环状RNA同源性蛋白激酶3靶向微RNA-338促进胶质瘤细胞侵袭、迁移的实验研究

目的探讨人血清环状RNA同源性蛋白激酶3(CircHIPK3)靶向微RNA-338(miR-338)对胶质瘤细胞U251细胞侵袭、迁移的影响。方法2021年2-12月,在武汉大学人民医院科研中心将U251细胞分为空白(NG)组、CircHIPK3阴性对照(shcontrol)组、HIPK3敲减(sh-CircHIPK3)组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测U251细胞中CircHIPK3、miR-338表达水平;Transwell检测细胞迁移与侵袭;划痕法检测细胞迁移;流式细胞术检测细胞周期;通过Circular RNA Interactome、RegRNA2.0、CircBank Database网站预测CircHIPK3(ID:hsa_circ_0000284)的靶向miRNA并用双萤光素酶实验验证,蛋白质印迹法检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达。结果与NG组、sh-control组比较,sh-CircHIPK3组中CircHIPK3(1.00±0.00、1.06±0.26比0.56±0.06)表达水平显著降低(P<0.05),miR-338(1.00±0.00、1.12±0.19比1.89±0.28)表达、G1期细胞比例[(58.72±0.36)%、(58.45±0.27)%比(64.72±0.47)%]升高(P<0.05),U251细胞侵袭数目[(164.89±12.55)个、(165.77±12.16)个比(80.13±11.37)个]、划痕愈合率[(25.66±2.37)%、(26.38±2.53)%比(10.36±1.53)%]、迁移细胞数目[(196.72±18.75)个、(194.65±17.86)个比(95.58±8.66)个]、S期细胞比例[(26.45±0.39)%、(26.57±0.41)%比(20.72±0.18)%]明显降低(P<0.05);miR-338是CircHIPK3的靶基因。与NG组、sh-control组比较,sh-CircHIPK3组MMP-2(1.31±0.23、1.33±0.20比0.61±0.05)、MMP-9(1.16±0.22、1.15±0.21比0.85±0.19)蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论沉默CircHIPK3通过靶向上调miR-338表达能抑制胶质瘤细胞U251细胞迁移和侵袭。

环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3在三阴性乳腺癌细胞侵袭中的作用及机制

目的:研究环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3(circHIPK3)在三阴性乳腺癌(TNBC)细胞侵袭中的调控作用及机制。方法:收集2022年1月—2023年6月手术切除的TNBC组织及对应癌旁组织各40例、非三阴性乳腺癌组织及对应的癌旁组织各40例,采用荧光定量PCR法(qPCR)检测circHIPK3的表达水平。同时培养人正常乳腺上皮细胞株MCF10A,非三阴性乳腺癌细胞株MCF-7、SK-BR-3,TNBC细胞株HCC1806、MDA-MB-231、HCC-70,采用qPCR检测circHIPK3的表达水平,依据其表达水平,筛选出circHIPK3表达水平最高的MDA-MB-231细胞用于后续试验。筛选出敲低circHIPK3效果最显著的siRNA序列,然后将circHIPK3 siRNA和miR-485-3共转染MDA-MB-231细胞,采用qPCR检测circHIPK3、miR-485-3p的表达,采用Western blot法检测FGF2的蛋白表达,Transwell侵袭试验检测细胞侵袭数目。结果:乳腺癌组织中circHIPK3的相对表达水平高于对应的癌旁组织(P<0.05);TNBC组织中circHIPK3的相对表达水平高于非三阴性乳腺癌组织(P<0.05);TNBC细胞株中circHIPK3的相对表达水平高于非三阴性乳腺癌细胞株和正常乳腺癌上皮细胞株(P<0.05),且MDA-MB-231细胞中circHIPK3的表达水平高于HCC1806、HCC-70细胞(P<0.05);与转染siRNA对照序列的细胞比较,转染circHIPK3 siRNA的MDA-MB-231细胞中circHIPK3、FGF2蛋白的表达水平及细胞侵袭数目降低,miR-485-3p的表达水平升高(P<0.05);与转染miRNA对照序列的细胞比较,转染miR-485-3p抑制物的MDA-MB-231细胞(与circHIPK3 siRNA共转染)中miR-485-3p的表达水平降低,FGF2蛋白的表达水平及细胞侵袭数目增加(P<0.05)。结论:circHIPK3促进TNBC细胞侵袭,其可能的机制为通过抑制miR-485-3p的表达进而促进FGF2蛋白的表达。

慢性心力衰竭患者血清环状RNA同源域相互作用激酶3和转录因子GATA结合蛋白4与心室重构及心功能的相关性

目的探究慢性心力衰竭(CHF)患者血清环状RNA同源域相互作用激酶3(circHIPK3)和转录因子GATA结合蛋白4(GATA4)与心室重构及心功能的相关性。方法选取2021年6月至2023年6月河南科技大学第一附属医院收治的152例慢性心力衰竭(CHF)患者为观察对象,作为CHF组,选取同期健康体检者110例,作为对照组,参照纽约心脏病协会(NYHA)心功能分级标准将CHF患者分为Ⅰ~Ⅱ级(53例)、Ⅲ级(50例)、Ⅳ级(49例),采用实时荧光定量PCR法检测血清样本中circHIPK3表达水平,酶联免疫吸附法检测血清中GATA4蛋白水平,彩色多普勒超声心动图检测心室重构及心功能指标:左心室质量指数(LVMI)、左心室重构指数(LVRI)、左心室后壁厚度(LVPW)、左室舒张内径(LVEDD)、左心室短轴缩短率(LVFS)、心输出量(CO)、左心室射血分数(LVEF),多因素logistic回归分析CHF患者心功能分级的影响因素,Pearson法分析CHF患者血清circHIPK3、GATA4与LVMI、LVRI、LVPW、LVEDD、LVFS、CO、LVEF的相关性。结果与对照组比较,CHF患者血清中circHIPK3[(1.14±0.25)比(1.89±0.59)]、GATA4[(17.26±2.52)pg/ml比(26.94±4.24)pg/ml]水平显著升高,差异存在统计学意义(t=12.538、21.363;P<0.05),circHIPK3、GATA4水平随心功能分级的增加而升高。circHIPK3、GATA4、LVMI是心功能分级为Ⅲ~Ⅳ级的独立危险因素,CO、LVEF是保护因素(P<0.05)。CHF患者血清中circHIPK3、GATA4水平与LVMI、LVPW、LVEDD呈正相关,与LVRI、LVFS、CO、LVEF呈负相关(P<0.05);CHF患者血清中circHIPK3与GATA4呈正相关(P<0.05)。结论circHIPK3、GATA4在CHF患者血清中呈现高表达,与心室重构、心功能指标存在一定关联性,可能对该病的诊治、预后评估有重要参考价值。

环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3(circHIPK3)通过吸附miR-124-3p促进神经胶质瘤细胞增殖及转移

目的探究环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3(circHIPK3)通过海绵吸附微小RNA-124-3p(miR-124-3p)对神经胶质瘤细胞增殖和转移的影响。方法按照LipofectamineTM 3000试剂说明书将circHIPK3短发夹RNA(sh-circHIPK3)、pcDNA3.1-circHIPK3、miR-124-3p模拟物(miR-124-3p mimics)和pcDNA3.1-WEE1转染T98G细胞;实时荧光定量PCR检测circHIPK3和miR-124-3p在神经胶质瘤组织和细胞系中的表达情况;CCK-8法检测T98G细胞增殖情况;TranswellTM法检测T98G细胞侵袭能力;双荧光素酶报告基因验证miR-124-3p与circHIPK3和丝氨酸/苏氨酸激酶WEE1的靶向关系;Western blot法检测WEE1和上皮间质转化(EMT)相关蛋白[上皮钙黏素(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)]的表达情况;此外,circHIPK3和WEE1竞争性结合miR-124-3p后,采用CCK-8法检测T98G细胞增殖,TranswellTM检测T98G细胞侵袭。结果circHIPK3在神经胶质瘤组织和细胞中高表达,敲减circHIPK3抑制T98G细胞增殖和侵袭能力,并抑制其EMT;双荧光素酶报告基因结果证实miR-124-3p是circHIPK3的靶基因,WEE1是miR-124-3p的靶基因;同时过表达miR-124-3p与circHIPK3或WEE1,或共转染sh-circHIPK3和pcDNA3.1-WEE1可恢复过表达miR-124-3p对T98G细胞增殖、侵袭和EMT的抑制作用。结论circRNA-HIPK3与WEE1海绵吸附miR-124-3p促进神经胶质瘤细胞增殖、侵袭和EMT。

环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3促进三阴乳腺癌细胞增殖和迁移的作用机制研究

目的探讨环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3(circHIPK3)促进三阴乳腺癌(TNBC)细胞增殖和迁移的作用机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测circHIPK3在TNBC细胞系HCC1806、MDA-MB-231、HCC-70和人正常乳腺细胞系MCF-10A中的表达水平。将circHIPK3高表达的TNBC细胞系分为sh-NC组、sh-circHIPK3组,分别转染NC敲减质粒、circHIPK3敲减质粒;将circHIPK3低表达的TNBC细胞系分为oe-NC组、oe-circHIPK3组,分别转染NC过表达质粒、circHIPK3过表达质粒。采用qRT-PCR检测各组细胞中circHIPK3表达水平,通过细胞增殖实验(MTS)检测各组细胞增殖活性,采用Transwell实验检测各组细胞迁移能力,采用TOP/FOP Flash双荧光素酶报告基因检测各组细胞荧光素酶活性,并通过蛋白质印迹法(Western blotting)检测各组细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)、c-MYC和基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达。结果circHIPK3在3种TNBC细胞系中的表达水平(MDA-MB-231细胞中表达水平最高,HCC-70细胞中表达水平最低)均高于人正常乳腺细胞系MCF-10A,差异有统计学意义(F=30.110,P<0.001)。qRT-PCR结果显示,circHIPK3在sh-circHIPK3组中的相对表达量为(0.36±0.06),低于sh-NC组的(0.98±0.03),差异有统计学意义(t=16.008,P<0.001);circHIPK3在oe-circHIPK3组中的相对表达量为(6.29±0.71),高于oe-NC组的(0.99±0.05),差异有统计学意义(t=12.897,P<0.001)。sh-circHIPK3组MDA-MB-231细胞增殖活性和迁移能力均低于sh-NC组,oe-circHIPK3组HCC-70细胞增殖活性和迁移能力均高于oe-NC组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.001)。sh-circHIPK3组MDA-MB-231细胞荧光素酶活性低于sh-NC组,oe-circHIPK3组HCC-70细胞荧光素酶活性高于oe-NC组,差异有统计学意义(P<0.001)。sh-circHIPK3组MDA-MB-231细胞Wnt3a、β-catenin、c-MYC和MMP-2蛋白表达均低于sh-NC组,oe-circHIPK3组HCC-70细胞Wnt3a、β-catenin、c-MYC和MMP-2蛋白表达均高于oe-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论circHIPK3通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进TNBC细胞的增殖和迁移。

环状RNA circHIPK3在氯氮平诱导H9C2心肌细胞损伤中的作用及相关机制

目的探讨环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3(circHIPK3)在氯氮平诱导H9C2心肌细胞损伤中的作用及相关机制。方法通过细胞转染使H9C2细胞中circHIPK3过表达或沉默circHIPK3并用氯氮平处理H9C2细胞。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测circHIPK3的表达。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞存活率。采用试剂盒检测乳酸盐脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白(cTnI)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平。采用流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位。采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果氯氮平显著提高H9C2细胞circHIPK3、LDH、CK-MB、cTnI、MDA、凋亡率、Bax、cleaved Caspase-3水平(P<0.05),显著降低H9C2细胞存活率、SOD、GSH-Px、Bcl-2、线粒体膜电位(P<0.05)。circHIPK3过表达促进氯氮平对上述指标的影响(P<0.05),沉默circHIPK3逆转氯氮平对上述指标的影响(P<0.05)。结论氯氮平可通过促进circHIPK3表达诱导H9C2心肌细胞损伤,其机制可能与circHIPK3激活氧化应激与线粒体凋亡通路有关。

环状RNA HIPK3在急性胰腺炎患者中的表达及与病情严重程度和预后的相关性分析

目的探讨环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3(circHIPK3)在急性胰腺炎(AP)患者中的表达及与病情严重程度和预后的相关性。方法选取2020年11月至2021年11月我院126例AP患者为AP组,其中轻度38例,中度43例,重度45例;90例正常健康体检者为对照组。根据AP患者入院后28 d的生存情况分为生存组(n=86)和死亡组(n=40)。采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测circHIPK3的表达水平。Pearson法分析circHIPK3表达水平与APACHEⅡ评分及Ranson评分的相关性;Logistic回归分析影响AP患者预后的危险因素。结果AP组的circHIPK3、IL-6、IL-8、TNF-α表达水平显著高于对照组(P<0.05);重度组circHIPK3、IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平、APACHEⅡ评分及Ranson评分显著高于中度组及轻度组,中度组显著高于轻度组(P<0.05);circHIPK3的表达水平与IL-6、IL-8、TNF-α水平、APACHEⅡ评分及Ranson评分均呈正相关(P<0.05);生存组的Cr、CRP、cTn1、CK、BNP、circHIPK3水平均明显低于死亡组(P<0.05);Logistic回归分析发现CK、BNP、circHIPK3高水平是影响AP患者预后的危险因素(P<0.05)。结论AP患者血清circHIPK3表达水平异常增加,其水平与患者预后密切相关。

环状RNA circHIPK3通过miR-495-3p靶向XIAP调控乳腺癌细胞增殖、迁移和凋亡

目的 探讨环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3 (circHIPK3)通过miR-495-3p靶向X连锁凋亡蛋白抑制剂(XIAP)调控乳腺癌细胞增殖、迁移和凋亡。方法 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot分别检测乳腺癌组织、良性组织、乳腺癌细胞系MCF-7 circHIPK3、miR-495-3p、XIAP的表达;将si-NC、si-circHIPK3、si-circHIPK3+inhibitor NC、sicircHIPK3+miR-495-3p inhibitor分别转染至MCF-7细胞并命名为si-NC组、si-circHIPK3组、si-circHIPK3+inhibitor NC组、sicircHIPK3+miR-495-3p inhibitor组,未做任何处理的MCF-7细胞记为NC组。qRT-PCR检测MCF-7细胞中circHIPK3、miR-495-3p表达;MTT法检测MCF-7细胞增殖;流式细胞术检测MCF-7细胞凋亡;Transwell检测MCF-7细胞侵袭、迁移情况;Western blot检测MCF-7细胞XIAP、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin以及凋亡蛋白水平;双荧光素酶验证circHIPK3与miR-495-3p、miR-495-3p与XIAP的关系。结果 在乳腺癌组织和细胞中circHIPK3、XIAP水平显著上调,miR-495-3p表达量显著下调,且在MCF-7细胞差异最显著(P <0.05),因此选MCF-7细胞为研究对象。与NC组、si-NC组相比,sicircHIPK3组MCF-7细胞凋亡率、miR-495-3p表达量、E-cadherin、Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平显著升高,差异有统计学意义(P <0.05),OD450值、迁移、侵袭细胞数目、circHIPK3表达量、XIAP、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2蛋白水平显著降低,差异有统计学意义(P <0.05)。下调miR-495-3p削弱了沉默circHIPK3对MCF-7细胞恶性生物学行为的抑制作用;circHIPK3靶向调节miR-495-3p/XIAP轴。结论 沉默circHIPK3可能通过上调miR-495-3p来抑制XIAP表达,进而对乳腺癌细胞起到抗增殖,促凋亡的作用。

老年急性心肌梗死患者PCI术后血清CircHipk3、miR-29b-3p表达水平及其对MACE的预测价值

目的探讨老年急性心肌梗死(AMI)患者经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后血清环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3(CircHipk3)、微小RNA(miR)-29b-3p表达水平及其对主要不良心血管事件(MACE)的预测价值。方法选取2019年8月至2021年8月在开滦总医院赵各庄医院进行PCI术的225例AMI患者作为研究对象,对患者随访,根据是否发生MACE分为MACE组和非MACE组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测PCI术后血清CircHipk3、miR-29b-3p表达水平。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清CircHipk3、miR-29b-3p对AMI患者PCI术后发生MACE的预测价值。采用Pearson相关分析发生MACE的AMI患者血清CircHipk3表达水平与miR-29b-3p表达水平的相关性。采用多因素Logistic回归分析AMI患者PCI术后发生MACE的危险因素。采用Starbase在线软件预测CircHipk3与miR-29b-3p的结合位点。结果225例AMI患者共有58例患者发生MACE,发生率为25.78%。MACE组冠状动脉多支病变患者比例高于非MACE组,肌钙蛋白(cTn)T、CircHipk3表达水平高于非MACE组,左心室射血分数(LVEF)、miR-29b-3p表达水平低于非MACE组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,发生MACE的AMI患者血清CircHipk3表达水平与miR-29b-3p表达水平呈负相关(r=-0.597,P<0.05)。血清CircHipk3联合miR-29b-3p预测AMI患者PCI术后发生MACE的曲线下面积(AUC)显著大于CircHipk3、miR-29b-3p单独预测的AUC(Z_(联合-CircHipk3)=2.276,P=0.021;Z_(联合-miR-29b-3p)=2.113,P=0.039)。多因素Logistic回归分析结果显示,冠状动脉多支病变、CircHipk3>1.32、miR-29b-3p≤0.84是AMI患者PCI术后发生MACE的危险因素(P<0.05)。Starbase软件预测结果显示,CircHipk3的3′-UTR有miR-29b-3p的结合位点。结论AMI患者血清CircHipk3表达水平升高,miR-29b-3p表达水平降低,二者联合检测对AMI患者PCI术后发生MACE有一定预测价值。

circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3与糖尿病视网膜病变的相关性研究

目的探讨环状RNA(circRNA)-锌指蛋白532(ZNF532)、circRNA-同源域相互作用蛋白激酶3(HIPK3)与糖尿病视网膜病变(DR)的相关性。方法纳入109例DR患者(DR组)、110例单纯糖尿病患者(DM组)和65例健康体检志愿者(对照组)。实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测血清circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3表达,酶联免疫吸附试验检测血清血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6水平。Pearson分析DR患者血清circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3表达与血清VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6水平相关性。单因素和多因素Logistic回归分析DR危险因素,受试者工作特征(ROC)曲线分析circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3诊断DR的价值。结果DR组血清circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3表达以及VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6水平高于DM组和对照组(P<0.05)。DR组血清circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3表达与VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6水平均呈正相关(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示高水平circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3及VEGF是糖尿病患者发生DR的独立危险因素(P<0.05)。三者诊断糖尿病患者发生DR的曲线下面积分别为0.736、0.740和0.864,联合诊断高于单独诊断(P<0.05)。结论糖尿病患者血清中circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3表达上调与DR发生有关,两者可以作为DR辅助诊断的潜在指标。

circ-HIPK3通过调控miR-1207-5p促进结直肠癌细胞增殖和转移的作用机制

目的探究环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3(circ-HIPK3)通过调控微小RNA-1207-5p(miR-1207-5p)促进结直肠癌(CRC)细胞增殖和转移的作用机制。方法体外培养人CRC细胞系HCT166细胞,分别以pcDNA3.1-NC(空白组)与pcDNA3.1-circ-HIPK3(研究组)转染HCT166细胞48 h,于倒置荧光显微镜下观察转染效率,以不做任何处理的HCT166细胞作为对照组;采用荧光定量PCR检测细胞circ-HIPK3及miR-1207-5p mRNA表达,采用MTT实验及划痕实验分别检测细胞增殖及迁移能力,双荧光素酶实验检测circ-HIPK3与miR-1207-5p的靶向作用,Western blot法检测Wnt/β-catenin通路蛋白表达情况。结果研究组细胞增殖促进率、划痕愈合率、细胞中circ-HIPK3、miR-1207-5p mRNA相对表达水平及Wnt、β-catenin蛋白表达水平均高于对照组和空白组,差异有统计学意义(P<0.05),而对照组与空白组上述各项指标比较差异无统计学意义(P>0.05);双荧光素酶实验结果显示circ-HIPK3上存在miR-1207-5p的结合位点。结论circ-HIPK3通过下调CRC中miR-1207-5p的相对表达,促进细胞增殖和转移,其作用机制可能与激活Wnt/β-catenin通路有关。

miR-144-3p和SGK3在口腔鳞癌中的表达水平及临床意义

目的:探究口腔鳞癌(OSCC)组织中miR-144-3p和血清和糖皮质激素调节蛋白激酶3(SGK3)的表达,分析二者与临床病理特征及预后的关系。方法:收集78例OSCC组织标本作为病例组,另选正常口腔黏膜上皮组织标本作为对照组,实时定量PCR法(RT-PCR法)检测组织中miR-144-3p、SGK3的相对表达,Western blot法、免疫组化法检测组织中SGK3蛋白表达,分析二者与临床病理特征及预后的关系。制作受试者工作特征曲线(ROC),评估miR-144-3p和SGK3对OSCC的诊断效能;所有患者均进行30个月随访,统计患者生存率,采用Kaplan-Meier对生存情况进行分析,Log-Rank法检测组间生存差异。Pearson相关性分析miR-144-3p、SGK3二者相关性。结果:与对照组相比,OSCC组miR-144-3p mRNA表达升高,SGK3 mRNA、蛋白、蛋白阳性表达率均降低(P<0.05),miR-144-3p表达、SGK3阳性表达与性别、年龄、吸烟情况、肿瘤浸润深度无关(P>0.05),与TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05)。ROC曲线显示miR-144-3p预测OSCC的AUC为0.767,敏感度71.79%,特异度63.96%。SGK3预测OSCC的AUC为0.683,敏感度66.67%,特异度75.64%。随访30个月,27例患者死亡,生存率为65.38%。miR-144-3p高表达组死亡率(44.68%)、SGK3阴性组死亡率(48.78%)明显高于miR-144-3p低表达组(19.35%)、SGK3阳性组(18.92%),Kaplan-Meier生存曲线显示,两组患者总体生存率差异显著(P<0.05)。miR-144-3p与SGK3表达呈显著负相关(r=-0.417,P <0.05)。结论:miR-144-3p在OSCC组织中表达上调,SGK3表达下调,与肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移有关,可能作为OSCC诊断、预后的生物学指标。

基于环状RNA测序探讨当归芍药散对APPswe/PS1ΔE9转基因小鼠的神经保护作用

目的:研究环状RNA(circRNA)在当归芍药散对APPswe/PS1ΔE9双转基因(APP/PS1)小鼠神经保护作用及其机制。方法:6月龄APP/PS1小鼠20只随机分为模型组和药物组,药物组予以当归芍药散水提液灌胃,10只野生C57BL/6小鼠为正常组,正常组和模型组给予等体积生理盐水,各组连续灌药8周。应用circRNA测序分析当归芍药散干预前后APP/PS1小鼠差异表达circRNA,构建circRNA-miRNA mRNA相互作用网络,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)验证cric RNA测序结果,应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马区磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),磷酸化PI3K(p-PI3K),蛋白激酶B1(Akt1),p-Akt1,B淋巴细胞瘤-2和Bcl-2-相关X的蛋白质(Bax)的蛋白表达水平,应用免疫组化检测海马区的Caspase-3的蛋白表达水平,应用末端标记(TUNEL)法检测小鼠海马区神经元凋亡水平。结果:与模型组比较,当归芍药散干预后有90个差异表达的circRNA,其中46个上调,44个下调。与正常组比较,模型组circRNA1398,circRNA1399表达水平下降,miR-103-3p,miR-153-3p,miR-143-3p及miR-143-5p表达水平上调(P<0.01),与模型组比较,当归芍药散组circRNA1398,circRNA1399表达水平上调,miR-103-3p,miR-153-3p,miR-143-3p及miR-143-5p表达水平下降(P<0.01)。通过circRNA-miRNA mRNA相互作用网络分析circRNA1398和circRNA1399调控Bcl-2和Akt1基因表达。与正常组比较,模型组的p-PI3K,Akt1,p-Akt1和Bcl-2表达量下降(P<0.01),Bax和Caspase-3的蛋白表达量升高(P<0.01);与模型组比较,当归芍药散组APP/PS1小鼠海马区的p-PI3K,Akt1,p-Akt1和Bcl-2表达量增加(P<0.01),Bax和Caspase-3的蛋白表达量下降(P<0.01)。与正常组比较,模型组小鼠海马区神经元凋亡水平上升,细胞凋亡率为(43.76±2.92)%。与模型组比较,当归芍药散干预后细胞凋亡率为(24.64±3.39)%。结论:当归芍药散可以激活PI3K/Akt通路和抑制APP/PS1小鼠海马区神经元凋亡,发挥神经保护作用,具体机制可能与其上调circRNA1398和circRNA1399表达及其相应miRNA的表达相关。

circHIPK3/miR-330-5p对人晶状体上皮细胞损伤的影响及其调控机制研究

目的探究环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3(circHIPK3)、微小RNA-330-5p(miR-330-5p)表达对人晶状体上皮细胞损伤的影响及其调控机制。方法研究对象为人晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)SRA01/04,采用过氧化氢(H_(2)0_(2))诱导构建SRA01/04细胞损伤模型,随机分为正常对照组(NC)组、模型组(A)组、过表达质粒(OE-Vector)+H,O,组(B组)、circHIPK3过表达质粒(OE-circHIPK3)+H_(2)0_(2)组(C组)、OE-circHIPK3+miR-330-5p阴性对照mimicNC序列(miR-NC)+H_(2)0_(2)组(D组)、OE-circHIPK3+miR-330-5p寡核苷酸模拟物(miR-330-5pmimics)+H_(2)0_(2)组(E组),共5组。qRT-PCR法检测各组细胞中circHIPK3、miR-330-5p水平。双荧光素酶报告法验证circHIPK3与miR-330-5p的靶向关系。分别采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞存活率、调亡率。分析细胞中氧化应激[超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)]水平。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(BCL2-associated X,Bax)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)]。结果A组细胞中circHIPK3水平低于NC组,miR-330-5p水平高于NC组(P<0.05);与NC组比较,A组细胞存活率、Bcl-2蛋白水平及SOD、GSH-Px水平降低,凋亡率、Bax蛋白水平及MDA水平升高(P<0.05);与A组比较,D组细胞存活率升高,凋亡率、Bax蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高,SOD、GSH-Px水平升高,MDA水平降低(P<0.05);circHIPK3可靶向调控miR-330-5p表达。与D组比较,E组miR-330-5p水平升高,细胞存活率、Bcl-2蛋白水平及SOD、GSH-Px水平降低,凋亡率、Bax蛋白水平及MDA水平升高(P<0.05)。结论circHIPK3过表达可靶向抑制miR-330-5p表达,促进LECs存活,抑制LECs调亡,增强其抗氧化应激能力,减轻LECs损伤。

circNFⅨ通过miR-34a调节MET/PI3K/AKT信号通路对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响

目的探讨环状RNA核因子Ⅸ(circNFⅨ)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、凋亡和上皮间质转化(EMT)的影响,以及其作用机制。方法收集2019-03-16-2021-03-16延边大学附属医院75对NSCLC组织和癌旁组织(距癌周4 cm)样本,人正常肺上皮细胞BEAS-2B及NSCLC细胞A549、H1703、PGCL3、H1299为研究对象,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测组织及细胞circNFⅨ和miR-34a表达水平。取汇合度约达80%的A549细胞,利用Lipofectamine^(TM) 2000转染试剂盒对其进行转染,并分为空白组、si-NC组、si-circNFⅨ组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-circNFⅨ组、si-circNFⅨ+inhibitor-NC组和si-circNFⅨ+miR-34a inhibitor组7组,qRT-PCR法检测转染效率,细胞计数盒8(CCK8)法检测各组细胞增殖,流式细胞术检测各组细胞凋亡,蛋白质印迹法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、间质钙黏蛋白(N-cadherin)、肝细胞生长因子受体(MET)及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路相关蛋白表达,双荧光素酶报告基因检测circNFⅨ与miR-34a的靶向关系。结果circNFⅨ在癌及癌旁组织的相对表达量分别为2.27±0.25和1.02±0.09,差异有统计学意义,t=40.742,P<0.001;miR-34a在癌组织、癌旁组织的相对表达量分别为0.31±0.02和1.04±0.05,差异有统计学意义,t=117.396,P<0.001;circNFⅨ在NSCLC细胞A549、H1703、PGCL3和H1299中相对表达量分别为2.96±0.28、2.21±0.22、1.87±0.16和1.63±0.12,均高于BEAS-2B细胞(1.01±0.07),F=90.817,P<0.001;miR-34a在A549、H1703、PGCL3和H1299中相对表达量分别为0.23±0.01、0.27±0.02、0.34±0.02和0.39±0.01,均低于BEAS-2B细胞(1.02±0.03),F=1663.420,P<0.001。A549细胞中circNFⅨ表达水平最高,miR-34a表达水平最低,因此选择A549细胞为研究对象进行后续研究。qRT-PCR结果显示,沉默circNFⅨ后circNFⅨ表达量降低(F=59.619,P<0.001),miR-34a表达量升高,F=172.261,P<0.001;而加入miR-34a抑制剂后miR-34a表达量降低,F=148.375,P<0.001。CCK8法检测结果表明,沉默circNFⅨ后A549细胞在24、48 h的增殖能力低于空白组和si-NC组,P<0.001;而加入miR-34a抑制剂后,A549细胞在24、48 h的增殖能力增强,P<0.001。流式细胞术结果显示,敲低circNFⅨ后A549细胞细胞凋亡率升高,P<0.001;而加入miR-34a抑制剂后,抑制了circNFⅨ对细胞凋亡的促进作用,F=315.084,P<0.001。蛋白质印迹法结果发现,沉默circNFⅨ后,促进E-cadherin蛋白表达,抑制N-cadherin、Vimentin蛋白表达及肝癌EMT过程,而加入miR-34a抑制剂后则逆转了该过程;下调circNFⅨ后,MET、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白降低,抑制了MET/PI3K/AKT信号通路,而miR-34a抑制剂后逆转了circNFⅨ对该通路的抑制作用。双荧光素酶报告基因实验证实miR-34a为circNFⅨ的靶基因。结论沉默circNFⅨ通过上调miR-34a来抑制MET/PI3K/AKT信号通路进而抑制NSCLC细胞增殖和EMT,并促进细胞凋亡。