明胶三维微球装载人脐带间充质干细胞修复慢性肌腱病

背景:肌腱组织因缺少血管而修复困难,如何促进肌腱的恢复和提高肌腱损伤后干细胞治疗的效果,一直是临床及科研的研究热点和重点。目的:将人脐带间充质干细胞与明胶微载体支架结合构建组织工程化干细胞,通过体外实验与大鼠体内实验观察明胶微载体培养的人脐带间充质干细胞对肌腱病的治疗效果及作用机制。方法:(1)体外细胞实验:将人脐带间充质干细胞接种于三维明胶微载体后观察细胞活性以及存活情况,以常规培养的人脐带间充质干细胞作为对照;(2)动物体内实验:将成年SD大鼠随机分为正常组、肌腱病组、2D组(肌腱病+常规培养人脐带间充质干细胞)、3D组(肌腱病+明胶微载体三维培养的人脐带间充质干细胞),每组6只,治疗4周后进行动物行为学检测以及跟腱病理组织形态观察。结果与结论:(1)体外细胞实验:接种于明胶微载体的人脐带间充质干细胞存活率高,且随着时间延长细胞增殖速率增加;与对照组相比,三维明胶微载体培养的细胞活性更好;(2)动物体内实验:治疗4周后,与肌腱病组比较,3D组大鼠下肢功能恢复良好及组织病理学评分显著改善,而2D组也可一定程度改善肌腱病损伤,但效果不及3D组;(3)结果表明,三维明胶微载体培养的人脐带间充质干细胞可以促进肌腱损伤组织修复再生,且修复效果优于常规培养人脐带间充质干细胞。

人脐带间充质干细胞来源外泌体抗小鼠肾缺血再灌注损伤的机制

背景:人脐带间充质干细胞来源外泌体参与多种损伤修复过程,其对肾缺血再灌注损伤的影响以及具体机制还没有完全阐明。目的:探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体治疗肾缺血再灌注损伤的分子机制。方法:①培养人脐带间充质干细胞,使用外泌体提取试剂盒获取外泌体并鉴定;②采用活体荧光成像技术检测外泌体在肾缺血再灌注损伤小鼠肾脏中的分布;③C57/BL6雄性小鼠30只,按随机数字表法分为5组:假手术组、肾缺血再灌注组、假手术组+Compound C组、肾缺血再灌注+外泌体组、肾缺血再灌注+外泌体+Compound C组,每组6只。除假手术组外,其余组均夹闭双侧肾蒂45 min,再灌注24 h建立肾缺血再灌注小鼠模型;假手术组+Compound C组和外泌体+Compound C组于造模前30 min腹腔注射AMPK抑制剂Compound C;外泌体组和外泌体+Compound C组在肾蒂夹闭前15 min经尾静脉注射外泌体。再灌注24 h检测各组小鼠血清肌酐和尿素氮水平、肾组织白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平、肾组织凋亡相关因子的表达。结果与结论:①人脐带间充质干细胞外泌体具有典型的茶托形态,直径分布在40-160 nm范围内,表达外泌体表面特异性标志膜蛋白;②与假手术组相比,肾缺血再灌注损伤小鼠肾脏更易聚集人脐带间充质干细胞外泌体;③外泌体预处理可减轻肾缺血再灌注小鼠肾损伤,降低肾小管上皮细胞凋亡水平,并且这种保护作用可被AMPK抑制剂所逆转。结果表明,人脐带间充质干细胞来源外泌体发挥肾缺血再灌注损伤的保护作用可能与激活AMPK/YAP1通路抗细胞凋亡有关。

白细胞介素10工程化修饰人脐带间充质干细胞优效治疗炎症性肠病

背景:间充质干细胞来源广泛、易体外增殖,并可分泌一系列免疫调节因子抑制炎症、促进组织修复再生,广泛应用于各种疾病治疗研究。但是对于多种疾病,间充质干细胞的治疗效果有限。针对疾病特定发病机制或者干预靶点进行工程化修饰间充质干细胞是未来细胞治疗的重要发展方向。目的:白细胞介素10是一种典型的抗炎细胞因子,有助于调节免疫反应并诱导巨噬细胞向抗炎表型极化,该研究探讨白细胞介素10基因工程化修饰人脐带间充质干细胞对炎症性肠病的治疗效果。方法:通过电转染建立稳定过表达人白细胞介素10基因的人脐带间充质干细胞,并基于细胞治疗产品标准筛选出临床级细胞。给予C57BL/6J小鼠自由饮用5%葡聚糖硫酸钠盐水溶液建立急性结肠炎模型,分别在造模前1 d(尾静脉途径)与造模后第4天(腹腔途径)注射空质粒转染的人脐带间充质干细胞或过表达人白细胞介素10基因的人脐带间充质干细胞(1×10~6个/只)。在造模后第6天取结肠组织进行苏木精-伊红染色评估组织学变化,免疫荧光染色检测增殖细胞核抗原与CD31的表达。结果与结论:构建的稳定过表达白细胞介素10的工程化人脐带间充质干细胞,满足临床级人脐带间充质干细胞质量标准;人脐带间充质干细胞对小鼠急性结肠炎具有修复效果,过表达白细胞介素10基因的人脐带间充质干细胞的治疗效果更加优效,更显著地抑制急性结肠炎小鼠的体质量下降(P<0.05)、结肠缩短(P<0.05)以及结肠组织损伤(P<0.05);过表达白细胞介素10基因人脐带间充质干细胞组结肠组织切片中增殖细胞核抗原阳性细胞与CD31阳性细胞显著多于人脐带间充质干细胞组,表明过表达白细胞介素10基因的人脐带间充质干细胞可能通过显著促进肠组织细胞增殖和血管再生进而促进结肠组织修复。

人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

背景:间充质干细胞可通过分泌含细胞因子、生长因子和外泌体的细胞外囊泡调节肿瘤微环境,对肿瘤细胞生物学行为进行精准调控。目的:研究人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞生物学特性的影响。方法:收集人脐带间充质干细胞培养上清,通过高速离心并过滤获得人脐带间充质干细胞条件培养基;收集人脐带间充质干细胞培养上清,通过超高速梯度离心法提取人脐带间充质干细胞外泌体。使用PKH26标记人脐带间充质干细胞外泌体,与肝癌细胞MHCC97-H共培养,荧光显微镜观察MHCC97-H细胞摄取外泌体情况。通过CCK-8增殖实验、Transwell迁移和侵袭实验以及流式凋亡实验评估人脐带间充质干细胞条件培养基、人脐带间充质干细胞外泌体对肝癌细胞生物学功能的影响。结果与结论:(1)人脐带间充质干细胞外泌体可被MHCC97-H细胞摄取且主要分布于细胞质中;(2)人脐带间充质干细胞条件培养基处理后,MHCC97-H细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著增强(P<0.001,P<0.05,P<0.01),凋亡能力显著下降(P<0.001);而人脐带间充质干细胞外泌体处理后,MHCC97-H细胞的增殖能力下降(P<0.001),迁移、侵袭及凋亡能力显著增强(P<0.001);(3)结果表明,人脐带间充质干细胞条件培养基具有促进MHCC97-H细胞增殖、迁移、侵袭和抑制凋亡的能力;而人脐带间充质干细胞外泌体则具有促进MHCC97-H细胞迁移、侵袭及凋亡和抑制增殖的能力。

人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗化疗致早发性卵巢功能不全的作用及机制

背景:目前研究证明,人脐带间充质干细胞和褪黑素均可改善卵巢功能,但人脐带间充质干细胞联合褪黑素对化疗所致早发性卵巢功能不全的保护作用及机制尚未有研究报道。目的:探讨人脐带间充质干细胞联合褪黑素对化疗所致早发性卵巢功能不全的保护作用及机制。方法:将动情周期正常的40只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、人脐带间充质干细胞组、褪黑素组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组,每组8只。除对照组外,其他组腹腔注射顺铂溶液构建早发性卵巢功能不全大鼠模型,人脐带间充质干细胞组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组于造模后第1,6,11天分别尾静脉注射1×10^(6)个人脐带间充质干细胞,褪黑素组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组每日腹腔注射10 mg/kg褪黑素,治疗期间监测大鼠体质量和动情周期变化。治疗14 d后,ELISA法检测血清雌二醇、卵泡刺激素、促黄体生成素、抗缪勒管激素水平,计算卵巢指数,苏木精-伊红染色观察卵巢组织学形态,透射电镜观察卵巢颗粒细胞超微结构,Western blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白和LC3、P62等自噬蛋白在卵巢组织中的表达。结果与结论:(1)与对照组相比,模型组大鼠体质量逐渐减轻、动情周期紊乱,卵巢指数显著下降(P<0.01);雌二醇、抗缪勒管激素水平降低(P<0.01),卵泡刺激素、促黄体生成素水平升高(P<0.01);卵巢组织学形态和卵巢颗粒细胞超微结构严重破坏;p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和P62蛋白表达显著降低(P<0.01),LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著升高(P<0.001)。(2)与模型组相比,各治疗组大鼠体质量逐渐恢复,部分大鼠动情周期恢复正常,卵巢指数显著升高(P<0.01);雌二醇、抗缪勒管激素水平升高(P<0.05),卵泡刺激素、促黄体生成素水平降低(P<0.05);卵巢组织学形态和卵巢颗粒细胞超微结构显著改善;p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和P62蛋白表达显著升高(P<0.001),LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著降低(P<0.01)。其中人脐带间充质干细胞+褪黑素组上述指标改善更为显著。结果表明,人脐带间充质干细胞联合褪黑素可能通过上调PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制卵巢颗粒细胞自噬来治疗早发性卵巢功能不全。

人脐带间充质干细胞治疗多囊卵巢综合征模型小鼠卵巢组织中Rab27A的表达

背景:多囊卵巢综合征是导致育龄女性不孕的常见生殖内分泌疾病,目前尚无有效的治疗方法,人脐带间充质干细胞可能有助于修复卵巢功能,但其治疗多囊卵巢综合征方面的研究较少。目的:探讨人脐带间充质干细胞治疗多囊卵巢综合征的作用及机制。方法:3周龄雌性ICR小鼠随机分为3组(n=15):正常对照组不作处理,模型组连续21 d灌胃来曲唑诱导建立多囊卵巢综合征模型,治疗组连续21 d灌胃来曲唑+经尾静脉注射人脐带间充质干细胞悬液。治疗前和治疗后7,14 d称量小鼠体质量;治疗后连续10 d阴道涂片检测小鼠动情周期;治疗后14 d,ELISA检测小鼠外周血性激素水平,苏木精-伊红染色观察卵巢形态学改变,免疫荧光、免疫组化检测卵巢组织中Rab27A蛋白表达。结果与结论:①与正常对照组相比,模型组小鼠动情周期紊乱,体质量明显升高,卵泡刺激素水平降低,黄体生成素和睾酮水平均升高,卵巢可见较多囊状扩张的卵泡,Rab27A蛋白表达水平降低;②与模型组相比,治疗组小鼠体质量降低,卵泡刺激素水平升高,黄体生成素和睾酮水平均降低,多囊状扩张的卵泡减少,Rab27A蛋白表达水平升高;③结果表明,人脐带间充质干细胞可能通过上调Rab27A的表达改善多囊卵巢综合征小鼠血清性激素水平及卵巢功能。

维生素D3减轻高糖暴露诱导氧化应激促进人脐带间充质干细胞的成骨分化

背景:糖尿病骨质疏松症逐渐受到公众的关注,然而鲜有研究报道高糖环境对人脐带间充质干细胞成骨分化的影响和相应的治疗策略。目的:探讨维生素D3恢复高糖环境中人脐带间充质干细胞成骨分化的潜力。方法:通过CCK-8法检测人脐带间充质干细胞活力来筛选适宜的维生素D3干预浓度。在高葡萄糖条件下,通过RT-qPCR、蛋白质印迹、免疫荧光、JC-1线粒体膜电位、茜素红染色和β-半乳糖苷酶染色等实验评估维生素D3干预后人脐带间充质干细胞的成骨分化潜能、细胞内活性氧积累、线粒体膜电位改变和细胞衰老情况,并探讨了潜在的机制。结果与结论:①维生素D3在0.1μmol/L至1 mmol/L范围内均能显著促进人脐带间充质干细胞的增殖;②高糖环境下调了人脐带间充质干细胞中成骨相关基因α1-Ⅰ型胶原蛋白、碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙蛋白的mRNA和蛋白表达水平,诱发了氧化应激和细胞衰老;③维生素D3在10μmol/L的干预浓度下显著恢复了高糖条件下人脐带间充质干细胞的成骨表型,并通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻了细胞内的氧化应激和细胞衰老;④结果表明,高糖环境中人脐带间充质干细胞的成骨分化能力降低,维生素D3可以部分提高其成骨分化能力并减轻细胞损伤。

人外周血血清培养人脐带间充质干细胞定向诱导为神经干细胞

背景:细胞培养基种类甚多,成分不尽相同,对细胞生长影响较大。国内外有多项研究采用无血清、含胎牛血清的培养基进行体外扩增培养,但应用含人外周血血清的培养基将人脐带间充质干细胞定向诱导为神经干细胞以及人外周血血清促进神经干细胞分化为其他神经细胞,目前相关研究较少。目的:观察人外周血血清培养的人脐带间充质干细胞定向诱导为神经干细胞的可行性。方法:①采用含体积分数10%人外周血血清的DMEM/F12培养基培养人脐带间充质干细胞,传代培养至第3代时应用流式细胞仪分析其表面标志物,并通过茜素红染色对其成骨分化能力进行检测;②取第3代人脐带间充质干细胞,加入培养体系为含0.5%N2、1.5%B27、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20 ng/mL表皮生长因子的DMEM/F12培养基定向诱导为神经干细胞,对其表面标志物进行鉴定;③取生长状态良好的人脐带间充质干细胞源性神经干细胞,制备成单细胞悬液,均匀接种于96孔板中,加入含体积分数10%人外周血血清的DMEM/F12培养液继续培养8 d后,进行苏木精-伊红染色、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色,检测神经干细胞向其他神经细胞分化情况。结果与结论:①经人外周血血清培养的人脐带间充质干细胞呈漩涡状生长且多层分布,排列有方向性;人脐带间充质干细胞表面高度表达CD44、CD105、CD29、CD73,茜素红染色阳性;②人外周血血清培养的人脐带间充质干细胞可以定向诱导分化为神经干细胞,神经干细胞表面高度表达CD44、CD105、CD29、CD73、Nestin、NF-L、GALC;③神经干细胞诱导分化第8天时,经苏木精-伊红染色后发现其伸出的突起长度较长,分支也较多且邻近细胞之间的突起互相连接,呈典型的神经细胞形态,且微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色均呈阳性。结果表明,人外周血血清培养人脐带间充质干细胞可以定向诱导为神经干细胞,在人外周血血清的作用下神经干细胞随着培养时间的延长,可分化为其他神经细胞。

IL-1β通过激活ERK1/2信号通路抑制人脐带间充质干细胞CD200表达抑制巨噬细胞M2极化

目的探究白细胞介素1β(IL-1β)调控人脐带间充质干细胞CD200表达及其对巨噬细胞极化的影响及作用机制。方法无血清培养基分离培养获得人脐带间充质干细胞(hUC-MSC),形态学观察及流式细胞术检测CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45、人类白细胞抗原DR(HLA-DR)的表达,确定间充质干细胞属性;20 ng/mL IL-1β处理hUC-MSC 24 h,流式细胞术检测CD200阳性细胞率,实时定量PCR和Western blot法检测CD200 mRNA和蛋白表达水平;佛波酯(PMA)诱导THP-1巨噬细胞活化,并与IL-1β处理感染CD200过表达慢病毒的hUC-MSC共培养,流式细胞术检测CD11c和CD206阳性细胞比例;IL-1β联合细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)特异性抑制剂PD98059处理hUC-MSC,Western blot法检测细胞丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号分子与CD200的表达。结果IL-1β显著下调hUC-MSC CD200蛋白表达与CD200阳性细胞率;过表达CD200显著上调hUC-MSC CD200表达,且CD200过表达hUC-MSC提高巨噬细胞CD206阳性细胞比率;IL-1β激活hUC-MSC的ERK1/2信号通路,PD98059上调IL-1β处理后hUC-MSC中CD200的蛋白表达。结论IL-1β通过激活ERK1/2信号通路抑制CD200的表达,进而抑制hUC-MSC对巨噬细胞向M2型极化的促进作用。

富血小板血浆联合人脐带间充质干细胞治疗3期及以上压力性损伤患者的护理经验总结

总结2例富血小板血浆(PRP)联合人脐带间充质干细胞(huMSCs)治疗3期及以上压力性损伤(PI)患者的护理经验,旨在明确PRP联合huMSCs在压力性损伤修复过程中的重要作用,为干细胞治疗压力性损伤的临床应用提供理论依据。护理要点如下:成立干细胞移植团队,明确职责;huMSCs培养、PRP凝胶制备过程;干细胞移植术治疗全程;移植术后安全性评估;PRP凝胶在伤口愈合过程中的作用机制;PRP联合huMSCs的促进作用;创面换药管理;进行营养筛查,制订营养支持计划;实施个性化体位变换;及时评估心理状态,进行个体化心理疏导。经过精心的治疗及护理,2例患者创面均痊愈。

人脐带间充质干细胞的异质性探讨及基于单细胞RNA测序结果的亚群分析

目的探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的异质性,并基于单细胞RNA测序结果进行亚群分析。方法选择两株由郑州奥博细胞医学实验室有限公司提供的hUCMSCs(分别命名为hUCMSCs-1和hUCMSCs-2),通过实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)进行干性基因[性别决定区Y-box 2(Sox2)、Nanog]检测。对hUCMSCs进行成骨诱导,3 d后检测成骨基因碱性磷酸酶(Alp)的表达,7 d后进行碱性磷酸酶染色,14 d后进行茜素红染色。对两株hUCMSCs进行成软骨诱导,21 d后检测成软骨基因二型胶原(COL2A1)的表达。用10 ng/mL白细胞介素-1β(IL-1β)刺激大鼠软骨细胞24 h,与hUCMSCs-1和hUCMSCs-2共培养后,检测软骨细胞合成代谢基因蛋白聚糖(ACAN)和分解代谢基因基质金属蛋白酶3(MMP3)的表达。对hUCMSCs-1进行单细胞RNA测序,并根据功能进行亚群分组,通过生物信息学分析方法描绘各个亚群标志基因热图、富集的信号通路。结果两株hUCMSCs的Sox2、Nanog、Alp、COL2A1表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。在成骨诱导7 d后,hUCMSCs-1的碱性磷酸酶染色程度深于hUCMSCs-2。在成骨诱导14 d后,茜素红染色结果显示,hUCMSCs-1钙结节数量多于hUCMSCs-2。经IL-1β干预后,软骨细胞与两株hUCMSCs共培养后的MMP3表达水平差异有统计学意义(P<0.05),但ACAN表达水平差异不显著(P>0.05)。基于单细胞RNA测序结果,hUCMSCs-1可分为C1、C2、C3三个功能亚群。C1亚群的信号通路在细胞外基质受体相互作用上富集,与软骨细胞合成代谢相关;C2亚群信号通路在细胞衰老和凋亡上富集,与细胞的自我更新相关;C3亚群信号通路在DNA复制和减数分裂上富集,与细胞周期相关。结论不同个体来源的hUCMSCs存在异质性,其在成骨、成软骨和抗分解代谢能力方面可能存在差异。通过单细胞RNA测序可较好地根据hUCMSCs的功能特性对其进行分群,有助于提高间充质干细胞治疗的临床疗效。

影响肝硬化失代偿患者人脐带间充质干细胞治疗效果的影响因素探究

目的探讨多次进行人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSCs)肝内移植及不同时间间隔治疗失代偿期肝硬化患者的临床疗效。方法选取河南科技大学第一附属医院2021年02月-2023年12月失代偿期肝硬化自愿接受治疗患者51例,随机分为单次移植组、多次移植组和对照组,各17例。对比三组实验室指标、影像学检查以及不良反应发生率。结果治疗前,三组肝功能及凝血功能指标差异均无统计学意义(P>0.05);治疗后,多次移植组谷丙转氨酶、总胆红素低于单次移植组与对照组,白蛋白水平高于单次移植组与对照组,差异有统计学意义(P<0.05);单次移植组白蛋白水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。多次移植B组谷丙转氨酶、总胆红素低于A组,白蛋白高于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。经影像学检查显示,多次移植组肝脏占位病变、门静脉血栓以及腹水发生率均低于单次移植组与对照组,差异有统计学意义(P<0.05);单次移植组肝脏占位病变、门静脉血栓以及腹水发生率低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。所有患者治疗过程中均未出现严重不良反应,仅多次移植组术后发生2例发热,经对症处理后消失。三组不良反应对比差异无统计学意义(P>0.05)。结论HUC-MSCs多次移植治疗肝硬化失代偿期患者具有良好的临床疗效,能够有效改善患者的肝脏功能,预防相关并发症的发生。同时,HUC-MSCs多次移植治疗的频率、间隔时间对疗效也有一定的影响,其中间隔3个月的疗效优于间隔1个月。

人脐带间充质干细胞联合莱菔硫烷对阿尔茨海默病转基因小鼠治疗作用的初步研究

目的:探索人源性脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)或莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)单独或联合应用对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)转基因小鼠脑内生物标志物的影响,并为AD治疗策略或进一步研究提供依据。方法:将24只8周龄雄性APP/PS1转基因小鼠随机分为4组,分别接受PBS、SFN、hUC-MSCs单用或与SFN联合治疗。药物腹腔内注射、间充质干经细胞脑室注入,14天后处死小鼠,取大脑进行免疫荧光染色和蛋白质印迹分析。结果:hUC-MSCs和SFN单独或联合使用均能降低大脑皮层Aβ和Tau蛋白水平,联合使用效果更显著。结论:本研究动物实验初步结果见AD主要两个生物标志物Aβ和Tau蛋白下调,提示hUC-MSCs与SFN联合应用可能有效治疗早期AD,这表明SFN和hUCMSCs的联合治疗可能是治疗AD的一种新颖、有效的策略,需要进一步研究。

人脐带间充质干细胞来源外泌体降低脊髓损伤后血脊髓屏障的通透性

背景:研究发现,内皮素参与了脊髓损伤后血脊髓屏障的破坏,干细胞来源外泌体可降低血脊髓屏障的通透性,修复脊髓损伤。目的:观察人脐带间充质干细胞来源外泌体是否可以通过抑制内皮素1表达降低血脊髓屏障的通透性,进而修复脊髓损伤。方法:用超速离心法从人脐带间充质干细胞培养上清液中提取外泌体,透射电子显微镜观察其形态,Western blot检测tsg101、CD63的表达。80只SD大鼠随机分成假手术组、模型组、外泌体组、内皮素1组(n=20),采用改良Allen’s法制备大鼠脊髓损伤模型,内皮素1组用微量注射器直接向损伤部位注射10μL(1μg/mL)内皮素1,术后即刻及1,2 d,分别给予假手术组、模型组尾静脉注射200μL PBS,外泌体组、内皮素1组尾静脉注射200μL外泌体(200μg/mL)。脊髓损伤后第1,3,7,14,21天进行后肢运功功能评分;损伤后第7天通过伊文思蓝染色观察血脊髓屏障通透性,Western blot检测脊髓组织中紧密连接蛋白ZO-1、β-Catenin、Occludin和内皮素1的表达。结果与结论:①外泌体组BBB评分在损伤后3-21 d显著高于模型组(P<0.05),苏木精-伊红染色显示外泌体组脊髓损伤较模型组明显减轻;内皮素1组BBB评分较外泌体组显著降低(P<0.05),内皮素1组脊髓损伤较外泌体组加重;②模型组内皮素1表达量较假手术组显著增加(P<0.05),外泌体组内皮素1表达量较模型组显著降低(P<0.05);③与模型组比较,外泌体组血脊髓屏障伊文思蓝渗出量显著减少(P<0.05),紧密连接蛋白β-Catenin、Occludin、ZO-1的表达增加(P<0.05);与外泌体组比较,内皮素1组伊文思蓝渗出量显著增加(P<0.05),上述紧密连接蛋白表达量显著减少(P<0.05);④结果表明,人脐带间充质细胞来源外泌体通过下调内皮素1表达来保护血脊髓屏障的通透性,起到了修复脊髓损伤的作用。

微电场对人脐带间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

背景:电刺激是一种可用于诱导细胞增殖、分化、凋亡等各种细胞活动的物理方法,诱导干细胞成骨分化将有利于骨的再生。目的:观察微电场是否可以促进人脐带间充质干细胞的增殖与成骨分化。方法:从人新鲜脐带组织获取脐带间充质干细胞,待细胞培养传代至第3代接种于6孔板内,24 h后分别给予0,50,100 mV/mm微电场刺激,刺激频率为每天1 h,连续刺激3 d,然后用显微镜观察细胞生长情况与形态变化,CCK-8和EdU染色法检测细胞的增殖情况,茜素红染色检测细胞的成骨分化能力,Western blot检测ERK通路蛋白的表达水平。结果与结论:①50,100 mV/mm组人脐带间充质干细胞的吸光度值和增殖细胞数目显著高于未刺激组(P<0.05);②微电场刺激前后人脐带间充质干细胞均能诱导分化为骨细胞,但50,100 mV/mm组的成骨分化速度比未刺激组快;③50,100 mV/mm组的p-ERK1/2蛋白表达高于未刺激组,且100 mV/mm组与未刺激组比较差异有显著性意义(P<0.05);④微电场促进人脐带间充质干细胞增殖的机制可能是通过促进ERK的磷酸化实现的。

人脐带间充质干细胞运载呼肠孤病毒对人慢性髓系白血病K562细胞溶瘤作用的研究

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUMSCs)运载3型呼肠孤病毒(Reo3)对人慢性髓系白血病K562细胞的溶瘤效应。方法:流式细胞术检测hUMSCs和K562细胞表面Reo3易感受体——连接黏附分子A(JAM-A)表达情况,电镜观察Reo3感染hUMSCs 72 h后胞内病毒包涵体分布。将不同(0、1、2和3)感染复数(MOI)的Reo3感染hUMSCs 24、48、72、96和120 h后利用CCK-8法筛选最适MOI。选择最适滴度的Reo3感染hUMSCs 24、48、72、96和120 h后收集上清液,利用小鼠成纤维细胞系L929结合半数组织培养感染剂量(TCID50)法测定各组上清液中Reo3病毒滴度以确定最适感染时间。将K562细胞分为对照组、hUMSCs组、Reo3组和hUMSCs-Reo3组,hUMSCs组和hUMSCs-Reo3组设置hUMSCs与K562细胞作用的低、中、高比例(5∶1、10∶1和20∶1)。CCK-8法分析hUMSCs-Reo3与K562细胞共培养24、48、72 h后K562细胞活力的变化。流式细胞术评估细胞凋亡。利用L929细胞确定抗Reo3单克隆抗体的半数效应浓度(EC50);验证在体外抗体存在条件下hUMSCs-Reo3对K562细胞溶瘤作用的变化。Western blot检测运载体作用于K562细胞后胞内Bcl-2、Bax、survivin和cleaved caspase-3蛋白水平。构建K562细胞的BALB/c裸鼠皮下荷瘤模型(每组6只),分析hUMSCs-Reo3在体内对K562细胞的抑瘤效果。结果:hUMSCs和K562细胞表面JAM-A分子表达量分别为11.0%和99.0%。电镜显示Reo3感染hUMSCs 72 h后胞内出现大量病毒包涵体。在120 h范围内,与未感染组相比,MOI=1的Reo3对hUMSCs活力无显著影响,故最佳MOI为1;TCID50结果显示,MOI=1的Reo3感染hUMSCs 48 h后细胞裂解液中病毒滴度最高,故最适感染时间为48 h。hUMSCs-Reo3作用24、48和72 h后K562细胞活力呈现剂量与时间依赖性抑制。抗Reo3单克隆抗体的EC50为1∶34;在体外不同浓度(1∶34、1∶300和1∶600)抗体存在条件下,hUMSCs仍能运载Reo3抑制K562细胞活力并诱导凋亡发生。与对照组相比,hUMSCs-Reo3作用48 h后K562细胞中Bcl-2和survivin表达水平显著下调(P<0.05),Bax和cleaved caspase-3表达水平显著上调(P<0.05或P<0.01)。在BALB/c裸鼠荷瘤模型中,荷瘤体积测定、肿瘤组织和主要脏器病理学分析及小动物活体成像仪检测组织蛋白酶B/L活性结果表明,运载体在体内对K562细胞具有溶瘤效应而对正常组织无不良影响。结论:hUMSCs可有效运载Reo3,该运载体系在体内、外实验中能够释放足量Reo3抑制K562细胞恶性增殖并促进细胞凋亡,从而发挥溶瘤效应。

双酚A对子宫内膜间充质干/基质细胞干性的影响及人脐带间充质干细胞源性上清对细胞损伤的改善作用

目的:探讨双酚A(BPA)对子宫内膜间充质干/基质细胞(eMSCs)增殖活性和干性特征的影响,阐明人脐带间充质干细胞源性上清(hUCMSC-Sup)对细胞损伤的改善作用。方法:体外培养eMSCs,以0、200、250、300、350、400μmol·L^(-1)BPA处理。将eMSCs分为对照组(仅培养液培养)、BPA组(含200μmol·L^(-1)BPA的等体积培养液培养)、BPA+hUCMSC-Sup组(含200μmol·L^(-1)BPA及50%体积比hUCMSC-Sup的等体积培养液培养)和BPA+CHIR-99021组(含200μmol·L^(-1)BPA及10μmol·L^(-1)CHIR-99021的等体积培养液培养),使用干细胞成球培养液培养eMSCs干细胞球,其余细胞均使用DMEM/F12完全培养基培养。噻唑蓝(MTT)法检测各组eMSCs存活率,球体形成实验检测各组eMSCs干细胞球数和直径,CCK-8法检测各组eMSCs干细胞球中细胞增殖活性,流式细胞术检测各组eMSCs中CD73+细胞百分率,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组eMSCs中性别决定区Y框蛋白2(Sox2)、八聚体结合转录因子4(Oct4)和Nanog mRNA表达水平,Western blotting法检测各组eMSCs中β-连环蛋白(β-catenin)蛋白表达水平。结果:MTT法检测,BPA作用24和48 h,与0μmol·L^(-1)BPA组比较,200、250、300、350和400μmol·L^(-1)BPA组eMSCs存活率均明显降低(P<0.01)。药物作用24 h时,与对照组比较,BPA组eMSCs存活率明显降低(P<0.01);药物作用48 h时,与对照组比较,BPA组eMSCs存活率明显降低(P<0.01);与BPA组比较,BPA+hUCMSC-Sup组eMSCs存活率明显升高(P<0.05)。球体形成实验检测,与培养3 d组比较,培养4和5 d组eMSCs干细胞球数和直径均明显增加(P<0.05或P<0.01);与对照组比较,培养48 h时BPA组eMSCs干细胞球数和直径均明显减少(P<0.05或P<0.01)。CCK-8法检测,处理24和48 h时,与对照组比较,BPA组eMSCs干细胞球中细胞增殖活性均明显降低(P<0.01);与BPA组比较,BPA+hUCMSC-Sup组eMSCs干细胞球中细胞增殖活性均明显升高(P<0.01)。流式细胞术检测,与对照组比较,BPA组eMSCs中CD73+细胞百分率明显降低(P<0.01);与BPA组比较,BPA+hUCMSC-Sup组eMSCs中CD73+细胞百分率明显升高(P<0.01)。RT-qPCR法检测,与对照组比较,BPA组eMSCs中Sox2、Oct4和Nanog mRNA表达水平均明显降低(P<0.01);与BPA组比较,BPA+hUCMSC-Sup组和BPA+CHIR-99021组eMSCs中Sox2、Oct4及Nanog mRNA表达水平均明显升高(P<0.01)。Western blotting法检测,与对照组比较,BPA组eMSCs中β-catenin蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与BPA组比较,BPA+hUCMSC-Sup组和BPA+CHIR-99021组eMSCs中β-catenin蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。结论:BPA能够抑制eMSCs的干性特征,损伤子宫内膜的自我更新及修复作用,其机制可能与下调细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性有关。hUCMSC-Sup可以促进受损eMSCs的增殖,并对BPA诱导的eMSCs干性损伤起到改善作用。

人脐带间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠肠道屏障功能的调节作用

背景:糖尿病肾病是引起终末期肾病的重要原因,其中肠道屏障损伤在糖尿病肾病的发生发展中起到了重要作用。目的:观察人脐带间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠肠道屏障的保护作用。方法:30只8周龄雄性SD大鼠随机分配至健康对照组、模型组和人脐带间充质干细胞组,每组10只。人脐带间充质干细胞组大鼠在糖尿病肾病成模后经尾静脉注射1×106个人脐带间充质干细胞,每周1次,连续4周,健康对照组和模型组大鼠在相同时间注射等体积PBS。末次注射后1周,光镜下观察肾脏和结肠组织形态学改变情况,免疫组化法检测大鼠结肠组织中ZO-1和Occludin的表达;ELISA法检测大鼠血清D-乳酸和脂多糖水平。此外,还利用活体成像系统观察DiR染料标记的人脐带间充质干细胞在大鼠体内的示踪分布,以及应用免疫组化法检测结肠组织中人源性间充质干细胞表面标志抗原CD44和CD90的表达。结果与结论:①与模型组比较,人脐带间充质干细胞移植显著抑制了糖尿病肾病大鼠尿素氮、血肌酐、24 h尿蛋白水平和尿白蛋白/肌酐比值的增加(均P<0.05);②在糖尿病肾病大鼠结肠中发现了人源间充质干细胞表面标志物CD44和CD90的表达;③与健康对照组相比,模型组大鼠结肠组织中紧密连接蛋白Occludin与ZO-1蛋白表达水平显著减少,而人脐带间充质干细胞治疗后显著提高了Occludin和ZO-1的表达;④与模型组比较,人脐带间充质干细胞移植后显著降低了糖尿病肾病大鼠血清D-乳酸和脂多糖水平;⑤结果提示,人脐带间充质干细胞可能通过增强糖尿病肾病大鼠肠道紧密连接蛋白的表达来保护肠道屏障功能。

不同剂量人脐带间充质干细胞移植对新生大鼠脑白质损伤的修复作用

目的比较不同剂量人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)对新生大鼠脑白质损伤(white matter injury,WMI)的修复作用。方法将2日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为5组:假手术组、WMI组和hUC-MSCs组(低剂量组、中剂量组、高剂量组),每组24只。成功制备新生大鼠WMI模型24 h后,WMI组经侧脑室注射无菌PBS,hUC-MSCs组注射不同剂量hUC-MSCs。造模后14 d、21 d,采用苏木精-伊红染色法观察各组侧脑室周围组织病理变化,实时荧光定量聚合酶链式反应法检测各组脑组织中髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)mRNA表达水平,免疫组化法观察GFAP、神经元核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)在侧脑室周围组织表达水平;TUNEL染色观察各组侧脑室周围组织细胞凋亡情况。造模后21 d,采用Morris水迷宫实验观察各组新生大鼠的空间学习记忆能力。结果造模后14 d、21 d,WMI组和低剂量组侧脑室周围组织均可见大量细胞核固缩、核破裂,神经纤维排列紊乱,与WMI组比较,中、高剂量组上述病理改变均减轻;与高剂量组比较,中剂量组神经纤维排列相对整齐。与WMI组比较,低剂量组MBP、GFAP mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05),中、高剂量组MBP mRNA表达水平升高,GFAP mRNA表达水平降低;中剂量组MBP mRNA表达水平高于高剂量组,中剂量组GFAP mRNA表达水平低于高剂量组(P<0.05)。与WMI组比较,低剂量组GFAP、NeuN阳性表达差异无统计学意义(P>0.05),中、高剂量组NeuN阳性表达升高,GFAP阳性表达降低(P<0.05);中剂量组NeuN阳性表达高于高剂量组,GFAP阳性表达低于高剂量组(P<0.05)。与WMI组比较,低剂量组凋亡细胞数差异无统计学意义(P>0.05),中、高剂量组凋亡细胞数少于WMI组(P<0.05);中剂量组凋亡细胞数少于高剂量组(P<0.05)。与WMI组比较,低剂量组逃避潜伏期时间差异无统计学意义(P>0.05);自潜伏期第3天开始,中剂量组逃避潜伏期时间少于WMI组(P<0.05);中、高剂量组穿越平台次数多于WMI组(P<0.05)。结论低剂量hUC-MSCs对新生大鼠WMI修复效果欠佳,中、高剂量hUC-MSCs均有修复作用,中剂量效果更优。

人脐带间充质干细胞源性外泌体促进骨折愈合的研究进展

骨折可导致疼痛、活动受限以及生活质量下降等不良后果,其治疗通常采用手术或保守治疗,往往伴随一些并发症。干细胞来源外泌体(exosomes)因具有良好的生物相容性、低免疫原性、内在稳定性及靶向性而成为当下研究的热点。外泌体在促进骨折愈合方面具有一定的优势,它可调控成骨细胞和破骨细胞的功能、血管生成以及软骨再生,提高临床治疗效果,降低骨折并发症的发生。本文对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells)来源外泌体促进骨折愈合的研究进展进行综述,探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体在促进骨折愈合方面发挥的重要作用及其作用机制。