丙泊酚对高糖诱导的人肾小球系膜细胞氧化应激和炎症反应的影响

目的探讨丙泊酚对高糖诱导的人肾小球系膜细胞损伤的影响。方法该研究于2021年3月至2022年3月进行。体外培养人肾小球系膜细胞,采用30 mol/L葡萄糖诱导建立人肾小球系膜细胞细胞损伤模型,用丙泊酚浓度10、20、40μmol/L处理细胞,细胞分为对照组、高糖组、高糖+低、中、高剂量丙泊酚组。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛、活性氧、白细胞介素(IL)-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)IL-1β表达;蛋白质印迹法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、IL-10、TNF-α、IL-1β蛋白表达。结果高糖组的丙二醛[(16.7±1.7)mmol/L比(3.8±0.4)mmol/L]、活性氧[(9.6±0.9)μg/L比(3.5±0.3)μg/L]、IL-10[(65.3±6.9)ng/L比(26.9±3.2)ng/L]、TNF-α[(105.6±10.9)ng/L比(42.8±4.8)ng/L]和IL-1β[(79.7±8.2)ng/L比(31.2±3.6)ng/L]明显高于对照组;iNOS、ICAM-1、MCP-1、IL-10、TNF-α、IL-1β蛋白表达明显高于对照组;SOD、GSH-Px明显低于对照组,均P<0.05。高糖+低剂量丙泊酚组、高糖+中剂量丙泊酚组、高糖+高剂量丙泊酚组的丙二醛、活性氧、IL-10、TNF-α和IL-1β明显低于高糖组;iNOS、ICAM-1、MCP-1、IL-10、TNF-α、IL-1β蛋白表达明显低于高糖组,均P<0.05;SOD、GSH-Px明显高于高糖组,均P<0.05。结论丙泊酚能减轻高糖诱导的人肾小球系膜细胞氧化应激和炎症反应,发挥保护肾脏的作用。

circ_WBSCR17通过调节miR-30a-5p/JAK1轴减轻高糖诱导的人肾小球系膜细胞纤维化和炎症反应

目的探讨circ_WBSCR17通过调节miR-30a-5p/JAK1轴对高糖诱导的人肾小球系膜细胞纤维化和炎症的影响。方法将人肾小球系膜细胞HMCL分为NG组(5.5 mmol/L葡萄糖处理HMCL细胞)、HG组(30 mmol/L葡萄糖处理细胞)、si-NC组(30 mmol/L葡萄糖+转染si-NC)、si-circ_WBSCR17组(30 mmol/L葡萄糖+转染si-circ_WBSCR17)、si-circ_WBSCR17+inhibitor-NC组(30 mmol/L葡萄糖+si-circ_WBSCR17和inhibitor-NC共转染)、si-circ_WBSCR17+miR-30a-5p inhibitor组(30 mmol/L葡萄糖+si-circ_WBSCR17和miR-30a-5p inhibitor共转染);RT-qPCR检测细胞中circ_WBSCR17、miR-30a-5p的表达;CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-8表达水平;Western blot检测细胞中JAK1、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bax、转化生长因子-β1(TGF-β1)、纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原蛋白(collagenⅣ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;荧光原位杂交(FISH)实验检测circ_WBSCR17的分布情况,双荧光素酶报告基因实验分别验证circ_WBSCR17和miR-30a-5p、JAK1的关系。结果与NG组比较,HG组HMCL细胞增殖能力降低,TNF-α、IL-6和IL-8水平、p-JAK1/JAK1、p-STAT1/STAT1、p-STAT3/STAT3、Bax、TGF-β1、FN、collagenIV、α-SMA蛋白表达升高(P<0.05);与HG组和si-NC组比较,si-circ_WBSCR17组HMCL细胞中miR-30a-5p表达、OD450值、PCNA表达升高,TNF-α、IL-6和IL-8水平、circ_WBSCR17、p-JAK1/JAK1、p-STAT1/STAT1、p-STAT3/STAT3、Bax、TGF-β1、FN、collagenIV、α-SMA表达降低(P<0.05);抑制miR-30a-5p减弱了敲低circ_WBSCR17对HMCL细胞增殖的促进作用,增强了细胞凋亡、细胞纤维化和炎症反应;FISH实验证实circ_WBSCR17主要分布在细胞质中;双荧光素酶报告基因实验证实circ_WBSCR17、JAK1与miR-30a-5p存在靶向调控关系。结论敲低circ_WBSCR17可通过调节miR-30a-5p/JAK1轴,进而减轻高糖诱导的人肾小球系膜细胞纤维化和炎症。

基于NLRP3/Caspase-1信号通路探讨益肾降糖饮对人肾小球系膜细胞焦亡相关蛋白表达的影响

目的基于NLRP3/Caspase-1信号通路探讨益肾降糖饮含药血清对高糖高胰岛素培养下人肾小球系膜细胞焦亡相关蛋白表达的影响。方法取对数生长期的人肾小球系膜细胞分为空白组、模型组和益肾降糖饮含药血清低、中、高剂量组。空白组采用10%的大鼠空白血清DMEM培养液;模型组和低、中、高剂量组在4.5 mg/mL葡萄糖和10μg/mL胰岛素诱导后,分别加浓度为10%的大鼠空白血清和浓度为0.39、0.78、1.56 g/mL的益肾降糖饮含药血清干预,培养48 h。qPCR检测5组细胞NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)mRNA相对表达水平,Western blot检测5组细胞NLRP3、Caspase-1的蛋白表达量。结果与空白组比较,模型组Caspase-1、NLRP3 mRNA相对表达水平均升高(P<0.05);与模型组比较,低剂量组Cas⁃pase-1、NLRP3的mRNA相对表达水平及NLRP3蛋白表达量均下降(P<0.05),Caspase-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);中剂量组Caspase-1、NLRP3 mRNA相对表达水平及蛋白表达量均下降(P<0.05);高剂量组Cas⁃pase-1、NLRP3 mRNA相对表达水平及蛋白表达量均下降(P<0.05)。与低剂量组比较,中、高剂量组Caspase-1、NLRP3 mRNA相对表达水平及蛋白表达量均下降(P<0.05)。结论益肾降糖饮含药血清可通过调控NL⁃RP3/Caspase-1信号通路上NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达水平和蛋白表达量,从而抑制高糖及高胰岛素刺激引起的肾小球系膜细胞焦亡。中、高剂量组对NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达水平和蛋白表达量的调控优于低剂量组。

西红花酸调控Nrf2/HO-1通路抑制高糖诱导人肾小球系膜细胞铁死亡

目的 探讨西红花酸抑制高糖诱导人肾小球系膜细胞(HGMCs)铁死亡的作用机制。方法 (1)体外培养HGMCs,将细胞分为空白对照组、阴性对照组(60 mmol·L^(-1)甘露醇)和葡萄糖实验组(30、60、90 mmol·L^(-1)),干预培养48 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率,采用RT-qPCR法检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)mRNA表达,以确定高糖诱导HGMCs的造模条件。(2)体外培养HGMCs,分为空白对照组和西红花酸给药组(5、25、125μmol·L^(-1)),干预培养24 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率。(3)体外培养HGMCs,将细胞分为空白对照组、模型组(60 mmol·L^(-1)葡萄糖)、西红花酸组(60 mmol·L^(-1)葡萄糖+5、25、125μmol·L^(-1)西红花酸)及阳性对照组[60 mmol·L^(-1)葡萄糖+1μmol·L^(-1)铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)]。干预培养48 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western Blot法检测细胞GPX4、血红素加氧酶-1(HO-1)、转铁蛋白受体(TFRC)蛋白表达;采用免疫荧光法与Western Blot法检测HGMCs细胞核中核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白表达。结果 (1)与空白对照组比较,阴性对照组的细胞存活率及GPX4mRNA表达水平无明显差异(P>0.05);30、60、90 mmol·L^(-1)葡萄糖实验组的细胞存活率及GPX4 mRNA表达水平均显著降低(P<0.01),且以60 mmol·L^(-1)浓度组作用最为明显。(2)与空白对照组比较,5μmol·L^(-1)西红花酸组的HGMCs细胞存活率无明显影响(P>0.05),25、125μmol·L^(-1)西红花酸组的HGMCs细胞存活率显著升高(P<0.01),该浓度西红花酸对HGMCs无明显细胞毒性。(3)与空白对照组比较,模型组的HGMCs细胞存活率显著降低(P<0.01);细胞内ROS水平显著上升(P<0.01);GPX4蛋白表达水平明显下降(P<0.05);细胞核内Nrf2蛋白表达显著下调(P<0.001)。与模型组比较,25、125μmol·L^(-1)西红花酸组的HGMCs细胞存活率明显升高(P<0.05);细胞内ROS水平均显著下降(P<0.01),并呈浓度依赖性;西红花酸125μmol·L^(-1)组HGMCs细胞GPX4、HO-1蛋白表达水平明显上调(P<0.05,P<0.01),与阳性对照药物Fer-1效果相近(P>0.05);西红花酸125μmol·L^(-1)组HGMCs细胞核内Nrf2蛋白表达显著上调(P<0.001)。各组间的HGMCs细胞TFRC蛋白表达无明显差异(P>0.05)。结论 西红花酸能够抑制高糖诱导HGMCs细胞铁死亡,减少细胞内ROS生成,上调GPX4蛋白表达,可能与上调Nrf2/HO-1通路密切相关。

大黄酸对人肾小球系膜细胞功能的影响

目的 探讨大黄酸防治糖尿病肾病的作用机制。方法 用细胞培养、ELISA、明胶酶谱及免疫沉淀、Westernblot等技术 ,研究了大黄酸对肾小球系膜细胞转化生长因子 (TGFβ1 )、基质金属蛋白酶 2 , 9(MMP 2和MMP 9)及p38活化丝裂原活化蛋白激酶 (p38MAPK)活性的作用。结果 大黄酸可显著抑制肾小球系膜细胞的增殖 ,对抗高糖诱导肾小球系膜细胞TGFβ1 活性升高的作用 ;对高糖诱导肾小球系膜细胞MMP 2 ,MMP 9,pro MMP 2及pro MMP 9的活性增加无明显影响 ,但可明显对抗高糖引起的肾小球系膜细胞p38MAPK活性增加。结论 大黄酸减少FN的分泌可能与其降低p38MAPK及TGFβ1 活性有关。

高糖通过SGK_1通路促进人肾小球系膜细胞合成结缔组织生长因子

目的研究血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1(SGK1)在高糖诱导人肾小球系膜细胞(HMC)产生结缔组织生长因子(CTGF)中的作用,探讨SGK1在糖尿病肾病(DN)肾小球硬化中的作用机制。方法HMC分为低糖组(5·5mmol·L-1D-葡萄糖)、高糖组(25mmol·L-1D-葡萄糖)和甘露醇对照组(19·5mmol·L-1甘露醇和5·5mmol·L-1D-葡萄糖),刺激24、72h后,采用RT-PCR方法和West-ernblot方法检测CTGFmRNA及蛋白的表达;将带有SGK1显性激活型突变体质粒(pIRES2-EGFP-S422DhSGK1,SD)和带有SGK1显性失活型突变体质粒(pIRES2-EGFP-K127NhSGK1,KN)分别瞬时转染HMC;同时,设空质粒(PIRES2-EGFP,FP)转染组和未转染组(NT)为对照。分别用低糖(LG,5·5mmol·L-1D-葡萄糖)和高糖(HG,25mmol·L-1D-葡萄糖)刺激24、72h后,采用RT-PCR方法和Western blot方法检测CT-GF的mRNA及蛋白的表达。结果与低糖组和甘露醇组相比较,在高糖刺激下,HMC中CTGF mRNA及蛋白的表达明显上调;低糖环境下,转染SD的HMC与转染FP、NT组比较,其CTGFmRNA和蛋白的表达明显增加。转染KN的HMC与转染FP、NT组比较,其CTGF mRNA和蛋白的表达差异无显著性;高糖环境下转染SD的HMC与转染KN、转染FP、NT组比较,其CTGF mRNA和蛋白的表达明显增加。转染KN的HMC与转染FP、NT组比较,其CTGF mRNA和蛋白的表达明显减少。结论在DN中,高糖能促进HMC的CTGF mRNA及蛋白的表达,并且可以通过SGK1介导的信号通路来诱导人肾小球系膜细胞增加合成CTGF,这种新发现的信号通路,表明SGK1可能通过促进CTGF的合成来参与糖尿病肾病肾小球纤维化的发生。

地龙成分对高糖刺激下人肾小球系膜细胞转化生长因子β_1和结缔组织生长因子表达的研究

目的:研究地龙成分含药血清对高糖刺激下人肾小球系膜细胞(HMC)增殖、分泌转化生长因子β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)的影响,并探讨其对糖尿病肾脏疾病的可能防治机制。方法:以HMC为研究对象,将培养的HMC分为空白对照组、高糖刺激组、地龙成分低、中、高剂量组和福辛普利组,用家兔的含药血清给药,分别给予相应处理24h、48 h和72 h后,采用4-甲偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,48 h的上清液采用ELISA法检测TGF-β1和CTGF的表达。结果:在同一时间点内,地龙低、中、高剂量组对HMC增殖的抑制作用不断增加,福辛普利组对HMC增殖的抑制作用和地龙中剂量组相当,在24 h、48 h和72 h内,各药物干预组对HMC增殖的抑制作用也不断增大,以地龙高剂量组最佳;与空白对照组比较,高糖刺激组上清液中TGF-β1和CTGF的含量明显增多;与高糖刺激组比较,地龙成分低、中、高剂量组随着药物浓度的增加,TGF-β1和CTGF的含量减少,福辛普利组上清液中TGF-β1和CTGF的含量与地龙成分中剂量组相当,但高于高剂量组,都具有统计学意义。结论:地龙成分对HMC增殖的抑制作用在一定范围内呈浓度、时间依赖关系,能够降低TGF-β1和CTGF的含量,以高剂量组最佳,优于福辛普利组,提示地龙成分可能通过抑制HMC的异常增殖和下调TGF-β1和CTGF的表达而发挥对糖尿病肾病的保护作用。

绞股蓝皂苷对AGEs诱导下人肾小球系膜细胞中RAGE及转化生长因子-β_1表达的影响

目的观察绞股蓝皂苷(gypenosides,GP)对晚期糖基化终末产物(advanced glycation endproducts,AGEs)诱导下人肾小球系膜细胞(human mesangial cells,HMCs)中晚期糖基化终末产物受体(RAGE)及转化生长因子-β_1(TGF-β1)表达的影响。方法将体外培养的(体积分数为0.15的FBS的DMEM低糖培养液)人肾小球系膜细胞(HMCs)分为4组:正常组、模型组、GP组、阳性对照组。除正常组外,其余组均再给予200 mg·L^(-1)AGEs刺激。此外,GP组中加入不同浓度GP(25、75、175 mg·L^(-1))进行干预,阳性对照组中加入氨基胍盐酸盐(10^(-1)mmol·L^(-1))。应用Western blot技术检测各实验组中RAGE和TGF-β_1蛋白的表达;RT-PCR技术检测各实验组中RAGE和TGF-β_1 mRNA的表达。结果模型组AGEs诱导下HMCs中RAGE、TGF-β1蛋白及mRNA表达水平明显高于正常组(P<0.01);与模型组比较,GP组中GP可明显下调HMCs中RAGE、TGF-β_1蛋白及mRNA的表达,且呈浓度依赖性(P<0.01)。结论 GP可降低AGEs诱导下HMCs中RAGE的表达,阻断AGEs-RAGE信号通路,并下调下游因子TGF-β_1的表达,进而延缓糖尿病肾病纤维化进程。

高糖对人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质的影响

目的观察不同浓度的葡萄糖对人肾小球系膜细胞增殖的影响及对细胞外基质纤维连接蛋白(Fn),Ⅳ型胶原(ColⅣ)的影响。方法体外培养人肾小球系膜细胞株,分别加入葡萄糖终浓度为5.5、10、20、30、40 mmol/L进行处理,于不同时间段(12、24、48、72 h)用MTT法检测肾小球系膜细胞的增殖情况,ELISA法检测培养48 h后条件培养基中Fn及ColⅣ的含量。结果高糖作用12、24、48、72 h均能促进细胞的增殖,且随着葡萄糖浓度升高作用时间的延长促进作用增强。检测细胞上清液的Fn和ColⅣ。与对照组相比,30 mmol/L D-葡萄糖作用48 h后,Fn和ColⅣ表达增高。结论高浓度葡萄糖对系膜细胞增殖作用具有量效及时效关系,我们选择30 mmol/L浓度的葡萄糖作用48 h为最合适的细胞刺激条件。高浓度葡萄糖可促进系膜细胞细胞外基质的产生,而系膜细胞细胞外基质过度表达,可以直接导致细胞外基质的积聚,从而导致肾小球硬化的发生。

鳖甲煎丸对人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质表达的影响

目的:探讨鳖甲煎丸对人肾小球系膜细胞(HMC)增殖及细胞外基质(ECM)不同成分的抑制作用。方法:应用细胞培养技术,进行人HMC培养,采取血清药理学方法,制备鳖甲煎丸药物血清,利用脂多糖(LPS)为刺激因子,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组系膜细胞的增殖情况,并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测ECM中层黏连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)的含量。结果:LPS刺激后MC增殖和系膜基质中LN及Col-Ⅳ的分泌增多,与空白组比较有明显差异(P<0.01)。鳖甲煎丸能抑制正常条件及LPS刺激条件下MC增殖,并对ECM中LN、Col-Ⅳ的表达有抑制作用。结论:鳖甲煎丸能够抑制系膜细胞的增殖,抑制肾小球系膜基质中LN及Col-Ⅳ的表达,减少ECM的积聚,这可能是其防治肾小球疾病,延缓肾小球硬化的部分作用机制。

茶多酚对高糖所致人肾小球系膜细胞活性氧产生的影响

目的 :探讨高糖对人肾小球系膜细胞活性氧产生的影响以及茶多酚对其的干预作用。方法 :应用比色法检测高糖作用后培养系膜细胞上清液中超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH PX)的活力和丙二醛 (MDA)、超氧阴离子自由基 (O2-· )的水平 ,以及加入茶多酚后各指标的改变。结果 :高糖可降低系膜细胞培养上清液中SOD、GSH PX的活力 ,增加MDA和O2 -· 的含量 ;茶多酚可提高上清液中SOD和GSH PX的活力 ,降低MDA和O2 -· 的含量。结论 :高糖可导致人肾小球系膜细胞活性氧产生增多 。

糖基化终产物对人肾小球系膜细胞氧化应激及MCP-1表达的影响及机制

目的:探讨体外培养条件下糖基化终产物(AGEs)对人肾小球系膜细胞(HRMCs)中糖基化终产物受体(RAGE)、氧化应激及单核细胞趋化因子-1(MCP-1)表达的影响。方法:将HRMCs与不同浓度的糖化牛血清白蛋白(AGE-BSA)和牛血清白蛋白(BSA)共同培养,或与同一质量浓度的AGE-BSA和BSA共同培养不同时间,以中和抗RAGE抗体封闭细胞膜上RAGE;采用细胞免疫化学法检测AGEs对HRMCs中RAGE表达的影响,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS),半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测MCP-1 mRNA的表达。结果:在HRMCs中AGE-BSA能够促进RAGE的表达,并以时间和剂量依赖方式促进HRMCs中ROS及MCP-1的表达;ROS及MCP-1的表达水平在加入不同浓度(50、100、200、400 mg/L)的AGE-BSA作用48 h后以及加入质量浓度为200 mg/L的AGE-BSA作用不同时间(12、24、48、72 h)后,较相应质量浓度或时间的BSA组和对照组均明显升高(P<0.05);抗RAGE抗体干预后能够部分抑制AGE-BSA诱导ROS及MCP-1的表达,而人IgG没有这种作用。结论:AGEs通过RAGE激活氧化应激效应诱导MCP-1的表达上调,是糖尿病肾病发生发展的可能机制。

LOX-1在ox-LDL诱导人肾小球系膜细胞TGF-β1表达的作用

目的:探讨血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人肾小球系膜细胞(HGMC)表达转化生长因子(TGF-β1)中的作用。方法:体外培养HGMC,在不同时间加入不同浓度的ox-LDL及LOX-1阻滞性抗体JTX92,用半定量RT-PCR法检测细胞LOX-1和TGF-β1mRNA表达,用Westernblot法检测细胞LOX-1蛋白合成,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养液中TGF-β1浓度。结果:ox-LDL以时间和浓度依赖的方式增加LOX-1mRNA和蛋白表达的同时,也以时间和浓度依赖的方式增加细胞内TGF-β1mRNA表达和培养液中TGFβ1蛋白的含量,JTX92(10μg/ml)可以明显抑制LOX-1和TGF-β1的表达(P<0.01)。结论:ox-LDL通过激活LOX-1调节HGMCTGF-β1基因表达、蛋白合成与分泌。

大黄酸对高糖诱导人肾小球系膜细胞Wnt、β-catenin蛋白及TGF-β1表达的影响

目的观察高糖对人肾小球系膜细胞Wnt、β-catenin蛋白表达、TGF-β1分泌的影响及大黄酸的干预作用。方法体外培养人肾小球系膜细胞.同步化后采用加有高浓度葡萄糖(30 mmol/L)联合不同浓度大黄酸的无血清培养基培养。应用MTT法测量高糖(HG组)及大黄酸高浓度组(HG+R1组)、大黄酸中浓度组(HG+R2组)、大黄酸低浓度组(HG+R3组)干预后肾小球系膜细胞增殖活力。各组细胞中Wnt、β-catenin蛋白采用放射免疫法检测。各组细胞上清液中转化生长因子β1(TGF-β1)采用ELISA法检测。结果①对系膜细胞增殖的影响:与正常对照组(NG)组24、48、72 h比较.HG组、HG+R1组、HG+R2组、HG+R3组细胞增殖均明显上升,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与HG组各时点相比.HG+R1组、HG+R2组、HG+R3组在24 h呈下降趋势.48、72 h下降趋势显著(P<0.05或P<0.01),表现为时间、浓度依赖性;HG+R2组在24、48 h细胞增殖较HG+R3组各时点有下降趋势.72h时细胞增殖下降趋势显著(P<0.05).而HG+R1组细胞在48h、72h时细胞增殖均显著下降(P<0.05);与相比,HG+R1组细胞增殖抑制作用在72h时较HG+R2组显著下降(P<0.05)。②NG组细胞胞浆中有少量Wnt、β-catenin表达,HG组胞核表达Wnt胞浆及β-catenin量明显增高(P<0.05).大黄酸干预组Wnt、β-catenin蛋白表达受到抑制(P<0.05)。③细胞分泌TGF-β1受高糖刺激增加,TGF-β1的分泌受大黄酸抑制,均呈现出浓度依赖性(.P<0.05或P<0.01)。结论大黄酸在体外可能抑制Wnt、β-catenin蛋白表达.从而抑制分泌TGF-β1.

氧化苦参碱对脂多糖诱导的人肾小球系膜细胞增殖p-STAT1/PIAS1信号分子的影响

目的观察氧化苦参碱对LPS诱导下HMC增殖时p-STAT1、PIAS1蛋白和mRNA表达情况,探讨其相互关系。方法体外培养HMC,分为空白对照组和LPS模型组及氧化苦参碱干预组,培养12、24、48 h时以MTT法检测HMC的增殖情况,ELISA检测细胞上清Col-Ⅳ含量,收集同时段细胞,提取细胞裂解蛋白和mRNA,采用Western blot检测p-STAT1和PIAS1的蛋白表达,实时荧光定量PCR检测STAT1和PIAS1 mRNA表达。结果LPS组细胞增殖较对照组显著加快(P<0.01),Col-Ⅳ的表达显著高于对照组(P<0.01);氧化苦参碱干预后细胞增殖和Col-Ⅳ的表达显著较模型组降低(P<0.01)。蛋白和mRNA表达情况:LPS诱导下各时间段p-STAT1表达升高,表达量显著高于对照组(P<0.01),经OM干预后表达显著下降(P<0.01);LPS诱导下PIAS1表达量显著降低(P<0.01),经OM干预,与LPS组相比各时间段均显著上升(P<0.01)。结论氧化苦参碱对LPS诱导的人系膜细胞增殖过程中p-STAT1/PIAS1蛋白及mRNA表达有调节作用,氧化苦参碱可能影响JAK/STAT信号转导通路。

茶多酚对高糖所致人肾小球系膜细胞活性氧和TGF-β_1表达的影响

目的 探讨高糖对人肾小球系膜细胞活性氧 (ROS)和转化生长因子 β1(TGF β1)表达的影响及茶多酚的干预作用。方法 培养人肾小球系膜细胞 ,分为正常对照组、高糖组、茶多酚组和茶多酚干预组 ,培养 0、12、36h后 ,用分光光度比色法测定细胞上清液超氧化物歧化酶 (SOD)活性和丙二醛 (MDA)含量 ,用半定量RT PCR和免疫细胞化学法检测细胞内TGF β1mRNA和蛋白表达的变化。结果 高糖导致系膜细胞SOD活性下降和MDA含量升高 ,上调TGF β1mRNA和蛋白表达 ,随时间延长更为明显 ;茶多酚干预可拮抗高糖时系膜细胞的上述改变。结论 高糖能促进人肾小球系膜细胞ROS产生增加 ,上调TGF β1mRNA和蛋白表达 。

黄芪甲苷对高糖环境下人肾小球系膜细胞损伤保护作用及其机制研究

目的探讨黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对高糖(HG)环境下人肾小球系膜细胞(HMCs)增殖和氧化应激损伤保护作用及其可能机制。方法采用MTT方法检测高糖作用不同时间点时及不同浓度AS-Ⅳ干预后HMCs增殖情况;采用实时荧光定量PCR(qPCR)、Western blot方法分别检测不同浓度AS-Ⅳ干预高糖环境下HMCs 48 h后核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)、诱导型一氧化氮合酶(iN-OS)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA及其蛋白表达;采用过氧化氢(H_2O_2)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)试剂盒分别检测不同浓度AS-Ⅳ干预高糖环境下HMCs 48 h后细胞上清液中H_2O_2、T-SOD、GSH-Px、MDA含量变化。结果 MTT法结果显示,与正常(NG)组比较,高糖环境下HMCs呈过度增殖趋势(P<0.05),不同浓度AS-Ⅳ干预48 h后,与HG组比较,各用药组明显地抑制了高糖环境下HMCs过度增殖且呈剂量依赖性(P<0.01);qPCR及Western blot法结果显示,与HG组比较,各用药组明显地增加了Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表达(P<0.01),减少了iN OS与ICAM-1 mRNA及蛋白表达(P<0.05)。各试剂盒测试结果显示,与HG组比较,各用药组明显地降低了HMCs上清液中H_2O_2、MDA的含量(P<0.05),增加了HMCs上清液中T-SOD、GSH-Px的含量(P<0.01)。结论 AS-Ⅳ能够明显地抑制HG环境下HMCs过度增殖。对HG环境下HMCs损伤保护作用的部分机制可能是通过激活Nrf2通路并上调Nrf2、HO-1 mRNA及其蛋白其表达,下调iN OS、ICAM-1 mRNA及其蛋白表达,增加HMCs上清液中T-SOD、GSH-Px的含量,降低HMCs上清液中H_2O_2、MDA的含量。

高糖诱导下人肾小球系膜细胞AMPK、MPO、α-SMA的变化以及α-硫辛酸的干预作用

目的探讨高糖诱导下人肾小球系膜细胞(HMCs)中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、炎症反应指标、细胞外基质的变化及α-硫辛酸的干预作用。方法传代培养的HMCs同步化后分组:正常对照组、高糖组、甘露醇对照组、高糖+α-硫辛酸处理组(α-硫辛酸浓度分别为50、100和200μmol/L),于实验0、12、24、48和72 h收集各组细胞及上清液,采用RT-PCR法和ELISA法检测各组细胞中AMPK mRNA及上清液中AMPK、髓过氧化物酶(MPO)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的含量。结果高糖组人肾小球系膜细胞AMPK mRNA及AMPK蛋白的表达较正常对照组明显下降(P<0.01),MPO、α-SMA蛋白的表达明显增加(P<0.01)。α-硫辛酸各处理组AMPK mRNA及AMPK蛋白表达比高糖组有明显增加(P<0.01),MPO、α-SMA蛋白的分泌较处理前明显降低(P<0.05)。结论高糖能够抑制人肾小球系膜细胞中AMPK的表达,诱导MPO(炎症反应指标)、α-SMA(系膜细胞活化从而分泌细胞外基质增多的指标)的表达,抗氧化剂α-硫辛酸可以上调高糖抑制的AMPK的表达,减少高糖刺激下HMCs中MPO、α-SMA蛋白的分泌,为糖尿病肾病的防治提供新的理论依据。

霉酚酸酯对高糖培养下人肾小球系膜细胞MCP-1和FN表达的影响

目的:探讨高糖以及霉酚酸酯(MMF)对人肾小球系膜细胞(HMCs)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和纤维连接蛋白(FN)表达的影响。方法:将培养的HMCs分为正常对照组(5 mmol/L葡萄糖);高糖组(30 mmol/L葡萄糖);甘露醇渗透压对照组(5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇);高糖+MMF-10组(30 mmol/L葡萄糖+10μg/mL MMF);高糖+MMF-100组(30 mmol/L葡萄糖+100μg/mL MMF),采用RT-PCR检测每组不同时间点(24、48、72 h)MCP-1 mRNA的表达,ELISA法检测培养上清液MCP-1及FN蛋白的表达。结果:高糖组HMCs MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN的分泌较正常对照组显著增加(P<0.01),且48 h表达最高;不同浓度的MMF均能下调MCP-1 mRNA、蛋白及FN的表达(P<0.01);不同浓度的MMF对MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN分泌的抑制程度不同,呈时间剂量依赖性(P<0.05)。结论:MMF可以阻抑MCP-1的表达及FN的分泌,可能对延缓肾小球硬化及间质纤维化有一定作用。

人肾小球系膜细胞原代培养方法的改进

背景:肾小球系膜细胞原代培养成功率低,生存时间短,传代次数少。其中分离提取肾小球一直是培养高纯肾小球系膜细胞的最大瓶颈。目的:建立一种操作简单、成功率高、重复性好的人肾小球系膜细胞原代培养方法。方法:取自愿水囊引产的胎儿肾,采用肾皮质组织块法合优生选择法培养人肾小球系膜细胞。相差显微镜、透射电镜观察系膜细胞形态,免疫荧光技术鉴定细胞表型,激光共聚焦显微镜观察波形蛋白的表达。结果与结论:培养的肾小球系膜细胞呈梭形/不规则星形和细长形,胞质中各种细胞器丰富,细胞突起明显,胞膜上有很多微绒毛,细胞表达α-肌动蛋白、肌球蛋白、波形蛋白、结蛋白,而不表达细胞角蛋白、Ⅷ因子,激光共聚焦显微镜下发现系膜细胞波形蛋白表达阳性并具有特征性纤维束。说明培养的系膜细胞符合肾小球系膜细胞的生物学特征。肾皮质组织块法合优生选择法是一种简单、高效的培养人肾小球系膜细胞的方法。