DRP1调控线粒体稳态对人视网膜色素上皮细胞上皮-间充质转化的影响

目的探讨线粒体动力相关蛋白(DRP1)对人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞上皮-间充质转化(EMT)进程的影响。方法构建H_(2)O_(2)干预ARPE-19细胞模型,将ARPE-19细胞分为3组,NG组:采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞6 h;H_(2)O_(2)组:先采用650μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)干预细胞,此后培养方式及时间与NG组相同;H_(2)O_(2)+Mdivi-1组:先采用10μmol·L^(-1)Mdivi-1处理ARPE-19细胞2 h,再给予650μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)干预,此后培养方式及时间与NG组相同。Western blot检测各组细胞p-DRP-1/DRP1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波型蛋白(Vimintin)及紧密连接蛋白(ZO-1)表达水平;线粒体红色荧光探针检测各组细胞线粒体形态;线粒体超氧化物红色荧光探针检测各组细胞线粒体活性氧(ROS)水平;JC-1染色试剂盒检测各组细胞线粒体膜电位;免疫荧光检测各组细胞中ZO-1表达水平。结果H_(2)O_(2)组细胞p-DRP-1/DRP1蛋白表达比值高于NG组,H_(2)O_(2)+Mdivi-1组细胞p-DRP-1/DRP1蛋白表达比值低于H_(2)O_(2)组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H_(2)O_(2)+Mdivi-1组细胞较H_(2)O_(2)组线粒体碎片化程度得到改善。H_(2)O_(2)组细胞线粒体ROS水平(4.42±0.29)与NG组(1.00±0.17)及H_(2)O_(2)+Mdivi-1组(2.15±0.18)比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H_(2)O_(2)组细胞红/绿荧光强度比值(0.16±0.12)与NG组(1.00±0.09)及H_(2)O_(2)+Mdivi-1组(0.42±0.05)比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H_(2)O_(2)组细胞上皮样标志物表达下降,间质样标志物表达上升,H_(2)O_(2)+Mdivi-1组细胞上皮样标志物表达上升,间质样标志物表达下降。各组细胞α-SMA、N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、Vimintin及ZO-1相对表达量比较,H_(2)O_(2)组与NG组及H_(2)O_(2)+Mdivi-1组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。ZO-1免疫荧光染色实验显示,H_(2)O_(2)+Mdivi-1组的细胞连接紧密程度优于H_(2)O_(2)组。结论DRP1可调控线粒体动态平衡,靶向DRP1可改善线粒体功能并抑制EMT进展,从而减轻H_(2)O_(2)诱导的RPE细胞功能障碍。

Notch1和自噬对高糖诱导下的人视网膜色素上皮细胞的作用

目的观察高糖条件下Notch1与自噬之间的关系,并探讨Notch1抑制剂DAPT和自噬抑制剂3-MA对高糖培养的人视网膜色素上皮细胞的影响。方法预实验选定25 mmol·L^(-1)葡萄糖作为ARPE-19细胞的高糖培养液,5 mmol·L^(-1)3-MA作为自噬抑制剂浓度。将体外培养的ARPE-19细胞随机分为对照组(添加5 mmol·L^(-1)葡萄糖培养48 h)、高糖组(添加25 mmol·L^(-1)葡萄糖培养48 h)、高糖+DAPT组(添加25 mmol·L^(-1)葡萄糖+40μmol·L^(-1)DAPT,40μmol·L^(-1)DAPT先处理2 h,然后更换25 mmol·L^(-1)葡萄糖处理48 h)及高糖+3-MA组(添加25 mmol·L^(-1)葡萄糖+5 mmol·L^(-1)3-MA,5 mmol·L^(-1)3-MA处理2 h,然后更换25 mmol·L^(-1)葡萄糖处理48 h)。采用透射电镜观察各组细胞超微结构;CCK-8和划痕实验检测各组细胞增殖和迁移情况;Western blot检测各组细胞Notch1和自噬相关蛋白LC3、Beclin1的蛋白表达情况;RT-PCR法检测各组细胞中Notch1、LC3、Beclin1的mRNA相对表达量。结果透射电子显微镜下对照组细胞结构正常,核呈圆形或卵圆形,自噬小体少量可见;高糖组细胞损伤略微明显,胞质不均且可见较多自噬溶酶体。与对照组相比,高糖组细胞增殖、迁移能力均上升,Notch1、LC3、Beclin1的mRNA和蛋白表达水平均增高(均为P<0.05);与高糖组相比,高糖+DAPT组细胞增殖、迁移能力均下降,Notch1、LC3、Beclin1的mRNA和蛋白表达水平均降低(均为P<0.05);与高糖组相比,高糖+3-MA组细胞增殖、迁移能力均下降,LC3、Beclin1的mRNA和蛋白表达水平均降低(均为P<0.05)。结论高糖可激活Notch1和自噬过程并促进ARPE-19细胞的增生,而Notch1抑制剂DAPT和自噬抑制剂3-MA在一定程度上可抑制自噬的进程,发挥抑制细胞增生的作用。

枸杞提取物对过氧化氢诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的:体外通过过氧化氢(H2O2)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞造成氧化损伤,观察枸杞提取物对人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞活性的影响,探讨枸杞提取物通过抗氧化对ARPE-19细胞的保护作用。方法:采用不同浓度H2O2诱导体外ARPE-19细胞的氧化损伤,确定最佳浓度;采用MTT法检测枸杞含药血清对ARPE-19细胞活力的影响,确定安全有效的药物浓度;观察各组细胞的形态,划痕试验检测各组ARPE-19细胞的活力;Western Blot法检测各组细胞Nrf2/ARE信号通路相关因子Nrf2的质蛋白和核蛋白的表达水平;试剂盒检测氧化应激水平的相关指标活性氧(ROS)含量、还原型谷胱甘肽(GSH)含量及过氧化氢酶(CAT)活力。结果:当H2O2浓度为200μmol/L,作用2 h时,ARPE-19细胞出现明显的氧化损伤(P<0.01);不同浓度的枸杞含药血清对ARPE-19细胞的干预效果不同,在2.5%、5%、10%的浓度下对损伤的ARPE-19细胞具有明显的促进增殖的作用(P<0.05),故选择2.5%、5%、10%浓度的枸杞含药血清进行下一步实验,与模型组相比,枸杞含药血清组细胞形态良好,长势均匀;细胞内的ROS含量显著降低(P<0.01),GSH含量明显上升(P<0.05),CAT活力显著升高(P<0.01);Nrf2质蛋白表达增强(P<0.05),核蛋白表达减弱(P<0.05)。结论:枸杞含药血清能够提高ARPE-19细胞自身的抗氧化能力,从而对ARPE-19细胞产生保护作用。

人参皂苷Rg1对缺氧诱导所致人视网膜色素上皮细胞损伤的抑制作用及机制

目的探究人参皂苷Rg1(GRg1)对缺氧诱导所致人视网膜色素上皮(ARPE)细胞损伤的作用及机制。方法体外培养ARPE-19细胞,将其随机分为对照组、模型组及GRg1高、中、低剂量组与缺氧诱导因子1α(HIF-1α)抑制剂组。除对照组外,其余组采取氯化钴诱导ARPE-19细胞构建缺氧模型,通过CCK-8法、TUNEL法测定各组不同时间点细胞活性及凋亡情况,DCFH-DA荧光探针对各组活性氧(ROS)水平,经由RT-qPCR、Western blotting法测定各组细胞内HIF-1α、BDNF、PACAP38 mRNA与蛋白表达。结果与对照组相比,各组给药0、12、24 h时ARPE-19细胞活性均低、凋亡率高(P均<0.05);GRg1高剂量组给药12、24、48 h时ARPE-19细胞活性均高于模型组、GRg1低剂量组(P均<0.05),细胞凋亡率均低于模型组、GRg1低剂量组(P均<0.05);GRg1高剂量组给药24、48 h时细胞活性均高于GRg1中剂量组(P均<0.05)。与对照组相比,各组给药48 h时ARPE-19细胞ROS、HIF-1αmRNA及蛋白表达均高(P均<0.05);GRg1高剂量组ARPE-19细胞ROSHIF-1αmRNA及蛋白表达均低于模型组、GRg1低剂量组(P均<0.05);GRg1高剂量组ARPE-19细胞BDNF、PACAP38 mRNA及蛋白表达均高于模型组、GRg1低剂量组(P均<0.05);GRg1高剂量组与HIF-1α抑制剂组给药不同时间点细胞活性与凋亡率、细胞ROS、HIF-1α、BDNF、PACAP38表达比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论GRg1能减轻缺氧诱导所致ARPE-19细胞损伤,其机制可能与抑制细胞ROS、HIF-1α表达,上调BDNF、PACAP38表达有关。

LED光源照射及PI3K抑制剂对人视网膜色素上皮细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨LED光源照射对人视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬和凋亡的影响,以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002在光照下对RPE细胞自噬和凋亡的影响。方法体外培养人ARPE-19细胞,随机分为6 h对照组、6 h模型组、6 h LY294002组,12 h对照组、12 h模型组、12 h LY294002组,24 h对照组、24 h模型组、24 h LY294002组,分别给于设定时间的LED冷光照射或加入LY294002后的光照。采用噻唑蓝法检测各组细胞存活率;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;透射电子显微镜观察各组细胞超微结构;构建稳定表达红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(LC3)的RPE细胞株,激光共聚焦合倒置荧光显微镜分析细胞自噬流变化;Western blot法检测苄氯素1(Beclin 1)、LC3和p62自噬相关蛋白表达水平。结果与对照组比较,6、12、24 h模型组细胞存活率均下降(均P<0.05),12、24 h LY294002组细胞存活率均下降(均P<0.01);与模型组比较,12、24 h LY294002组细胞存活率均升高(均P<0.05)。与对照组比较,6、12、24 h模型组和LY294002组细胞凋亡率均升高(均P<0.05);与模型组比较,6、12 h LY294002组细胞凋亡率均下降(均P<0.05)。模型组RPE细胞在光照24 h后,胞内可见较多的自噬泡,LY294002干预后也可见聚集性分布的自噬囊泡。观察自噬流发现,对照组少见红色亮点,模型组红色亮点荧光随光照时间延长数量逐渐增多,Merge图中黄色亮点数量增多明显,LY294002干预后,红色亮点与黄色亮点呈增多趋势。与对照组比较,6、12、24 h模型组和LY294002组细胞中Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平均升高,p62蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组比较,6、12、24 h LY294002组细胞中Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达均升高,12、24 h LY294002组细胞中p62蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论LED光源照射可刺激ARPE-19细胞发生自噬,增加细胞凋亡率;PI3K抑制剂LY294002能上调细胞的自噬活性,减缓凋亡。

姜黄素对人视网膜色素上皮细胞中基质金属蛋白酶、纤维粘连蛋白1表达的影响观察

目的观察姜黄素对人视网膜色素上皮(RPE)细胞中基质金属蛋白酶(MMP)、纤维粘连蛋白1(FN1)表达的影响。方法将人RPE细胞分成2组,姜黄素组加入0.5×10^(-5)mol/L的姜黄素,对照组不加姜黄素,两组细胞继续孵育48 h后,采用实时荧光定量PCR法检测细胞中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、FN1 mRNA,采用Western blotting法检测细胞中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、FN1蛋白。结果姜黄素组细胞中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、FN1 mRNA相对表达量分别为0.41±0.14、5.02±0.22、1.09±0.21、0.47±0.28、2.50±0.21,对照组分别为5.10±0.38、6.43±0.15、0.27±0.19、1.82±0.12、6.83±0.18,两组相比,P均<0.05。姜黄素组细胞中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、FN1蛋白相对表达量分别为6155.33±124.01、6208.00±157.33、8126.33±235.78、3541.67±130.16、3684.33±90.22,对照组分别为16207.33±210.19、8053.33±61.98、2543.67±122.20、9477.33±108.68、8218.00±239.86,两组相比,P均<0.05。结论姜黄素可上调人RPE细胞中MMP1、MMP2、MMP9、FN1的表达,下调MMP3的表达。

黄芪甲苷对人视网膜色素上皮细胞线粒体氧化损伤的调控作用

目的探究黄芪甲苷对H_(2)O_(2)诱导人视网膜上皮细胞(Retinal pigment epithelium,RPE)线粒体氧化损伤的调控作用。方法建立H_(2)O_(2)诱导人RPEARPE-19和hTERT RPE-1氧化损伤模型,并加入不同剂量黄芪甲苷,用CCK-8法检测ARPE-19和hTERT RPE-1细胞增殖活性,用荧光探针标记法检测ARPE-19细胞活性氧(Reactive oxygen,ROS)和脂质过氧化水平,用化学显色法检测ARPE-19细胞内SOD、LDH和MDA水平,用JC-1标记法检测ARPE-19细胞线粒体膜电势,用Calcein AM荧光染色法检测ARPE-19线粒体通透性,用蛋白质免疫印迹实验检测ARPE-19细胞Nrf2表达及磷酸化水平。结果与对照组比较,H_(2)O_(2)模型组ARPE-19和hTERT RPE-1细胞增殖活性明显下降(P<0.05),细胞内ROS积累增加(P<0.05),脂质过氧化水平升高(P<0.05),SOD和LDH表达水平下降(P<0.05),MDA水平升高(P<0.05),线粒体膜电势下降(P<0.05),通透性增加(P<0.05),Nrf2表达水平升高(P<0.05),磷酸化水平增加(P<0.05)。与H_(2)O_(2)模型组比较,低剂量、中剂量和高剂量黄芪甲苷处理的ARPE-19细胞增殖活性明显升高(P<0.05),中剂量和高剂量黄芪甲苷处理的hTERT RPE-1细胞增殖活性明显升高(P<0.05)。ARPE-19细胞内ROS和脂质过氧化水平下降(均P<0.05),SOD和LDH表达水平升高(P<0.05),MDA水平下降(P<0.05),线粒体膜电势升高(P<0.05),通透性降低(P<0.05),Nrf2表达无明显变化(P>0.05),磷酸化水平增加(P<0.05)。结论黄芪甲苷缓解H_(2)O_(2)诱导的人RPE氧化应激和线粒体功能损伤。

黄芪甲苷对甲基乙二醛诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用研究

目的研究黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对甲基乙二醛(MGO)诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用及分子机制。方法利用MGO诱导ARPE-19细胞损伤,CCK-8法检测细胞活力,Hoechst 33342染色法观察细胞核形态,流式细胞仪检测细胞凋亡,试剂盒测定细胞内活性氧(ROS)水平、超氧化物歧化酶(SOD)水平和脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量,JC-1染色法观察线粒体膜电位的变化,Western blot法检测Bcl-2、Bax和PARP蛋白的表达量,荧光酶标法检测caspase家族蛋白caspase-9和caspase-3的活化水平。结果MGO能剂量依赖性地降低ARPE-19的细胞活力,AS-Ⅳ预处理能够明显逆转MGO引起的细胞活力下降(P<0.05),改善细胞核形态,减少细胞凋亡,减少ROS和MDA的产生(P<0.05),增加SOD活力(P<0.05),抑制线粒体膜电位的下降,提高Bcl-2/Bax蛋白表达率(P<0.05)和PARP的表达水平,降低caspase-9和caspase-3的活化水平(P<0.05)。结论 AS-Ⅳ对MGO损伤的ARPE-19细胞有明显的保护作用,其作用机制是提高细胞抗氧化能力,调节线粒体通路蛋白的表达,从而抑制细胞凋亡。

体外原代培养人视网膜色素上皮细胞(英文)

目的:探讨建立体外原代培养人类视网膜色素上皮细胞(RPE)技术。为研究溶血磷脂酸(lysophos-phatidic acid, LPA)对培养的人类视网膜色素上皮细胞DNA合成与增殖的作用。方法:取自愿者贡献的意外事故成年眼球,用2.5g/L胰酶消化获取人RPE细胞、150mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养,细胞接近融合状态时进行传代培养。取自愿者贡献的眼球并游离其视网膜色素上皮细胞,用DMEM加100mL/L血清及MEM氨基酸和庆大霉素,进行细胞传代培养。用溶血磷脂酸、转移因子β2(TGF-β2)及LPA+TGF-β2进行视网膜色素上皮细胞增殖试验,用细胞染色法进行细胞计数,提取视网膜色素上皮细胞DNA,用Spectrophotometer进行DNA定量测定。结果:RPE原代细胞镜下为圆形,大小不一,内含较多的色素颗粒,胞核无法辨认。原代细胞培养贴壁后3d增殖速度明显加快,至4～5d即可基本融合,细胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少。第3代培养的视网膜色素上皮细胞膜表面可见微绒毛,细胞质内细胞器丰富,线粒体量多,体积较小,内外膜分界清晰,嵴较短。色素颗粒散在分布于胞浆内,多数细胞质内数量较少呈高电子密度包含物。LPA对原代培养的视网膜色素上皮细胞增殖有促进作用。含有和/或缺乏10mL/L小牛血清的两种LPA(10μmol/L雪均明显刺激视网膜色素上皮细胞?

机械牵拉对培养人视网膜色素上皮细胞内钙离子的影响

目的:观察培养人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,RPEs)在受机械牵拉力时细胞内Ca^2+的变化。方法:将胶原包被的磁珠悬液加入培养人RPE细胞后孵育,附着磁珠的细胞放置在恒定磁场中,使用钙荧光指示剂fluo-3/AM和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察在机械牵拉作用的前后细胞内钙离子的变化情况。结果:RPE细胞荧光着色很强,遍布整个细胞,其中细胞核比细胞质更强。机械牵拉后荧光强度显著增强,加入氯化锰后迅速降低。EGTA预处理的细胞在受力后荧光强度增加不显著,加入氯化钙后明显增强。细胞松弛素D预处理的细胞在受力后荧光强度比正常组增高2倍以上。结论:机械牵拉能显著增加钙离子内流,并且增加细胞内的钙库释放。钙离子内流可能是RPE细胞损伤前的信号。

笃斯越橘花色苷提取物对光损伤人视网膜色素上皮细胞的保护作用

目的:通过建立人视网膜色素上皮细胞(hRPE)光损伤模型评价笃斯越橘花色苷对眼睛的保护作用及机理。方法:光损伤设置光强、光照时间、后续培养时间3个影响因素,以细胞存活率和乳酸脱氢酶活性评价模型建立情况;根据越橘花色苷提取物的干预方式分为预防组、应激组和修复组,每组设高、中、低3个浓度,检测细胞存活率和血管内皮生长因子(VEGF)水平评价保护效果。结果:选择光照度2500lx,光照24h后培养24h作为最佳造模条件,细胞损伤率达20%;预防组和应激组能有效保护细胞活力(P<0.01),修复组没有效果,各组都能抑制由光损伤诱导hRPE细胞VEGF的过表达,但是不同浓度之间抑制能力有差异。结论:hRPE细胞光损伤程度呈光照强度和光照时间依赖性;越橘花色苷能通过保护hRPE的细胞活力和VEGF的过表达,实现保护眼科健康、预防眼科疾病的作用。

黄芪皂苷通过调控蛋白激酶R样内质网激酶途径抑制高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞自噬的研究

目的:探讨黄芪皂苷通过调控蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)途径影响高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)自噬水平。方法:体外培养人视网膜色素上皮细胞,实验分为正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖),高糖组(30 mmol/L葡萄糖),黄芪皂苷组(30 mmol/L葡萄糖+2.5、5、10μg/mL黄芪皂苷)。噻唑蓝比色(MTT)法检测ARPE-19细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测自噬相关蛋白及PERK途径关键因子表达水平。添加PERK特异性抑制剂GSK2606414,Western blot检测对细胞自噬水平的影响。结果:与正常对照组比较,高糖组ARPE-19细胞活性降低,凋亡率升高,自噬相关蛋白LC3表达水平明显升高,另一自噬相关蛋白p62蛋白表达水平明显降低。PERK途径关键因子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、Perk和增强子结合蛋白的同源蛋白(CHOP)表达水平明显上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。与高糖组比较,黄芪皂苷组ARPE-19细胞活性升高,凋亡率降低,LC3蛋白表达水平明显下调,p62蛋白表达水平明显上调,GRP78、Perk和CHOP蛋白水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。PERK特异性抑制剂GSK2606414能够进一步抑制黄芪皂苷组ARPE-19细胞LC3蛋白表达水平,上调p62蛋白表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:黄芪皂苷能够抑制高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞自噬水平,其作用机制可能与抑制蛋白激酶R样内质网激酶途径有关。

高浓度葡萄糖对培养的人视网膜色素上皮细胞细胞表面黏附分子-1的影响

目的:研究高浓度葡萄糖对体外培养人视网膜色素上皮(RPE)细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法:用免疫荧光法检测5.6mmol/L和30.0mmol/L葡萄糖作用1,2,3d后hRPE细胞表面ICAM-1表达量,MTT方法检测两种浓度葡萄糖作用下48hhRPE表面黏附白细胞的数量。结果:30.0mmol/L葡萄糖作用1,2,3d后hRPE细胞表面荧光着色密度分别为5.6mmol/L葡萄糖作用下荧光着色的2.4,3.8,4.0倍。30.0mmol/L葡萄糖作用48h后hRPE细胞表面黏附的白细胞数量是5.6mmol/L葡萄糖组的2.34倍,有统计学显著性差异(P<0.05)。结论:高糖可以促进体外培养hRPE细胞的ICAM-1表达,提示RPE细胞在高糖作用下可能参与了糖尿病视网膜病变的早期病理反应。

蓝光诱导的人视网膜色素上皮细胞的氧化损伤及其线粒体机制

背景 研究表明,线粒体及氧化应激反应在蓝光导致的视网膜光化学损伤机制中具有重要作用,但蓝光对人视网膜色素上皮（RPE）细胞的损伤与照射时间的关系研究较少. 目的 从供体眼球中分离和培养人RPE细胞,研究蓝光诱导的人RPE细胞氧化损伤的可能机制. 方法 从供体眼球中分离和培养RPE细胞,将培养的细胞分为正常对照组（0h组）、光照0.5、1、2、3、4、5、6、12和24 h组.正常对照组细胞培养在暗环境中且不给予蓝光照射,光照组细胞给予辐射强度为（4.0±0.5） mW/cm2的蓝光照射,按分组分别照射相应时间.采用MTT法检测各组RPE细胞的活性,透射电子显微镜下观察各组细胞超微结构的变化;采用流式细胞术检测RPE细胞中活性氧簇（ROS）的生成量以评价各组细胞的氧化应激反应情况;采用实时荧光定量PCR技术检测RPE细胞线粒体中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）及环氧合酶1（COX1） mRNA的相对表达量,评价RPE细胞中线粒体的功能.结果 正常对照组的细胞存活率为（100.00±20.00）％,光照1、2、3、4、5、6、12、24 h组人PRE细胞存活率分别为（95.73±0.89）％、（94.67±2.56）％、（84.23±0.16）％、（78.57±3.09）％、（75.43±2.18）％、（66.13±1.42）％、（53.43±1.91）％和（47.97±1.36）％,各组细胞存活率的总体比较差异有统计学意义（F=172.270,P=0.000）,其中光照3、4、5、6、12、24 h组细胞存活率与正常对照组比较均显著下降,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.透射电子显微镜下可见光照6、12、24 h组RPE细胞空泡样变、线粒体肿胀、微绒毛减少甚至消失等改变.流式细胞术检测发现,正常对照组、光照0.5、1、2、3、4、5、6h组人RPE细胞中ROS的相对量分别为（14.75±2.49）％、（19.04±1.02）％、（22.81±3.20）％、（28.75±2.15）％、（33.06±0.96）％、（40.64±2.11）％、（48.25±2.50）％和（60.44±2.68％）,其中光照1、2、3、4、5、6h组与正常对照组比较,RPE细胞中ROS的相对量均明显增加,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.光照后3h,随着光照时间的延长,人RPE细胞中NAPDH mRNA的相对表达量较正常对照组逐渐增加,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,COX1 mRNA在光照2、3、4和5h组相对表达量均明显高于正常对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,随后逐渐下降并接近正常值. 结论 蓝光照射3h即可引起RPE细胞中线粒体的氧化损伤,光照5 ～6h细胞损伤更为明显.

微波辐射对培养的人视网膜色素上皮细胞基因转录的影响

目的 研究微波辐射与未辐射人视网膜色素上皮细胞 (h TERT- RPE1)应激和凋亡相关基因转录的差异 .方法 应用基因芯片技术对 2 4 5 0 MHz微波辐射、未辐射的视网膜色素上皮细胞的 m RNA进行检测 .结果 在 10 1条有关应激和凋亡的目的基因中发现有 3条基因转录增加 ,有 2条基因转录降低 .

Genistein对高钾和化学缺氧所致人视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的:研究Genistein(gen)对高钾和化学缺氧所致人视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞损伤的保护作用。方法:采用体外培养人RPE细胞,MTT法测定细胞存活率以及在倒置相差显微镜下观察细胞形态改变。结果:200mmol/LKCl作用12h可降低细胞存活率至(43.97±3.43)%,gen50、100、200μmol/L可明显提高细胞存活率且呈浓度依赖性。相差显微镜观察细胞形态发现,200mmol/LKCl作用2h细胞膜开始皱缩,4h胞膜皱缩更加明显,胞核也开始浓缩,8h后仅见细胞核和断裂呈絮状的细胞膜,12h仅可见固缩的细胞核,而200μmol/Lgen可以减轻细胞损伤,4h后方见细胞膜开始皱缩;CoCl2损伤模型中,500μmol/LCoCl2作用12h可降低细胞存活率至(57.81±17.19)%,gen50、100、200μmol/L时也可浓度依赖性升高细胞存活率。结论:Gen对高钾和化学缺氧所致人RPE细胞损伤具有保护作用。

人视网膜色素上皮细胞在电场中定向移行的实验研究

目的:观察外源性电场对培养人视网膜色素上皮humanretinalpigmentepithelial,hRPE)细胞移行方向及细胞内肌动蛋白表达的影响。方法:培养于DMEM+100g/LFBS的hRPE细胞暴露于强度为6V/cm的电场中,未暴露于电场的细胞作为对照。观察并记录2h中每隔15min细胞移行的变化图像,测量细胞移行距离、细胞移行方向及其与场线间夹角。2h后采用间接免疫荧光法检测实验组与对照组细胞内肌动蛋白表达情况。SPSS10.0及Image-ProPlus5.0软件处理结果。结果:未暴露于电场中的hRPE细胞在观察期间呈无序移行,2h后细胞分布未见特殊变化,细胞内肌动蛋白有弱阳性表达。细胞暴露于电场30min后开始出现阴极方向的移行趋势,大部分细胞长轴趋向垂直于场线方向排列。细胞的移行表现为移行速度和移行方向的一致性均随时间延长而增加(P<0.05)。暴露于电场2h后,大部分细胞内肌动蛋白表达阳性,且多集中分布于细胞质内朝向电场阴极一侧。结论:外加电场可诱导hRPE细胞向电场阴极方向定向移行,同时伴有细胞内肌动蛋白阳性表达及定向分布。电场对细胞的作用与暴露时间成正相关。视网膜脱离后的内源性电场的存在可能参与并诱导了RPE细胞的定向移行。

高糖联合低氧对体外培养的人视网膜色素上皮细胞HIF-1ɑ及VEGF表达的影响

目的探讨高糖及高糖联合低氧对体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-lα,HIF-1α)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法通过使用化学低氧诱导剂CoCl2模拟RPE细胞低氧环境,研究RPE细胞分别在5.56 mmol/L葡萄糖(对照组)5、.56 mmol/L葡萄糖+150μmol/L CoCl2(低氧组)、25 mmol/L葡萄糖(高糖组)以及25 mmol/L葡萄糖+150μmol/L CoCl2(联合组)的培养条件下,通过反转录PCR检测HIF-1α及VEGF mRNA的表达,Western blot分析检测HIF-1α及VEGF蛋白水平。结果与对照组比较,高糖组RPE细胞HIF-1αmRNA表达无显著性差异,而高糖组可检测出微量的HIF-1α蛋白,对照组未能检测出HIF-1α蛋白;且高糖组VEGF mRNA表达和蛋白合成均增加(均P<0.05)。与低氧组比较,联合组RPE细胞HIF-1αmRNA表达无显著性差异,但HIF-1α蛋白水平明显高于低氧组(P<0.05);同时VEGF mRNA表达和蛋白合成也均明显增加(均P<0.05)。结论高糖对体外培养的人RPE细胞HIF-1α的影响是促进蛋白的合成,且对HIF-1α蛋白有一定的稳定作用,在联合低氧条件下高糖促进合成的HIF-1α蛋白更加稳定,同时也促进VEGF的表达增加。

高糖对体外培养的人视网膜色素上皮细胞HSP47表达的影响

目的探讨高浓度葡萄糖对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞热休克蛋白47(HSP47)表达的影响。方法RPE细胞分别在5.56mmol/L葡萄糖(对照组)以及25mmol/L葡萄糖(高糖组)的培养条件下,通过RT-PCR检测HSP47mRNA的表达,使用Western blot检测其蛋白水平。结果高糖条件下,HSP47mRNA表达水平显著增加(P<0.05),蛋白水平亦显著增加(P<0.05)。结论HSP47作为一种胶原特异的分子伴侣,在高糖条件下RPE细胞内表达的增加可能是导致增生型糖尿病视网膜病变(PDR)发展的重要因素之一。

金雀异黄素抑制氯化钴诱导的人视网膜色素上皮细胞缺氧诱导因子1α表达的研究

目的 :研究氯化钴 (CoCl2 )诱导体外培养的人视网膜色素上皮 (RPE)细胞缺氧诱导因子 1α(HIF 1α)的表达以及金雀异黄素 (Gen)对其表达的影响。 方法 :采用免疫组化和激光共聚焦显微镜研究HIF 1α的表达。 结果 :CoCl2 可明显诱导人RPE细胞HIF 1α的表达 ,0 .5h达高峰 ,随后逐渐下降。Gen可呈浓度依赖性地抑制氯化钴诱导的HIF 1α蛋白表达。 结论 :Gen可抑制CoCl2 诱导的人RPE细胞HIF