELISA方法 ,比较PGE2 和IL 6浓度。结果 :①在不同浓度的LPS诱导下 ,肺泡上皮细胞不同时间分泌PGE2 和IL 6浓度明显高于未经LPS诱导的对照组 (P <0 .0 5 )。②阿托伐他汀不同浓度的干预 ,肺上皮细胞PGE2 和IL 6的分泌浓度较无阿托伐他汀干预组均有不同程度的降低 (P <0 .0 5 )。结论 :阿托伐他汀能降低脂多糖诱导的人肺上皮细胞炎症因子PGE2 和IL 6的分泌 。

周期性应变诱导人肺上皮细胞整联蛋白再分布的研究

为了探讨机械拉伸应变对人肺上皮细胞表面整联蛋白α3 、α5和 β1分布的调控作用 ,建立了体外周期性拉伸应变装置 ,并应用胞外基质蛋白———纤连蛋白 (Fn)、胶原蛋白Ⅳ (ColⅣ )裱衬基底膜 ,激光共聚焦显微镜分析了在应变为 15 % ,频率为 4 0次 /min的拉伸刺激下 ,正常人肺上皮细胞H72 7表面α3 、α5和 β1整联蛋白的再分布 .结果表明 :在人肺上皮细胞H72 7中 ,α3 、α5和 β1整联蛋白是对拉伸应变敏感的膜受体 ,周期性拉伸刺激可诱导其激活 ,使之发生分布的重组 ,并向基底层转移 ,形成局部粘附连接 ,增强了整联蛋白受体与其特异性配体的结合能力 .结果提示 :一个有效的局部粘附连接的形成是受体聚集和配体占据共同启动的一个协调反应 ,该反应可能参与了细胞响应机械应力的起始过程 ,可能进一步通过力 化学信号的耦合或张力整合的形式 。

机械拉伸下人肺上皮细胞增殖及整联蛋白再分布

目的 探讨机械拉伸应变对人肺上皮细胞增殖及其膜受体———整联蛋白α5、β1 再分布的调控作用。方法 建立体外周期性拉伸装置 ,应用流式细胞术测定细胞的增殖活性 ,激光共聚焦显微镜分析整联蛋白α5、β1 再分布。结果 在应变为 15 % ,频率为 2 0次 min、40次 min的拉伸刺激下 ,2 4h后 ,细胞的增殖活性指数明显降低 ,H72 7细胞的DNA合成受到显著抑制。在 40次 min的拉伸频率下 ,整联蛋白α5、β1 的分布发生重组并向基底层转移 ,形成局部粘附连接。结论 整联蛋白α5、β1

机械拉伸对人肺上皮细胞粘附及[Ca^(2+)]i的影响

目的 探讨周期性拉伸应变对人肺上皮细胞H72 7的力学性质及其 [Ca2 + ]i的调控作用。方法 应用微管吸吮系统测定细胞与基底间的粘附力和细胞的铺展面积 ,用荧光探针Fluo 3 /AM测定拉伸应变对人肺上皮细胞H72 7[Ca2 + ]i的影响。结果 在应变为 15 %,频率为 40次 min的拉伸刺激下 ,与其静态对照组相比 ,细胞与基底间的粘附力和细胞的铺展面积均增加 ;拉伸 5min后 ,[Ca2 + ]i比对照组有明显增加 ,用三七总皂苷阻断胞内Ca2 + 离子通道后 ,细胞对应变的响应仍表现出 [Ca2 + ]i的升高 ,但与未加三七总皂苷的实验组相比 ,[Ca2 + ]i响应应变后的升高由原来的 3 .4倍的增加降低为 1.5倍的增加。结论 在人肺上皮细胞H72 7响应周期性拉伸应变的过程中 ,[Ca2 + ]i的升高既有胞外钙内流的参与 ,也有胞内钙库的释放作用 。

周期性机械拉伸对人肺上皮细胞增殖及粘弹性的影响

采用FX-4000基底加载系统对体外培养人肺上皮细胞A549施加周期性拉伸应变,通过流式细胞仪和微管吸吮技术,研究了不同波形的周期性机械拉伸对A549细胞的增殖及粘弹性的影响。结果表明:分别采用正弦波和方波,对A549细胞施加15%拉伸应变、频率30次/min周期性机械拉伸4 h,与对照组相比,正弦波拉伸对A549细胞增殖无显著影响,细胞的粘弹性参数k1和k2值有所减小,μ值无统计学差异。方波拉伸在显著抑制A549细胞增殖同时,细胞的粘弹性参数k1,k2和μ值均明显减小。从力学的角度证实了细胞骨架参与细胞生长的过程。

白色念珠菌对人肺上皮细胞的黏附作用及其影响因素

目的 在体外研究白色念珠菌临床分离株对人肺上皮细胞的黏附作用及其影响因素。方法 将不同浓度的白色念珠菌和人肺上皮细胞在体外作用不同的时间 ,固定后经革兰染色 ,在倒置显微镜下计数白色念珠菌黏附人肺上皮细胞的黏附数。观察胰酶、白色念珠菌培养上清液、加热等处理因素对白色念珠菌黏附人肺上皮细胞的影响。结果 白色念珠菌的黏附与浓度、时间有关 ,在 5× 10 3～ 5× 10 7CFU/ml范围内 ,黏附数随浓度的增加而增加。该黏附作用 15min后趋于饱和。在 15min内 ,白色念珠菌对肺上皮细胞的黏附随时间的延长而增强。白色念珠菌经胰酶或 10 0℃ 30min处理后黏附数降低 ,培养上清液及上清液经加热或胰酶处理后都能抑制白色念珠菌的黏附作用。结论 白色念珠菌对人肺上皮细胞的黏附作用与浓度和时间有依赖的关系 ,是特异性黏附过程。不同因素处理白色念珠菌和肺上皮细胞 ,其黏附数发生改变 ,说明黏附作用与白色念珠菌表面黏附因子和人肺上皮细胞表面的黏附受体的数量和结构有关。

人肺上皮细胞、成纤维细胞、肺癌细胞间的异源间隙连接通讯

目的:探讨人肺成纤维细胞、上皮细胞间以及与人肺癌细胞的细胞间隙连接通讯(gapjunctionalintercel lularcommunication, GJIC)特性,以进一步了解GJIC在人肺癌发生、发展中的作用。方法:利用预标记荧光染料传输技术研究了人胚肺上皮类型细胞(HLEC)与人肺成纤维细胞HLF、肺癌PG细胞及其Cx43转染子PG/C4间的异源通讯,Cx43免疫荧光染色和Northern杂交分别检测Cx43蛋白和mRNA的表达。结果:尽管这些细胞除PG外都表达Cx43和具有强的同源通讯功能,但人肺上皮细胞HLEC与成纤维细胞间不能建立GJIC,上皮来源的人肺癌PG细胞与正常上皮细胞HLEC通讯功能缺陷; 具有强的同源通讯功能的Cx43转染子PG/C4并未建立与上皮细胞间的通讯功能。结论:人肺不同类型细胞间的GJIC存在选择性,细胞癌变后丧失了与其来源一致的上皮细胞间的通讯, Cx43基因表达并不足以建立二种细胞间的GJIC。

不同质量浓度脂多糖对人肺上皮细胞活性的影响

目的通过不同质量浓度脂多糖(LPS)诱导肺上皮细胞,观察细胞活性的变化,为急性肺损伤(ALI)细胞实验提供基础数据。方法用不同质量浓度LPS(0.050,0.100,0.125,0.250,0.500,1.000,5.000,10.000,50.000,100.000μg/m L)刺激人肺上皮细胞,建立ALI细胞模型,48 h后应用CCK-8试验检测LPS对人肺上皮细胞的活性的影响,并采用RT-PCR法测定细胞间黏附分子-1(ICAM-1)m RNA表达量。结果 10μg/m L LPS可诱导肺上皮细胞活性明显下降,ICAM-1 m RNA表达量显著升高(P<0.05),但细胞坏死不明显。当LPS质量浓度高于50μg/m L时肺上皮细胞活性持续下降,细胞坏死比较明显。结论 LPS质量浓度控制在10~50μg/m L适合ALI细胞模型。

白藜芦醇对脂多糖诱导的人肺上皮细胞焦亡的保护机制研究

目的:探究白藜芦醇对脂多糖(LPS)诱导的人肺上皮细胞(又称BEAS-2B)增殖、炎症因子释放和焦亡的影响。方法:用CCK-8法检测LPS和LPS与白藜芦醇联用对BEAS-2B细胞增殖的影响;采用ELISA法检测细胞上清炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-18(IL-18)表达以及qPCR和Western blot检测焦亡基因NLRP3、Gasdermin D、Caspase-1、ELAVL1的表达;分析其对细胞活力、BEAS-2B细胞中细胞因子的含量及其焦亡相关基因、相关蛋白表达的影响。结果:LPS可以抑制BEAS-2B细胞的增殖,同时可以促进炎症因子的表达,经qPCR和Western blot检测结果表明LPS可以促进NLRP3、Gasdermin D、Caspase-1、ELAVL1基因的表达;其经用白藜芦醇处理48 h后,可以有效逆转LPS所引起的细胞增殖受抑制和炎症因子高表达的现象;此外,NLRP3、Gasdermin D、Caspase-1、ELAVL1的表达也部分受抑制。结论:白藜芦醇通过减少炎症因子的释放和NLRP3、Gasdermin D、Caspase-1、ELAVL1表达对LPS诱导的BEAS-2B焦亡起到一定的保护作用。

贞芪颗粒抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌黏附及侵袭人肺上皮细胞的作用机制研究

目的探究贞芪颗粒(ZQ)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)黏附及侵袭人肺上皮细胞(BEAS-2B细胞)的抑制作用与机制。方法常规培养BEAS-2B细胞,使用不同浓度(7.5、10、12.5 mg/mL)ZQ处理细胞,同时设置对照组(Control组,只含DMEM培养液的细胞),细胞计数试剂盒8(CCK-8)法测算细胞活力,以对细胞活力无显著影响的浓度作为ZQ的实验浓度。取部分细胞随机分为Control组、ZQ组,ZQ组给予实验浓度ZQ进行预处理后建立MRSA感染BEAS-2B细胞模型,平板菌落计数法观察MRSA黏附及侵袭细胞的能力;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测ZQ对MRSA黏附基因(fnbA、clfA、clfB、icaA、cna、efb、sasX)以及BEAS-2B细胞紧密连接(TJ)蛋白编码基因(claudin-1、ZO-1、occludin)的影响;Western blotting法检测ZQ对BEAS-2B细胞TJ蛋白表达的影响。结果与Control组比较,7.5、10 mg/mL浓度的ZQ组细胞活力高(P<0.01),12.5 mg/mL组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)。因此选取12.5 mg/mL为ZQ的实验浓度。与Control组比较,ZQ组MRSA菌落数少(P<0.05),相对黏附率、相对侵袭率低(P<0.05),fnbA、clfA、clfB、icaA、cna基因表达低(P<0.05),efb、sasX表达差异无统计学意义(P>0.05),claudin-1、ZO-1、occludin基因与TJ蛋白表达均高(P<0.01)。结论ZQ可以抑制MRSA对BEAS-2B细胞的黏附及侵袭,该作用与降低MRSA黏附基因和提升TJ蛋白表达有关。

长链非编码RNA生长阻滞特异转录物5／微小RNA 200c-3p／血管紧张素转换酶2信号轴参与呼吸窘迫综合征人肺上皮细胞A549的凋亡

目的探究长链非编码RNA生长阻滞特异转录物5／微小RNA200e-3p／血管紧张素转换酶2（1ncRNAGAS5／miR-200c-3p／ACE2）信号轴是否参与呼吸窘迫综合征（ARDS）肺上皮细胞的凋亡。方法构建ARDS大鼠模型，实验分为对照组（Control组）、LPS处理组（ARDS组）、LPS＋pcDNA处理组（ARDS＋pcDNA组）和LPS＋pcDNA-GAS5处理组（ARDS＋pcDNA-GAS5组）。ARDS大鼠构建6h后收集4组大鼠动脉血及肺组织，血气分析仪进行测定氧分压（PaO2）和二氧化碳分压（PaCO2），并观察GAS5的表达变化。随后，用LPS处理人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549，分为未处理、LPS、LPS＋pcDNA、LPS＋pcDNA-GAS5、LPS＋pcDNA-GAS5＋pre-NC和LPS＋pcDNA-GAS5＋miR-200c．3pmimic组。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测lncRNAGAS5、ACE2和miR-200c-3p的表达水平；RNA免疫沉淀和RNA下拉（pull-down）实验用于检测GAS5与miR．200c-3p的结合与调控：Westernblotting法检测ACE2的蛋白表达；流式细胞术用于检测A549细胞的凋亡。组间数据比较采用t检验。结果ARDS大鼠实验表明与ARDS＋pcDNA组相比，ARDS＋pcDNA-GAS5组P0，值显著升高[（81．5±3．3）比（57．5±5．1）mmHg，t=4．850，P〈0．05]，PC02值显著降低[（50．6±1．9）比（64．0±1．9）mmHg，t=5．940，P〈0．05]。细胞实验中，与Control组相比，LPS组A549细胞中IncRNAGAS5的表达显著下降（0．43±0．01比1．01±0．01，t=0．242，P〈0．05）。与LPS＋pcDNA组相比，LPS＋pcDNA-GAS5组ACE2的表达水平显著升高（0．85±0．04比0．34±0．02，t=1．800，P〈0．05）：与LPS＋pcDNA-GAS5＋pre-NC组相比，LPS＋pcDNA-GAS5＋miR-200c-3pmimic组ACE2的表达水平显著降低（0．62±0．01比0．84±0．02，t=9．440，P〈0．05）。与未处理组相比，LPS组A549细胞凋亡百分比明显升高（25．90±0．61比7．90±0．22，t=0．257，P〈0．05）；与LPS＋pcDNA组相比，LPS＋pcDNA-GAS5组凋亡百分比明显降低（10．50±0．37比26．37±0．45，t=1．760，P〈0．05）；与LPS＋pcDNA-GAS5＋pre-NC组相比，LPS＋pcDNA-GAS5＋miR-200c-3pmimic组细胞凋亡百分比显著升高（19．07±0．56比10．87±0．26，t=0．643，P〈0．05）。结论ARDS模型中，lncRNAGAS5下调促进miR-200c-3p表达，使ACE2表达下降，从而使肺上皮细胞凋亡增加，促进ARDS进展。

PI3K/Akt信号通路对转化生长因子β1诱导的人肺上皮-间质细胞转分化的影响

目的:探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)通路在转化生长因子β1(TGF-β1)体外诱导的人肺上皮细胞A549间充质化过程中的作用。方法:将体外培养的A549细胞随机分成3组:正常对照组、TGF-β1组及抑制剂组,正常对照组不加入TGF-β1,TGF-β1组加入10ng/mLTGF-β1,抑制剂组加入TGF-β1(10ng/mL)和PI3K的抑制剂Ly294002(10nmol/L),72h后通过RT-PCR检测各组A549细胞上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cad)及间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的变化,ELISA方法检测间充质细胞标志物纤连蛋白(Fn)表达的变化,Westernblot检测Akt磷酸化(p-Akt)水平的变化。所有实验至少重复3次。结果:正常体外培养的A549细胞有E-cad表达及微量的α-SMA、Fn、p-Akt表达;TGF-β1组E-cad的表达下调,α-SMA、Fn、p-Akt的表达上调;抑制剂组与TGF-β1组比较E-cad的表达上调,α-SMA、Fn、p-Akt的表达明显抑制。结论:PI3K/Akt途径参与TGF-β1介导的肺上皮-间质细胞转分化过程,PI3K特异性抑制剂Ly294002可有效抑制TGF-β1介导的肺上皮-间质细胞转分化过程。

自发永生性转化人胚肺上皮细胞系HLEC的建立及鉴定

目的 对源自人胚肺组织原代培养、形态似上皮类型的细胞系———人肺上皮细胞(HLEC)的生物学特 性进行鉴定,为相关研究和应用提供模型和依据。 方法 分别采用相差显微镜下观察、细胞计数、β 半乳糖苷酶 染色、免疫荧光细胞化学。人Alu序列PCR扩增、染色体计数、软琼脂集落形成实验和裸鼠致瘤实验对HLEC的形 态学特征、生长特性、衰老状态、上皮细胞标志物、来源、细胞遗传学特点和恶性转化等生物学特性进行研究鉴定。 结果 HLEC角蛋白和上皮型细胞间黏附分子钙黏着素E cadherin免疫荧光染色阳性,染色体众数在41～44,人 Alu序列PCR扩增结果阳性,β 半乳糖苷酶阳性细胞的比例未见随细胞代数的增加而升高,软琼脂和裸鼠体内均不 生长,微丝及黏着斑结构正常。 结论 HLEC细胞具有永生化细胞特征、属相对正常人肺上皮亚二倍体细胞,可 用于肺癌癌变机理研究和癌细胞的相对正常对照。

转化生长因子-β1诱导人肺上皮细胞E-钙黏蛋白表达的变化

目的观察重组人转化生长因子-β1(rhTGF-β1)诱导人肺上皮细胞(A549)E-Cad蛋白表达的变化。方法将体外培养的A549用不同浓度的rhTGF-β1干预,48h后收集蛋白用Westerblot和间接免疫荧光方法检测上皮细胞表型E-钙黏蛋白(E-Cad)表达的变化。结果rhTGF-β1诱导A549下调上皮细胞表型E-Cad表达,并呈浓度依赖性。结论rhTGF-β1可诱导A549细胞E-Cad表达下调,支持在肺上皮细胞发生上皮细胞-间质转化(EMT)的观点。

铬和锰在体外对肺上皮细胞的细胞毒性作用

铬、镍和锰是焊接工作所产生的烟雾中主要的金属粒子,在流行病学调查中证实,它们和焊接工作中出现的职业性哮喘密切相关。研究发现,铬和锰,但不是镍,在0.2～200μmol浓度范围内,对正常人肺上皮细胞具有细胞毒性作用。这种细胞毒性作用与细胞内磷酸蛋白的增高,以及随后释放的炎症因子IL-6和IL-8有关,但未观察到TNF-a的释放。细胞内磷酸蛋白水平在到达细胞毒性作用浓度前就已经发生了改变,IL-6和IL-8产物相比对照组增高了4.4倍。IL-6和IL-8从肺上皮细胞释放后将免疫细胞“募集”到组织损伤的部位。因此,观察到的铬和锰对肺上皮细胞的作用论证了这些金属对上皮细胞的毒性作用是通过“募集”免疫系统细胞而产生。

冬季北京城区PM2.5诱导人肺上皮细胞系A549中多环芳烃受体(AhR)通路的激活

使用冬季北京市城区的细颗粒物(PM2.5)评估其对人肺上皮细胞系A549中多环芳烃受体(AhR)通路的激活作用.利用CCK-8法检测细胞暴露PM2.5后的存活率,选取50%抑制浓度(IC50)作为细胞暴露剂量,采用Western blot和免疫荧光检测PM2.5暴露诱导AhR定位变化,采用荧光定量PCR和Western blot检测AhR的靶基因CYP1A1的转录和翻译水平改变,应用双荧光素酶报告基因法测定AhR与靶基因结合位点(XRE)的活性,利用酶标仪测定CYP1A1的酶活性改变.结果显示,随着暴露时间的增加,AhR逐渐从细胞质易位至细胞核;CYP1A1 mRNA和蛋白质的表达水平也呈时间依赖性显著增加;AhR与XRE结合活性的增加表明了PM2.5诱导CYP1A1增加的调节机制;最后引起细胞内CYP1A1酶活性显著增加.研究表明,来自冬季北京城区的PM2.5样品可激活A549细胞的AhR通路,提示AhR介导的信号途径可能与PM2.5的暴露毒性有关.

鱼腥草注射液诱导人肺腺上皮细胞β防御素2 mRNA表达

目的:探讨鱼腥草注射液体外刺激人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)后人β防御素2(human beta-defensin2,HBD-2)基因表达的情况,并研究HBD-2表达对鱼腥草注射液浓度和作用时间的依赖效应。方法:体外培养SPC-A-1细胞,设置12.5、25、50、100和200μg/ml5个鱼腥草注射液浓度梯度,刺激贴壁生长的SPC-A-1细胞8h,根据细胞HBD-2mRNA表达量明确作用最佳的浓度;最佳作用浓度鱼腥草注射液作用0、1、2、4、8、16、24和48h,根据细胞HBD-2mRNA表达量明确最佳作用时间。SPC-A-1细胞HBD-2mRNA表达的情况应用逆转录聚合酶链式反应技术检测。结果:不同浓度鱼腥草注射液刺激SPC-A-1细胞后,HBD-2表达与刺激剂量(rs=0.829,P=0.042)和刺激时间(rs=0.914,P=0.003)具有一定的相关性,当鱼腥草浓度为100μg/ml、刺激8h时,HBD-2mRNA表达水平达到最高。与空白对照组和白细胞介素1β对照组比较,100μg/ml鱼腥草注射液作用8h可以上调SPC-A-1细胞HBD-2mRNA的表达。结论:鱼腥草注射液可诱导HBD-2基因的表达增强,最佳浓度为100μg/ml,最佳刺激时间为8h。

卡介苗对人肺腺上皮细胞表达Fall-39 mRNA及抗菌活性的影响

目的 探讨卡介苗能否增强 Fall- 39在人肺腺上皮 SPC- A- 1细胞中的表达 ,分离鉴定卡介苗刺激作用的有效胞壁蛋白组份 ,并检测其抗菌活性。方法 根据 Gen Bank中人 Fall- 39的 c DNA序列资料 ,设计特异性引物 ,应用 RT- PCR法检测 SPC- A - 1细胞 Fall- 39m RNA的表达 ,采用超声破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、SephadexG- 75柱层析等方法分离卡介苗胞壁蛋白质组份 ;采用琼脂糖弥散杀菌法检测 SPC- A- 1细胞培养上清的抗菌活性。结果 卡介苗刺激 SPC- A - 1细胞 Fall- 39m RNA的表达明显增强 ,而且这种诱导增强表达在一定范围内具有刺激物剂量和时间依赖性。卡介苗胞壁蛋白层析所得 6个组份中 ,组份 4 (相对分子质量范围约 2 1～ 2 9× 10 3)诱导 SPC-A- 1细胞 Fall- 39m RNA的表达增强约 8.5倍 ,其培养上清的抗菌活性显著增强。结论 BCG胞壁蛋白是 Fall- 39基因的激活因子 。