miR-15b-5p靶向FOXO1对缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞损伤的调控作用及其机制

目的探讨miR-15b-5p靶向叉头框蛋白O1(FOXO1)对缺氧/复氧(H/R)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的调控作用及其机制。方法取对数生长期HK-2细胞,设置:(1)对照组(正常培养)与H/R组(H/R诱导培养)。倒置显微镜下观察HK-2细胞形态,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测mi-15b-5p、FOXO1 mRNA的表达,Western blotting检测FOXO1蛋白的表达。(2)对照组(正常培养)、H/R组(H/R诱导培养)、H/R+mimic对照组(转染mimic对照质粒后H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic组(转染miR-15b-5p mimic后H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic+OE-NC组(共转染mi R-15b-5p mimic和OE-NC质粒后H/R诱导培养)与H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组(共转染miR-15b-5p mimic和FOXO1过表达质粒后H/R诱导培养)。采用qRT-PCR检测mi-15b-5p的表达,Western blotting检测FOXO1、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表达,CCK-8法检测细胞活力,TUNEL染色检测细胞凋亡情况。(3)对照组(正常培养)、H/R组(H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic组(转染miR-15b-5p mimic后H/R诱导培养)与H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组(共转染miR-15b-5p mimic和OE-FOXO1后H/R诱导培养)。采用Western blotting检测LC3、p62、Beclin-1蛋白的表达,LC3免疫荧光检测细胞自噬水平。双荧光素酶报告实验检测miR-15b-5p与FOXO1之间的靶向关系。结果倒置显微镜下观察显示,对照组细胞数量较多,细胞大多呈典型鹅卵石形态,铺路石状生长;H/R组大部分细胞收缩变圆,贴壁细胞数量明显减少。与对照组比较,H/R组miR-15b-5p表达水平明显降低,FOXO1 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。荧光素酶报告实验结果显示miR-15b-5p直接靶向作用于FOXO1的3'-UTR。miR-15b-5p过表达抑制H/R诱导的HK-2细胞活力,降低细胞凋亡,抑制细胞自噬(P<0.05)。与H/R+miR-15b-5p mimic组相比,H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组HK-2细胞存活率降低,细胞凋亡和自噬水平增高(P<0.05)。结论miR-15b-5p通过靶向抑制FOXO1降低细胞自噬减缓H/R诱导的HK-2细胞损伤。

山松醇同源物1在缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞损伤中的作用及机制研究

目的探究山松醇同源物1(pumilio homolog 1,PUM1)在缺氧/复氧(hypoxia/reoxy-genatio,H/R)诱导的人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HK-2)损伤中的作用及机制。方法体外建立HK-2细胞的H/R模型;通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低HK-2细胞的PUM1表达;细胞等量随机法分为对照(Control)组、H/R组、H/R+siRNA组。蛋白质印迹法用以检测PUM1蛋白表达水平;细胞计数试剂盒8用以检测细胞活力;过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)评估氧化应激水平;流式细胞术用以检测细胞凋亡水平。结果与Control组相比,H/R 3 h组(1.76±0.11比0.98±0.05)、H/R 6 h组(2.89±0.14比0.98±0.05)、H/R 12 h组(3.78±0.08比0.98±0.05)PUM1的蛋白表达水平随着缺氧时间的延长逐渐增高(均P<0.05)。与H/R组相比,H/R+si-PUM1组敲低PUM1的表达能够显著改善H/R后HK-2细胞的细胞活力(73.67±3.42比29.60±2.94)、氧化应激[H_(2)O_(2):(13.53±0.85)μmol/L比(22.43±1.12)μmol/L、MDA:(16.03±0.70)μmol/L比(31.20±1.50)μmol/L、SOD:(34670±1800)U/L比(5730±1220)U/L]及凋亡水平[(14.89±1.65)%比(39.71±1.94)%](均P<0.05)。结论PUM1在H/R诱导的HK-2细胞中上调,抑制PUM1的表达可以减少氧化应激及细胞凋亡水平,从而减轻H/R损伤。

远隔缺血预处理分离液对人肾小管上皮细胞缺氧性损伤的保护作用

目的:研究远隔缺血预处理(RIPC)分离液对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧/复氧(H/R)损伤的影响及机制。方法:将HK-2细胞分为时间对照组、H/R、RIPC处理组、自噬干预组。时间对照组细胞在正常条件下培养,RIPC组细胞使用RIPC分离液预处理,自噬干预组细胞在RIPC处理基础上,加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3MA),后三组细胞使用三气培养箱进行H/R构建损伤模型。模型成功后使用光学显微镜观察各组细胞状态,应用Western blot观察LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白、Beclin1蛋白的表达水平。结果:镜下示RIPC分离液可明显减轻H/R对HK-2细胞的损伤,加入自噬抑制剂,RIPC分离液对HK-2细胞H/R损伤的保护作用被阻断。Western blot结果显示,RIPC分离液可使HK-2细胞线粒体中的自噬特异性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达水平增高。Real-time PCR结果显示,与H/R组比,RIPC组LC3及Beclin1的mRNA表达量明显升高;加入自噬抑制剂,HK-2细胞线粒体中的自噬特异性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达降低,LC3及Beclin1的mRNA表达量同时也明显降低。结论:RIPC分离液对HK-2细胞H/R后损伤具有保护作用,作用机制可能与线粒体自噬相关。

二甲双胍通过抑制NF-κB/NLRP3通路改善草酸钙诱导人肾小管上皮细胞损伤研究

目的研究二甲双胍(metformin,Met)通过抑制NF-κBNLRP3通路改善草酸钙(Calcium Oxalate,CaOx)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)损伤。方法分别随机将人肾小管上皮细胞分成对照组、实验组(CaOx+HK-2)、高浓度Met组(CaOx+HK-2+1.2 mM Met)、低浓度Met组(CaOx+HK-2+0.80 mM Met)、通路干预组(CaOx+HK-2+PDTC)五组。各组细胞培养24 h,采用酶联免疫吸附测定(Elisa)法检测细胞上清液中炎症因子(IL-6、IL-18、IL-1β),采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞中NF-κB、NLRP3、骨桥蛋白(OPN)mRNA。结果各组间细胞上清液IL-6、IL-18、IL-1β含量相比差异均有统计学意义(P均<0.05);各组间细胞中NF-κBmRNA表达量、NLRP3mRNA表达量、OPNmRNA表达量相比差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论1.20 mmol/L或0.80 mmol/L Met可以通过抑制NF-κB/NLRP3通路调控下游的炎症相关蛋白及黏附蛋白表达,继而改善CaOx诱导人肾小管上皮细胞损伤及减少草酸钙肾结石形成。

微小RNA-138/NGAL对缺血再灌注诱导人肾小管上皮细胞的影响

目的探究微小RNA-138(microRNA-138,miR-138)调控中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)对缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)诱导人肾小管上皮(HK-2)细胞损伤的影响。方法HK-2细胞构建I/R模型,分别转染miR-138模拟物、miR-138抑制剂、NGAL、NGAL+miR-138模拟质粒,qRT-PCR测定不同细胞miR-138或NGAL mRNA表达鉴定转染结果,细胞活力检测(cell counting kit-8,CCK-8)法和流式细胞术测定细胞活性和凋亡。ELISA、Western blot法分别测定miR-138模拟物、miR-138抑制剂对I/R细胞白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,以及Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、NF-κB抑制蛋白(inhibitor-NF-κB,IκBα)、磷酸IκBα(p-IκBα)、NGAL蛋白表达的影响。结果I/R细胞miR-138 mRNA表达、细胞活力降低,凋亡增加(P<0.01)。质粒转染成功,miR-138模拟物促进IR细胞活力,降低凋亡和NGAL mRNA表达(P<0.01);miR-138抑制剂、NGAL模拟降低IR细胞活力,增加凋亡和NGAL mRNA表达(P<0.01);NGAL模拟对IR细胞的损伤作用可被miR-138模拟逆转。miR-138抑制剂可增加I/R细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平和凋亡,上调TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表达,下调IκBα蛋白表达(P<0.05);miR-138模拟物可降低I/R细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平和凋亡,下调TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表达,上调IκBα蛋白表达(P<0.05)。结论miR-138通过调节NGAL和TLR4/NF-κB途径降低细胞凋亡和炎症因子水平,对I/R诱导的HK-2细胞发挥保护作用。

微小RNA-22-3p抑制人肾小管上皮细胞NLRP3活化

目的:探讨微小RNA-22-3p(miR-22-3p)对人肾小管上皮细胞NLRP3活化的影响。方法:将包含NLRP3基因3’-非编码区(3’-UTR)序列的野生型及突变型双荧光素酶报告基因质粒(psiCHECK2)分别与miR-22-3p mimic(模拟物)、miR-22-3p inhibitor(抑制物)共转染人肾小管上皮细胞株(HK-2),检测细胞荧光素酶活性;HK-2细胞随机分组如下:(1)正常对照组;(2)miR-22-3p mimic+LPS+ATP组;(3)miR-22-3p control+LPS+ATP组;(4)miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP组;(5)miR-22-3p mimic+LPS组;(6)miR-22-3p control+LPS组;(7)miR-22-3p inhibitor+LPS组,采用定量PCR(RT-PCR)、免疫印迹(WB)分别检测NLRP3 mRNA和蛋白的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测白介素-1β(IL-1β)水平及半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)活性。结果:NLRP3-3’UTR野生型分别与miR-22-3p mimic、miR-22-3p inhibitor共转染HK-2细胞后,与对照组比较,荧光素酶活性分别出现降低与升高(P<0.05)。此外,与miR-22-3p control+LPS组比较,miR-22-3p mimic+LPS组NLRP3 mRNA和蛋白表达、IL-1β水平及Caspase-1活性均下降(P<0.05),miR-22-3p inhibitor+LPS组NLRP3 mRNA和蛋白表达、IL-1β水平及Caspase-1活性均升高(P<0.05);与miR-22-3p control+LPS+ATP组比较,miR-22-3p mimic+LPS+ATP组NLRP3 mRNA和蛋白表达、IL-1β水平及Caspase-1活性均下降(P<0.05),miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP组NLRP3 mRNA和蛋白表达、IL-1β水平及Caspase-1活性均升高(P<0.05)。结论:miR-22-3p可抑制人肾小管上皮细胞NLRP3活化。

靶向抑制人SREBP-1基因对高糖刺激下人肾小管上皮细胞脂滴形成的影响

目的构建人SREBP-1基因的shRNA载体并转染人肾小管上皮细胞(HKC)明确是否沉默SREBP-1基因的表达可减轻高糖环境引起的细胞内脂滴形成。方法设计两对针对人SREBP-1基因的干扰靶序列及短链寡核苷酸和线性化的pGenesil-1质粒进行连接,筛选鉴定并最终命名为pGenesil-1-SREBP1-1和pGenesil-1-SREBP1-2。体外培养人肾小管上皮细胞并随机分组,采用阳离子脂质体法转染细胞后给予高糖刺激48h,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,半定量RT-PCR和Westernblot分析目标基因表达丰度的变化,并采用油红O染色检测细胞内脂滴。结果经酶切及测序鉴定证明构建的重组载体pGenesil-1-SREBP1-1、pGenesil-1-SREBP1-2序列正确;转染HKC细胞后均可表达绿色荧光;RT-PCR和Westernblot显示pGenesil-1-SREBP1-1、pGenesil-1-SREBP1-2能够有效抑制高糖环境下HKC细胞SREBP-1的表达,与阴性质粒对照组相比,差异有统计学意义。进一步研究发现在HKC细胞内,SREBP-1基因表达沉默明显抑制了脂肪酸合成酶(FAS)的转录,细胞内脂滴明显减少。结论有效沉默高糖刺激下HKC细胞SREBP-1的基因表达可通过抑制FAS转录而减少细胞内脂滴形成。

TGF-β_1激活smad信号通路影响人肾小管上皮细胞增殖与凋亡

目的观察TGF-β1通过smad信号通路影响人肾小管上皮细胞凋亡与细胞增殖的变化。方法以人肾小管上皮细胞为对象,应用TGF-β1刺激,通过Western blot及RT-PCR的方法来观察p-smad2/3蛋白和smad2/3蛋白及其mRNA的表达。同时通过流式细胞学观察细胞凋亡与周期的变化。MTT法检测细胞增殖水平。结果人肾小管上皮细胞在TGF-β1刺激后,较对照组、p-smad2/3蛋白和smad2/3蛋白及其mRNA的表达有着显著的升高。细胞凋亡百分率同时明显升高,细胞周期G0/G1比例显著升高,S期、G2/M期比例显著降低。细胞增殖水平明显受到抑制。结论人肾小管上皮细胞smad信号通路能够被TGF-β1特异性的激活,并且介导细胞的凋亡,抑制细胞增殖。

贫铀对人肾小管上皮细胞的毒性作用

目的 阐明贫铀 (depleteduranium ,DU)对人肾小管上皮细胞 (humankidneycell,HKC)的急性毒性作用及损伤部位 ,为救治提供依据。方法 将 0 0 63～ 0 5 0 0mg ml的DU溶液作用于HKC ,研究细胞超微结构、存活率的变化 ,多种酶含量的改变及HGPRT基因突变的频率。结果 0 0 63～ 0 5 0 0mg ml浓度的DU可引起HKC细胞结构改变 ,存活率显著下降 ;溶酶体酶NAG含量随DU浓度的增加而增加 ;其他酶含量也发生变化 ;HGPRT基因突变的发生率显著高于正常对照组 ,并呈二项式相关关系。加入苯乙酸、亚硒酸钠使上述指标变化不大。结论 DU可引起细胞活力降低 ,损伤细胞膜、线粒体、溶酶体等 ,使细胞抗氧化能力下降 ;HGPRT基因突变率与DU浓度之间呈相关关系 ;加入恶性转化的抑制剂亚硒酸钠和苯乙酸 。

雷公藤多苷对高糖诱导人肾小管上皮细胞凋亡及CXCL10/CXCR3轴的影响

目的 探讨雷公藤多苷(TG)对高糖诱导人肾小管上皮细胞HK-2凋亡及CXC趋化因子配体10(CXCL10)/CXC趋化因子受体3(CXCR3)轴的影响。方法 体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,并分为对照组(含5.5 mmol/L葡萄糖培养基)、高糖组(含25 mmol/L葡萄糖培养基)和12.5、25、50 mg/L TG组(分别用12.5、25、50 mg/L的TG和25 mmol/L葡萄糖培养基)。四甲基偶氮唑盐比色法检测HK-2细胞活力;流式细胞术检测HK-2细胞凋亡情况;2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯法检测HK-2细胞活性氧(ROS)水平;黄嘌呤氧化酶法检测HK-2细胞超氧化物歧化酶(SOD)水平;酶联免疫吸附试验检测HK-2细胞炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)水平;蛋白免疫印迹法检测HK-2细胞凋亡蛋白[胱天蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9]以及CXCL10、CXCR3蛋白表达。结果 与对照组比较,高糖组HK-2细胞活力、SOD水平显著降低,凋亡率、ROS、TNF-α、TGF-β1水平及Caspase-3、Caspase-9、CXCL10、CXCR3蛋白表达升高(P<0.05);与高糖组比较,12.5、25、50 mg/L TG组HK-2细胞活力、SOD水平升高,凋亡率、ROS、TNF-α、TGF-β1水平及Caspase-3、Caspase-9、CXCL10、CXCR3蛋白表达降低,且高剂量效果更好(P<0.05)。结论 TG可抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡、氧化应激和炎症反应,其机制可能与抑制CXCL10/CXCR3轴有关。

动力相关蛋白-1在缺氧/复氧诱导人肾小管上皮细胞焦亡机制中的作用

目的观察人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤时线粒体动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)、Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3,Nlrp3)以及炎性因子的表达改变和细胞焦亡情况,探讨Drp1在H/R诱导肾小管上皮细胞焦亡中的作用。方法 HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12液培养于37℃、5%CO2和95%O2的恒温培养箱。将细胞分为正常对照组、H/R组、H/R+Drp1抑制剂(H/R+Mdivi-1)组、H/R+si Nlrp3腺病毒(H/R+si Nlrp3)组、H/R+空腺病毒(H/R+Scra)组。检测细胞培养液上清乳酸脱氢酶LDH活性,Western blot检测Drp1、Nlrp3、凋亡相关蛋白-1(caspase-1)、IL-1β表达,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)检测细胞活性氧(ROS)水平,流式分析仪检测细胞焦亡情况。结果与正常对照组比较,H/R组培养液上清LDH和细胞内ROS水平明显升高,Drp1、Nlrp3、caspase-1、IL-1β表达增高,细胞焦亡明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与H/R组比较,H/R+Mdivi-1组培养液上清LDH和细胞内ROS水平明显降低,Nlrp3、caspase-1、IL-1β表达降低,细胞焦亡明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在H/R条件下,Drp1通过激活Nlrp3炎性体诱导人肾小管上皮细胞焦亡。

针对CTGF的shRNA抑制TGFβ1诱导人肾小管上皮细胞合成胶原

目的研究针对结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)对转化生长因子β1(TGFβ1)诱导人肾小管上皮细胞株(humanrenaltubularepithelialcell,HKC)合成胶原的抑制作用。方法设计和构建带有U6启动子的能产生针对CTGF的shRNA的RNA干扰表达质粒,转染至受TGFβ1刺激的HKC,以RT-PCR和Westernblot检测HKC转染前后CTGF表达,以3H脯氨酸掺入法检测总胶原合成量。结果和仅受TGFβ1刺激组相比,转染了RNA干扰表达质粒的受TGFβ1刺激的HKCCTGFmRNA和蛋白表达明显减弱,总胶原合成量下降(P<0.01)。结论针对CTGF的短发夹RNA能明显抑制TGFβ1诱导HKC合成胶原。

止消通脉宁干预转化生长因子-β_1诱导人肾小管上皮细胞表型转化的研究

目的观察止消通脉宁药物血清对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)表型转化的影响,并探讨其机制。方法将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基培养并分为空白对照组、TGF-β1诱导组(TGF-β110 ng/mL)、空白血清对照组(TGF-β110 ng/mL+10%空白血清)、干预1组(TGF-β110 ng/mL+10%低剂量止消通脉宁药物血清)、干预2组(TGF-β110 ng/mL+10%中剂量止消通脉宁药物血清)、干预3组(TGF-β110 ng/mL+10%高剂量止消通脉宁药物血清)。药物干预24 h后,免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。在24、48、72 h应用酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)和纤连蛋白(FN)的含量。结果正常HK-2细胞表达E-cadherin,不表达α-SMA,经TGF-β1刺激后细胞表型发生转变,E-cadherin的表达明显减弱,α-SMA表达明显增强,且ColⅠ、ColⅢ和FN的分泌明显增加,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。止消通脉宁药物血清干预后α-SMA表达明显减弱,E-cadherin表达明显增强;同时抑制了ColⅠ、ColⅢ和FN的分泌,与TGF-β1诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论止消通脉宁在一定程度上能够抑制人肾小管上皮细胞表型转化,减少细胞外基质成分的分泌,具有防治肾间质纤维化的作用。

四妙散对尿酸诱导人肾小管上皮细胞结缔组织生长因子及骨形成蛋白-7表达的影响

目的探讨四妙散药物血清防治肾间质纤维化的作用机制。方法将人肾小管上皮细胞(HK-2)分为空白组、模型组、对照组及药物血清高、中、低剂量组。实时荧光定量PCR检测结缔组织生长因子(CTGF)、骨形成蛋白-7(BMP-7),免疫组织化学检测CTGF、BMP-7蛋白的表达。结果尿酸诱导后CTGF的m RNA和蛋白表达量明显增加(P<0.05),BMP-7的m RNA和蛋白表达量明显降低(P<0.05);经药物血清干预后,随剂量增加CTGF的表达逐步下降(P<0.05),BMP-7的表达逐步上升(P<0.05),呈现一定剂量依赖性。结论四妙散抗肾间质纤维化的机制可能是通过下调CTGF的表达和上调BMP-7的表达抑制上皮细胞转分化完成的。

姜黄素对TGF-β_1诱导人肾小管上皮细胞转分化及分泌细胞外基质成分的影响

目的:通过研究姜黄素(curcumin,Cur)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化及分泌细胞外基质(ECM)成分的影响,探讨姜黄素在防治肾小管-间质纤维化方面可能的作用机制。方法:应用不同浓度Cur处理经TGF-β1诱导活化的HK-2细胞,通过显微镜观察细胞形态改变,免疫组化技术检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达;应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)和纤连蛋白(FN)的分泌。结果:(1)正常HK-2细胞表达E-cadherin,不表达α-SMA,经TGF-β1刺激后细胞表型发生转变,E-cadherin的表达明显减弱,α-SMA表达明显增强;(2)不同浓度Cur组与单纯TGF-β1刺激组相比α-SMA的表达有所减弱,而E-cadherin的表达增强;(3)不同浓度Cur抑制了ColⅠ、ColⅢ和FN的分泌,与单纯TGF-β1刺激组相比有统计学差异(P<0.05)。结论:姜黄素能抑制TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质成分ColⅠ、ColⅢ和FN的合成,在一定程度上具有防治肾小管-间质纤维化的作用。

高钙离子诱导人肾小管上皮细胞表达MCP-1和HMGB1

目的:观察体外培养的人肾小管上皮细胞在高钙离子环境下细胞损伤及炎性因子MCP-1和HMGB1的表达。方法:体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2细胞),使用Ca Cl_2配制成不同钙离子浓度的溶液作为刺激剂,实验分为正常对照组(正常培养液)、Ca Ⅰ组(5 mmol/L Ca^(2+)液)、Ca Ⅱ组(10 mmol/L Ca^(2+)液)和Ca Ⅲ组(15 mmol/L Ca^(2+)液)。各组细胞分别培养至3 h、6 h、9 h时,采用MTT法检测细胞活力。培养6 h时,采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞凋亡染色,观察各组细胞凋亡情况;同时收集细胞培养上清液,采用ELISA法分别检测各组细胞上清液过氧化氢(H_2O_2)和8-异前列烷(8-IP)浓度,微量酶标仪法检测各组细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性。此外,培养6 h时收集各组细胞,采用real-time PCR法检测细胞MCP-1和HMGB1的mRNA表达情况;并收集各组细胞上清液,采用ELISA法检测其MCP-1和HMGB1的含量。结果:随着细胞培养液中钙离子浓度的增加,细胞活力抑制率和细胞凋亡明显增加。LDH活性、细胞上清液H_2O_2的浓度和8-IP的含量在Ca Ⅰ组、Ca Ⅱ组和Ca Ⅲ组均较正常对照组高(P<0.05)。real-time PCR的结果显示,与对照组比较,3个钙离子诱导组细胞MCP-1和HMGB1的mRNA表达水平升高,差异有统计学显著性(P<0.05)。此外,3个钙离子诱导组细胞上清液MCP-1和HMGB1含量均较正常组高(P<0.05)。结论:本研究结果提示,高钙离子可诱导人肾小管上皮细胞出现氧化应激损伤,同时细胞高表达MCP-1和HMGB1。由MCP-1和HMGB1引发的炎症反应可能是高钙尿参与结石形成的重要机制。

糖基化终产物对人肾小管上皮细胞Fractalkine表达的影响

目的既往实验已观察到糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE)可增加人肾系膜细胞单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、RANTES等表达,fractalkine(FKN)在糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)中的作用尚不明确。本实验探讨AGE对人肾小管上皮细胞(tubular epithelial cells,TEC)株HK-2 FKN表达的影响。方法运用AGE-BSA按不同的时间和浓度干预HK-2,分别用RT-PCR和ELISA法检测FKN mRNA的表达及蛋白分泌;用AGE-BSA及AGE-BSA加FKN中和抗体分别干预HK-2,用Transwell小室、共培养及荧光染色法检测HK-2趋化和黏附单核细胞株U937的功能。结果AGE-BSA干预组的HK-2 FKN的mRNA表达和蛋白分泌较对照组显著增加(P<0.05),且随干预时间和浓度的增加而进一步增加。AGE-BSA干预组HK-2趋化及黏附的U937数较对照组和加FKN抗体组明显增加(P<0.01)。结论AGE可能部分通过FKN/CX3CR1途径参与DN肾小管间质病变的发生发展。

丹参酮IIA对TGF-β_1诱导的人肾小管上皮细胞增殖及Ⅰ型胶原分泌的影响

目的探讨丹参酮IIA在防治肾间质纤维化方面的作用。方法将体外正常培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)分为空白对照组、转化生长因子-β1组(TGF-β1,10μg/L)、干预一组(丹参酮IIA 1 mg/L+TGF-β110μg/L)、干预二组(丹参酮IIA 5 mg/L+TGF-β110μg/L)及干预三组(丹参酮IIA 10 mg/L+TGF-β110μg/L),分别予相应的干预措施。采用MTT方法检测HK-2的增殖以及用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化;采用ELISA法检测上清液中Ⅰ型胶原的含量。结果 TGF-β1组(10μg/L)能刺激肾小管上皮细胞增殖以及促进细胞的形态向成纤维细胞发生转变;加入丹参酮IIA(1 mg/L^10 mg/L)共同作用后,细胞的增殖受到抑制,细胞形态逐渐趋向于正常,呈现明显的剂量依赖性。TGF-β1(10μg/L)能刺激肾小管上皮细胞Ⅰ型胶原的分泌增加,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),与丹参酮IIA(1 mg/L^10 mg/L)共同作用后Ⅰ型胶原的表达量下降,并呈明显的剂量依赖性。结论丹参酮IIA能够维持HK-2细胞形态的稳定性,防止细胞向成纤维细胞方向发展,在一定程度上抑制了TGF-β1诱导的细胞增殖及分泌Ⅰ型胶原的作用,这可能也是其治疗肾间质纤维化的作用机制。

复肾颗粒对人肾小管上皮细胞TAK1表达的影响

目的:探讨复肾颗粒(生黄芪、丹参、川芎、大黄和鳖甲)含药血清对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导下人肾小管上皮细胞(HK-2)增殖时转化生长因子β激活激酶(TAK1)表达的影响。方法:体外培养HK-2细胞并制备复肾颗粒含药血清,分为对照组、TGF-β1诱导组(5ng/mL)、干预1组(TGF-β1 5 ng/mL+复肾颗粒100μg/mL)、干预2组(TGF-β1 5 ng/mL+复肾颗粒500μg/mL)、干预3组(TGF-β1 5 ng/mL+复肾颗粒1 mg/mL)。培养12、24、48h以MTT法检测细胞增殖情况,ELISA法检测细胞上清IV型胶原蛋白(Col IV)含量,实时荧光定量PCR检测TAK1 mRNA的相对含量,Western-bloting法检测TAK1蛋白表达。结果:TGF-β1组细胞的增殖及Col IV含量、TAK1蛋白及mRNA的表达显著高于对照组(P<0.05,P<0.01),复肾颗粒含药血清干预后细胞增殖和Col IV的含量、TAK1表达显著低于TGF-β1组(P<0.05,P<0.01)。结论:在体外试验中,复肾颗粒含药血清对TGF-β1诱导HK-2细胞增殖过程中TAK1蛋白及mRNA的表达有下调作用,其可能是通过激活肾小管上皮细胞某些抑制因子抑制TAK1转录和表达。