基于NLRP3/Caspase-1通路探讨银屑平丸含药血清对TNF-α诱导的人表皮角质形成细胞焦亡的影响

目的探讨银屑平丸含药血清通过调控NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)/胱天蛋白酶-1(cysteine aspartate-specific proteinase-1,Caspase-1)信号通路改善肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的人表皮角质形成细胞焦亡的作用机制。方法制备银屑平丸含药血清、阿维A含药血清及空白血清,采用CCK-8试剂检测空白血清对人表皮角质形成细胞存活率的影响;体外常规培养人表皮角质形成细胞,使用TNF-α诱导人表皮角质形成细胞建立体外银屑病损伤模型,设置正常组、模型组、空白血清组、银屑平丸含药血清组、阿维A含药血清组;ELISA法检测各组细胞上清液中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)水平;RT-PCR检测各组细胞NLRP3,功能蛋白D(gasdermin D,GSDMD)、Caspase-1 mRNA表达;Western blot法检测各组细胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白的表达。结果与正常组比较,空白血清干预后细胞存活率无明显改变。与正常组比较,模型组和空白血清组细胞上清中IL-1β、IL-18水平显著升高(P<0.01),且NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白及mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,银屑平丸含药血清组及阿维A含药血清组细胞上清IL-1β、IL-18蛋白及mRNA水平明显下降(P<0.01),NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白及mRNA表达显著下降(P<0.01)。结论银屑平丸含药血清可下调TNF-α诱导的人表皮角质形成细胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白及mRNA表达,降低炎症因子表达水平,其作用机制可能与调控NLRP3/Caspase-1通路有关。

人表皮角质形成细胞Toll样受体表达

目的研究人表皮角质形成细胞Toll样受体表达谱。方法培养人永生化角质形成细胞系HaCaT细胞和正常人表皮角质形成细胞(NHEK),采用分散酶分离表皮。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测10种Toll样受体mRNA表达,流式细胞仪检测HaCaT细胞和NHEK表面Toll样受体2和4蛋白的表达。结果HaCaT细胞、NHEK以及分离的表皮均有全部10种Toll样受体mRNA表达,其表达强弱各不相同。流式细胞仪检测显示HaCaT细胞和NHEK表面有Toll样受体4蛋白的表达,而Toll样受体2无明显表达。结论人表皮角质形成细胞中有Toll样受体1～10mRNA的组成性表达。

基于Notch信号通路探讨银屑平丸含药血清对TNF-α诱导的人表皮角质形成细胞相关蛋白及炎症因子的影响

目的基于调节Notch信号通路探讨银屑平丸含药血清对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的人表皮角质形成细胞相关蛋白及炎症因子的影响。方法根据中药血清药理学方法制备银屑平丸含药血清、阿维A含药血清,将血清分为5%、10%、20%3个浓度对人表皮角质形成细胞进行干预,采用CCK-8试剂筛选含药血清最佳作用浓度;建立TNF-α诱导的银屑病细胞损伤模型,设置空白组、模型组、银屑平丸含药血清组、阿维A组、模型+γ-分泌酶抑制剂(DAPT)组、银屑平丸含药血清+DAPT组。采用ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)水平,采用Real-timePCR法检测Notch信号通路Notch1,Jagged-1表达,免疫荧光法检测各组细胞内皮蛋白(Involucrin)表达水平。结果TNF-α最佳作用浓度为10 ng·mL^(-1),银屑平丸含药血清最佳作用浓度为20%。与空白组比较,模型组可使各组细胞上清TNF-α、IL-6、IL-8水平升高(均P<0.0001),Notch1、Jagged-1表达上调(均P<0.0001),并使细胞Involucrin荧光表达增强(P<0.0001);与模型组比较,银屑平丸含药血清组可使细胞上清TNF-α、IL-6、IL-8水平降低(P<0.05,P<0.01),使Notch信号通路Notch1、Jagged-1表达下调(均P<0.0001),并使细胞Involucrin荧光表达减弱(P<0.05);与银屑平丸含药血清组比较,银屑平丸含药血清+DAPT组细胞上清TNF-α、IL-6、IL-8水平降低(P<0.0001,P<0.05,P<0.01),Notch1、Jagged-1表达下调(均P<0.0001),细胞Involucrin荧光表达减弱(P<0.05)。结论银屑平丸含药血清可抑制TNF-α诱导的人表皮角质形成细胞增殖,降低炎症因子表达水平及人表皮角质形成细胞相关蛋白表达,其机制可能与调节Notch信号通路有关。

氨基糖甙类体外抑制人表皮角质形成细胞tRNA的生物合成过程

病原体对抗生素逐步增长的耐药现象以及缺乏强效的抗菌药成为感染性疾病治疗中的主要问题，因而有必要进一步了解抗生素在分子水平上的作用机制。以往的证据表明RNA是抗细菌和抗病毒药作用的关键靶点，而氨基糖甙类抗生素除了可以抑制病原体的核糖体功能，抑制蛋白质合成，还有报道可干扰各种RNA分子并在体外能抑制人角质形成细胞的增殖。

UVA损伤人表皮细胞模型中载物界面的选择

目的选择一种建立长波紫外线(ultrayiolet,UVA)照射人表皮角质形成细胞损伤模型的理想载物界面。方法选取原代培养的处于指数生长期的角质形成细胞,分别采用泡沫板、锡纸板、冰面作为载物界面,进行相同剂量的UVA照射,同时设未照射组为对照组,通过改良MTT法检测细胞损伤程度。结果冰面作为载物界面时,细胞损伤相对较弱,损伤率仅为19.88%;锡纸面作为载物界面时,细胞照射损伤最重,损伤率高达82.76%;泡沫板作为载物界面时的细胞照射损伤率为55.58%,介于上述两种载物界面之间,各组与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。结论泡沫板是UVA照射人表皮细胞损伤模型的理想载物界面。

绿茶水粗提物抗中波紫外线致人表皮细胞衰老作用

以人表皮角质形成细胞(HaCaT)为模型,采用中波紫外线诱导细胞衰老,研究绿茶水粗提物对细胞的抗衰老效果。在细胞培养基(DMEM)中分别添加0~20μg/mL绿茶水粗提物,培养细胞接受60mJ/cm^2 UVB照射诱导,考察绿茶水粗提物对细胞形态、凋亡水平、细胞存活率、细胞内抗氧化酶活力、细胞内活性氧簇(ROS)含量、丙二醛(MDA)含量、细胞线粒体膜电位、Na^+,K^+-ATP酶活力的影响。结果表明:绿茶水粗提物对受诱导细胞在细胞体积、形状、核体积上明显改善,能抑制细胞凋亡;细胞存活率提高(30.52±8.69)%;细胞内抗氧化酶活力明显提高;ROS含量下降17.16%;MDA含量降低(50.69±6.81)%;JC-1染色红绿荧光平均光密度比提高13.75%;Na^+,K^+-APT酶活力提高(103.95±3.64)%。试验结果表明绿茶水粗提物具有抗中波紫外线致人表皮细胞衰老作用。

研究确定UVA损伤人表皮细胞模型的照射剂量

目的研究确定建立长波紫外线(UVA)照射人表皮角质形成细胞(HEKC)损伤模型的照射剂量。方法选用原代培养的处于指数生长期的HEKC,将采用UVA剂量为3.07、6.14、12.29、24.58 J进行照射的设为剂量组,对未进行UVA照射的设为对照组。细胞损伤程度采用改良四甲基偶氮唑盐(MTT)法进行检测。结果 HEKC采用3.07 J UVA照射后,细胞损伤率7.27%;HEKC采用6.14 J UVA照射后,细胞损伤率32.73%;HEKC采用12.29 J UVA照射后,细胞损伤率72.73%;HEKC采用24.58 J UVA照射后,细胞损伤率95.45%;各剂量组吸光度(OD)值及损伤率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论建立UVA损伤HEKC模型最适照射剂量的IC_(50)值为8.09 J。

蚯蚓小分子多肽提取物对人皮肤细胞活性及胶原分泌的影响

通过体外细胞模型，考察蚯蚓小分子多肽提取物（LMWPEE）对正常成人皮肤成纤维细胞（HSF）和正常成人表皮角质形成细胞（HEK）的细胞活性以及对HSF分泌I型前胶原蛋白的影响。结果表明，与空白组相比，质量浓度为25—400 mg／L的LMWPEE对2种细胞的细胞活性都具有显著促进作用，但对2种细胞的细胞周期并没有明显的影响。LMWPEE对HSF细胞活性的促进作用存在一定的剂量一效应关系，而促进HEK细胞活性的较佳质量浓度为50 mg／L。此外，LMWPEE在质量浓度为200和400 mg／L时，可显著促进HSF分泌I型前胶原蛋白，较空白组分别提高了31％（P〈0．05）和51％（P〈0．01）。

复方黄柏液涂剂对中波紫外线致HaCaT细胞急性光损伤的修复作用

目的探讨复方黄柏液涂剂对中波紫外线(UVB)致人表皮角质形成细胞(HaCaT细胞)急性光损伤的修复作用。方法用CCK8法确定复方黄柏液最佳处理浓度。体外培养HaCaT细胞,设对照组、模型组和实验组。其中实验组加入复方黄柏液后,模型组和实验组分别予10、20、30 mJ/cm^2的UVB照射,24 h后比较各组HaCaT细胞增殖率,以及培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)表达水平。结果分别予10、20、30 mJ/cm^2的UVB照射后,发现在同等UVB剂量下,实验组HaCaT细胞增殖率、SOD水平及CAT水平显著高于模型组,LDH及MMP-1表达低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论复方黄柏液涂剂对UVB致HaCaT细胞急性光损伤具有防护作用。

PM2.5联合中波紫外线处理对HaCaT细胞的影响

目的研究PM2.5联合中波紫外线(UVB)处理对人皮肤角质形成细胞Ha Ca T的影响。方法收集环境中PM2.5并进行其金属成分分析;MTT法测定PM2.5对Ha Ca T细胞的半数抑制浓度(IC50);将细胞分为空白对照组(NC组)、单纯IC50浓度的PM2.5处理组(PM2.5组)、单纯30 m J/cm2的UVB照射组(UVB组)和PM2.5联合UVB处理组(联合处理组),MTT法检测不同处理组对细胞活力的抑制;流式细胞术检测不同处理对细胞凋亡的影响;Western blot检测不同处理后PARP、LC3的蛋白表达变化。结果 PM2.5样品中金属成分有Ca、Ba、Al、Cu、Pb等;PM2.5对Ha Ca T细胞的IC50约为300μg/m L;不同处理组之间,在处理后24 h,对细胞活力的抑制差异显著(P<0.001),其中联合处理组细胞对比NC组活力最低(P<0.001);流式分析结果显示,与NC组比,PM2.5组、UVB组以及联合处理组细胞凋亡率增加(P<0.01),联合处理组凋亡率较PM2.5组增加(P<0.05),但低于UVB照射组(P<0.01);Western blot显示PM2.5组、UVB组以及联合处理组LC3-Ⅱ、PARP蛋白较NC组均有增加,联合处理组PARP较UVB组减少,LC3-Ⅱ较PM2.5组、UVB组增加。结论 PM2.5能增加UVB对Ha Ca T细胞的损伤,其主要可能通过增加细胞自噬,而非凋亡方式。

三氯乙烯诱导皮肤角质形成细胞凋亡的体外研究

目的检测三氯乙烯(TCE)对人表皮角质形成细胞(NHEK)的凋亡诱导作用,探讨TCE皮肤毒性的作用靶。方法采用中性红吸附试验测定TCE对体外无血清培养的NHEK的中性红吸附减少50%的浓度(NR50值),确定TCE染毒剂量;测定丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力反映细胞脂质过氧化作用和氧化状态;用透射电子显微镜(TEM)和流式细胞仪(FCM)观察细胞凋亡形态学改变和测定细胞DNA含量,计算凋亡发生率及增殖指数(PI)。结果TCE对NHEK的NR50值为4.53(3.92～5.13)mmol/L;TCE处理NHEK4h后,MDA含量的增加和SOD活力的抑制均具有剂量-效应关系(r=0.98,r=0.93,P<0.01);TEM观察显示,与对照相比,TCE处理组细胞可见明显凋亡改变;FCM测定显示,DNA含量直方图中G1期前可见明显的凋亡峰,与对照组相比,TCE处理组细胞凋亡率明显增高(空白对照及TCE0.125、0.500、2.000mmol/L组分别为18.42%、31.83%、38.63%、44.35%),而PI则明显降低(空白对照及TCE0.125、0.500、2.000mmol/L组分别为4.99%、3.26%、2.48%、2.07%)。结论在体外培养条件下,TCE可通过脂质过氧化和氧化应激作用诱导NHEK凋亡,抑制其增殖。

UVA联合UVB照射对原代人角质形成细胞增殖的影响

目的探讨95％长波紫外线（UVA）联合5％中波紫外线（UVB）照射对原代人表皮角质形成细胞（HEK）增殖的影响，为构建13光对人工皮肤光损伤模型提供实验依据。方法用总剂量分别为0、2．5、5、10、20、30、40、60J／cm^2的紫外线（含95％UVA和5％UVB），分别照射体外培养的HEK，继续培养24h后，用噻唑蓝（MTT）法检测细胞活力，用SPSS软件计算引起HEK半数损伤时的紫外线照射剂量。结果8种剂量紫外线照射后，HEK相对抑制率分别为0、1．03％、6．60％、17．28％、31．28％、49．59％、59．67％、70．99％，当总照射剂量≥10J／cm^2时，HEK相对抑制率与对照组相比，差异有统计学意义（F=62．11，P〈0．05）；HEK相对抑制率为50％时的紫外线照射总剂量为31．31J／cm^2。结论随着紫外线照射剂量的加大，HEK增殖活力降低，31．31J／cm^2为HEK半数死亡的照射剂量。

中波紫外线通过抑制Hippo通路促进AKT磷酸化致日光性角化病发病机制研究

目的探究在HaCaT细胞和A431细胞中,中波紫外线(UVB)通过Hippo通路对AKT磷酸化的影响。方法检测日光性角化病(AK)和皮肤鳞状细胞癌(cSCC)中Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)、丝/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,AKT)表达量。构建YAP表达量下降的HaCaT细胞和A431细胞,通过蛋白免疫印迹法分析照射UVB对YAP表达量下降的细胞Hippo通路和AKT磷酸化的影响。结果cSCC中YAP、AKT表达量均高于AK,AKT表达量与YAP正相关。UVB照射HaCaT细胞时,其中YAP表达量随照光剂量增加(P<0.01)。通过细胞转染使HaCaT细胞、A431细胞yap基因相对表达量下降,YAP表达量下降(PHaCaT<0.01,PA431<0.001)。UVB照射HaCaT细胞和A431细胞时,Hippo通路受抑制,促进AKT磷酸化。结论UVB照射通过抑制Hippo通路促进YAP表达,进而促进AKT磷酸化,提示这可能是AK转变为cSCC的发病机制之一。

过氧化物酶体增殖物激活受体在寻常性银屑病患者表皮中的表达

目的研究过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）在寻常性银屑病患者表皮角质形成细胞中的表达和意义。方法采用免疫组化方法检测PPARPPARα、β／δ、γ在5例正常人表皮、17例寻常性银屑病患者皮损及非皮损表皮中的表达，并用图像分析方法进行半定量分析。结果PPARα、β／δ、γ在正常人表皮角质形成细胞中均有不同程度的细胞核表达；在银屑病皮损表皮中的表达强度均较非皮损处下降（P〈0．01）。在银屑病非皮损表皮中，PPARβ／δ、γ的表达强度均较正常人表皮明显升高（P〈0．01）。结论PPARα表达下调可能参与了银屑病表皮角质形成细胞过度增生和分化不全的病理过程，而PPARβ／δ、γ在维持表皮细胞正常增生分化稳态中可能发挥协同作用。

利用聚羟基乙酸构建组织工程皮肤的实验研究

目的 以聚羟基乙酸 (PGA)为培养支架 ,用组织工程方法在体外构建双层、有活性皮肤。方法 应用酶消化法分别获取人成纤维细胞 (FB)和表皮角质形成细胞 (KC) ,体外扩增培养。接种HF与PGA上 1周后 ,在复合物表面接种KC ,共培养 1周将复合物置于气 液界面继续培养。于不同时间段取材 ,行组织学、超微结构及免疫组织化学检测。结果 接种表皮角质形成细胞在“FB PGA”复合物表面 1周后可见 2～ 3层连续的HK在复合物上生长良好 ;4周时PGA已部分降解 ,表皮分层分化较完善 ,抗involucrin染色阳性 ,透射电镜观察可见表皮细胞分层分化良好 ,细胞的相邻面有桥粒连接。结论 采用组织工程技术可以在体外构建双层、有活性的人工皮肤 ;组织工程皮肤具有和正常皮肤相似的组织学特征及生化成分。