人血管能抑素canstatin基因的分子克隆

目的:克隆血管能抑素canstatin基因,测定并分析其基因序列.方法:从人胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出canstatin基因,克隆进载体pUCm-T获得重组质粒pUCm-T/canstatin,转化E.coliDH5α,挑选出阳性克隆,测定基因序列.结果:从人胎盘组织中提取出RNA,10g/L琼脂糖凝胶电泳显示3条清晰条带,分别对应28S,18S,5S.分光光度计测定总RNA的A260=0.879,A280=0.410,A260:A280=2.095,总RNA浓度为1.8g/L.RT-PCR扩增产物与预期的目的基因canstatin长度一致.RT-PCR产物与载体pUCm-T连接过夜后,转化E.coliDH5α,在LB平板上生长出蓝色和白色菌落.挑选6个白色菌落做酶切鉴定,其中一个菌落经BamHI酶切后,只出现1条特异性条带,位置与酶切前质粒相近,而经HindⅢ酶切后,出现2条特异性条带,其中1条与酶切前质粒位置相近,另1条与目的基因位置基本一致,证实为阳性克隆.测定该阳性克隆基因序列,结果显示其与Genbank中公布的canstatin基因序列完全一致.结论:成功克隆了canstatin基因,为进一步研究其抗肿瘤作用打下基础.

人血管能抑素抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、转移及血管新生

目的:探讨人血管能抑素(canstatin)对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、转移和血管新生的影响。方法:将pCMV-Script/canstatin及空载体pCMV-Script通过电穿孔的方法转染A549细胞,G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR检测转染后细胞中canstatin mRNA的表达,Western blotting检测转染后细胞中canstatin蛋白的表达。建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,观察pCMV-Script/canstatin组A549细胞培养上清对小鼠Lewis肺癌移植瘤的治疗作用,免疫组化检测各治疗组荷瘤小鼠移植瘤的微血管密度。结果:pCMV-Script/canstatin转染A549细胞在G418筛选后成功形成克隆,转染的A549细胞能有效表达can-statin mRNA和蛋白。pCMV-Script/canstatin治疗组小鼠肿瘤体积明显小于pCMV-Script组和NS组[(1.47±0.21)cm^3vs(2.43±0.15)cm^3、(2.53±0.18)cm^3,P<0.01);pCMV-Script/canstatin组、pCMV-Script组和NS组的肺转移结节数分别为(3.00±1.00)、(7.80±1.48)、(7.60±2.41)个,pCMV-Script/canstatin组肿瘤转移受到显著的抑制(P<0.01);pCMV-Script/canstatin组小鼠的肿瘤组织微血管数明显少于pCMV-Script组和NS组[(84.40±8.83)vs(188.68±11.15)、(190.24±12.91)个,P<0.01]。结论:pCMV-Script/canstatin能在A549细胞中表达并分泌至细胞外,canstatin可明显抑制Lewis肺癌移植瘤的生长、转移和血管新生。

人血管能抑素免疫兔抗血清制备及其特性测定

纯化的人血管能抑素包涵体进行SDS＿PAGE分离,切胶回收目的蛋白,与弗氏不完全佐剂充分乳化后,进行多点皮下注射免疫新西兰白兔,制备兔抗人血管能抑素抗血清,抗血清去除交叉反应抗体后,进行WesternBlotting分析抗血清与人血管能抑素及其N端和C端片段的抗原抗体反应特性。结果表明,经过4次加强免疫后,获得了高效价的兔抗人血管能抑素抗血清。抗血清去除交叉反应抗体后,WesternBlotting分析表明,它能与人血管能抑素发生特异的抗原抗体反应,同时还能与人血管能抑素的N端片段和C端片段发生特异性较弱的抗原抗体反应。证明制备的兔抗人血管能抑素抗血清能应用于人血管能抑素及其N端和C端片段免疫学研究中。

血管能抑素重组基因表达载体抗肺癌效应研究

目的:通过构建人血管能抑制素(Canstatin)真核表达载体,转染裸鼠肿瘤局部,探索其对肺癌治疗作用。方法: RT-PCR法获取Canstatin cDNA全长,定向克隆法构建Canstatin基因表达载体pCMV-Script-Cans。荧光定量PCR法检测转染 细胞Canstatin mRNA的表达。台盼蓝拒染法、3H-TdR掺入法检测细胞生长增殖,TUNEL法检测细胞凋亡。基因枪转染重组 载体到荷瘤裸鼠肿瘤局部,CD31单克隆抗体微血管记数检测抗血管生成效应。结果:成功构建pCMV-Script-Cans重组载体, 并在转染的细胞株中检测到Canstatin mRNA的表达。人脐静脉内皮HUV-EC-C细胞株pCMV-Script-Cans质粒转染组比空载 体组3H-FdR掺入量明显减低(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.01),重组载体转染肿瘤生长缓慢,微血管数显著低于对 照组(P<0.01)。结论:pCMV-Script-Cans重组载体能在转染的哺乳动物细胞中表达Canstatin,并抑制内皮细胞增殖,而且有 很好的抗肺癌血管生成作用。