人诱导多能干细胞用于心血管疾病治疗的研究进展

现阶段中国心血管疾病高发,传统治疗方式包括药物缓解和介入手术治疗,仅减缓疾病进展而无法逆转已存在的组织损伤,其治疗周期长、患者医从性低。故急需对此类疾病进行更深入的研究,以提出更有效的治疗方案,因此人诱导多能干细胞作为新的突破口为疾病治疗提供了思路。人诱导多能干细胞不仅可直接替代和间接修复受损的细胞,补偿心脏收缩功能;还能通过构建特定的疾病模型来作为个体基因组学、蛋白组学的研究平台,从而深入剖析疾病的机制与进程,实现疾病个体化预测、预防和治疗,达到提高患者心脏泵血功能、延长生存期限的最终目的。现对人诱导多能干细胞用于心血管疾病治疗做一综述。

毛蕊异黄酮对人诱导多能干细胞内皮分化的影响及机制

背景:内皮损伤是心血管疾病的诱因之一,人诱导多能干细胞易于获得、分化能力强、排异性较小,其内皮分化细胞可被用作心血管疾病研究的理想细胞。目的:探讨毛蕊异黄酮对人诱导多能干细胞定向内皮分化的作用及机制,为微血管再生提供技术支持。方法:将人诱导多能干细胞分为对照组与毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组,进行内皮定向诱导分化。诱导分化8 d后,采用流式细胞术检测各组细胞内皮细胞标志物CD144阳性率,免疫荧光技术检测CD144、CD31荧光表达。利用慢病毒RNAi-GFP puromycin沉默人诱导多能干细胞Piezo1 mRNA,再进行内皮定向诱导分化,诱导分化8 d后,采用流式细胞术检测分化细胞CD144阳性率,qPCR检测CD144、Piezo1、MEK的mRNA表达水平。结果与结论:①与对照组相比,毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组CD144阳性率显著升高(P<0.05);毛蕊异黄酮2.5μg/mL组CD144、Piezo1、MEK mRNA表达水平提高(P<0.05);毛蕊异黄酮2.5μg/mL组CD144(P<0.01)和CD31(P<0.001)荧光表达显著升高;②与shNT组相比,shNT+毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组CD144阳性率和CD144、Piezo1、MEK mRNA表达显著升高(P<0.05),与shPiezo1组相比,shPiezo1+毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组CD144阳性率和CD144、Piezo1、MEK mRNA表达无显著变化(P>0.05);③实验结果提示2.5μg/mL毛蕊异黄酮能够促进人诱导多能干细胞内皮分化,毛蕊异黄酮可以通过靶向调节Piezo1表达水平,促进下游MEK表达,从而促进人诱导多能干细胞内皮分化。

人诱导多能干细胞来源功能性胰岛β细胞的体外定向分化方法的建立

1型糖尿病是由胰岛β细胞功能受损、胰岛素分泌不足所致,目前,主要通过外源性胰岛素补充来治疗,但外源性胰岛素无法精准调控血糖,严重低血糖可危及生命。胰岛移植是一种替代疗法,但面临器官供体不足和异种来源胰岛β细胞存在人畜共患病交叉感染风险的问题。因此,获得足量且安全的胰岛β细胞是1型糖尿病细胞治疗面临的难题。本研究旨在通过人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)在体外向胰岛β细胞分化,提供一种潜在的1型糖尿病治疗新策略。为实现这一目标,我们采用了结合2D和3D培养系统的分化策略,模拟胰岛β细胞的体内发育环境,并使用多种生长因子调节在胰腺发育和β细胞分化中发挥重要作用的关键信号包括Notch信号通路(Notch signaling pathway)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)、TGF-β/Smad信号通路(TGF-β/Smad signaling pathway)等,在体外将hiPSC定向诱导分化至胰岛β细胞。结果显示,在2D、3D结合的培养条件下,分化过程中定型内胚层细胞,胰腺祖细胞,胰腺内分泌细胞及胰岛β细胞阶段的特异性基因的表达显著提高(P<0.05),并在胰岛素含量及葡萄糖刺激后表现出显著增强的胰岛素分泌能力(P<0.05)。总之,本研究成功建立了一种从hiPSC到功能性胰岛β细胞的分化策略,为1型糖尿病提供了一种新的细胞治疗途径。这种方法不仅为研究胰岛β细胞的发育生物学提供了新的工具,也为临床应用提供了一种潜在的胰岛β细胞来源,有望解决现有治疗方法的局限性。

人诱导多能干细胞成骨分化的研究进展

骨骼疾病如骨质疏松、骨关节炎等已成为亟待解决的人类健康问题,细胞治疗及组织工程技术被认为是理想的治疗方法之一。人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)具备体外长期自我更新和分化所有三胚层来源体细胞的独特功能,已成为目前最有前景的成骨细胞来源。因此,需要构建成分明确的hiPSCs体外成骨向诱导分化体系,获得符合临床应用要求的成骨样细胞。许多团队在促进hiPSCs向成骨分化成熟的直接路径和经间充质干细胞的间接路径方面取得了实质性的进展,本文针对这两类成骨分化路径及其应用现状进行综述,以期为骨再生技术提供参考。现有研究借助拟胚体法和单层诱导法,基于生物材料,构建可支持hiPSCs体外培养和成骨向诱导分化体系。然而,目前的研究主要存在成分不明确,分化效率低等局限,基于特定化合物严格调控的分阶段式和三维定向诱导体系是未来的主要研究方向。

Rho激酶抑制剂Y27632促进人诱导多能干细胞来源原始神经上皮细胞向多巴胺能神经前体细胞的转化

目的提高人诱导多能干细胞来源原始神经上皮细胞(hiPSCs-NECs)定向诱导中脑多巴胺能神经前体细胞(DAPs)的效率。方法将人iPSCs在含有小分子组合[DMH1(10μmol/L)、SB431542(10μmol/L)、音猬因子(SHH 200 ng/mL)、成纤维细胞生长因8(FGF8100 ng/mL)、嘌吗啡胺(2μmol/L)、CHIR99021(3μmol/L)、N2(1%)]的mTeSRTM培养基中诱导至12 d,细胞分化为原始神经上皮细胞(NECs)。特异性诱导DAPs,将诱导的hiPSCs-NECs用胶原酶IV消化后,在神经分化培养基[添加1%N2、2%B27-A、BDNF(10 ng/mL)、GDNF(10 ng/mL)、AA、TGF-β、cAMP、1%GlutaMax]中加入不同浓度的Rho激酶抑制剂Y27632重新接种,并于次日更换培养基去除Y27632,持续诱导至第28天获得DAPs。结果人iPSCs可在基质胶上稳定传代,表达多潜能性标记物OCT4、SOX2、Nanog和SSEA1,且碱性磷酸酶染色呈阳性。诱导分化至第13天获得hiPSCs-NECs,形成玫瑰花结样结构,能够表达特征性标记物(SOX2、Nestin和PAX6)。将hiPSCs-NECs消化后,添加5μmol/LY27632的hiPSCs-NECs相比较未加Y27632的对照组,细胞解离后贴壁存活率明显增加,处于S期的细胞(P<0.01)与细胞活力显著提高(P<0.01),且凋亡率显著降低(P<0.05),持续诱导至第28天,细胞高表达DAPs特异性的标记物(TH、FOXA2、NURR1和Tuj1)。结论添加Y27632(5μmol/L)24 h可显著提高人iPSCs-NECs细胞向iPSCs-DA神经前体转化时的细胞存活率,并且Y27632去除后,不会影响后续向DA神经前体细胞分化,间接的提高了细胞的分化效率.

建立并鉴定一种基于人诱导多能干细胞的肝脏细胞定向分化实验方案

背景:人诱导多能干细胞是一种与胚胎干细胞特性高度类似的多能干细胞类型,具备三胚层分化潜能和持续自我更新能力。将人诱导多能干细胞定向分化成具备功能的肝脏细胞对临床肝脏替代治疗意义重大。目的:建立一种高效的基于人诱导多能干细胞的肝脏细胞定向分化实验方案。方法:利用明场显微镜、免疫荧光对人诱导多能干细胞特性进行鉴定。通过转录因子重组蛋白手段时序性调控不同信号通路,即在第0,5,10,15天顺序加入激活素A、成纤维细胞生长因子4/骨形态发生蛋白4、肝细胞生长因子、肿瘤抑制因子M,使多能干细胞经历终末内皮层、肝内胚层、肝母细胞(肝脏前体细胞)最终分化成为有功能的肝脏细胞。利用明场显微镜、实时定量PCR(qPCR)、ELISA动态观察不同阶段形态特征和分子标记物。结果与结论:①所使用的人诱导多能干细胞具备经典的诱导多能干细胞形态特征并且高表达诱导多能干细胞特异标记蛋白(SSEA4、SOX2、OCT4);②人诱导多能干细胞发生了终末内胚层、幼稚肝细胞、肝脏细胞不同阶段形态转变;③qPCR结果显示,随着肝细胞分化进展,诱导多能干细胞特异标记物(OCT4)显著下调,终末内胚层(GCS、CXCR4)和肝脏内胚层标记物(HNF4α、HNF1β)则呈现先升高再下调趋势,而肝脏细胞标记物(CYP34A、ALB)则呈现出逐渐递增趋势;④ELISA结果进一步显示,诱导15 d以后的肝脏细胞开始具备肝特异蛋白(白蛋白、尿素)分泌功能,并且随着时间延长其分泌功能进一步增加;⑤上述结果提示,成功建立人诱导多能干细胞向肝脏细胞定向分化的实验方案,为未来临床肝脏细胞替代治疗提供实验基础。

一种人诱导多能干细胞向内皮细胞定向分化方案的建立及鉴定

背景:人诱导多能干细胞是一种与胚胎干细胞性状高度类似的多能干细胞,其具备三胚层分化潜能和持续自我更新能力,因此能够为临床细胞替代治疗提供足量目的细胞。目的:构建并鉴定一种高效的基于人诱导多能干细胞的内皮细胞定向分化实验方案。方法:采用免疫荧光技术对人诱导多能干细胞干性和增殖活性进行鉴定。采用转录因子重组蛋白和小分子化合物时序性调控系列信号通路,即在第0,1,2,5天顺序加入激活素A、GSK通路抑制剂CHIR99021/骨形态发生蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子/血管内皮生长因子/骨形态发生蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子/血管内皮生长因子/CHIR99021,人诱导多能干细胞经历心脏中胚层、内皮前体细胞命运转变并最终分化成为有功能的内皮细胞。采用明场显微镜、实时定量PCR、免疫荧光动态观察不同阶段细胞形态特征和分子标记物,采用血管成环实验验证内皮细胞的体外血管形成功能。结果与结论:(1)人诱导多能干细胞内源性高表达诱导多能干细胞干性特异标记物(OCT4、NANOG、SSEA4)和增殖标记物(Ki67);(2)开始分化后的人诱导多能干细胞经历了诱导多能干细胞、心脏中胚层、内皮前体细胞、内皮细胞等阶段显著的形态改变;(3)qPCR结果显示,随着分化进展,内皮前体细胞标记物(KDR、CD34)呈现先升高再下调趋势,而内皮细胞标记物(VE-CADHERIN、ICAM1、PECAM1)则呈现出逐渐递增趋势,免疫荧光在蛋白水平进一步证实了内皮细胞标记物的表达递增趋势;(4)血管成环实验显示,内皮细胞血管形成数量随血管内皮生长因子质量浓度增加而增多;(5)综上提示:成功建立了人诱导多能干细胞定向分化内皮细胞的实验方案,有望为未来血管构建提供细胞基础和实验依据。

机械牵张对人诱导多能干细胞分化来源的心肌细胞成熟的影响

目的通过使用标准的化学定义和基于小分子诱导方案(chemically defined medium,3 components,CDM3)获得人诱导多能干细胞分化来源的心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs),进一步对其施加机械牵张,探讨机械牵张对hiPSC-CMs成熟的影响及潜在机制。方法复苏、培养和鉴定hiPSCs后,将hiPSCs接种到覆有基质胶的传统培养皿上。24 h后在荧光显微镜下通过DAPI荧光观察细胞生长情况,并通过八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)荧光进行hiPSCs干性鉴定,在细胞汇合度达到80%时更换CDM3分化培养基,分化6 d后将获得的hiPSC-CMs分为对照组和机械牵张组,拉伸结束后重新种板培养24 h后在荧光显微镜下通过DAPI荧光观察细胞生长情况,通过心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)和肌球蛋白轻链2V(myosin light chain 2V,MLC2V)荧光进行hiPSC-CMs心肌细胞标志物鉴定,Piezo1荧光进行潜在机制研究。结果hiPSCs培养24 h免疫荧光显示:OCT4发出绿色荧光,hiPSCs保持干性。DAPI发出蓝色荧光:细胞呈克隆生长,细胞形态均一。机械牵张结束后重新种板培养,24 h后免疫荧光显示机械牵张组较对照组心肌标志物cTnT和MLC2V表达增高(P<0.05);机械牵张组较对照组机械敏感型离子通道Piezo1蛋白表达增高(P<0.05)。结论机械牵张可以促进人诱导多能干细胞分化来源心肌细胞的成熟,这可能与Piezo1蛋白表达增高有关。

人诱导多能干细胞体外定向分化为多巴胺能神经元祖细胞

目的 探讨人诱导多能干细胞(hiPSCs)体外高效定向分化为中脑多巴胺能神经元祖细胞(DAPs)的方法体系。方法 人iPSCs诱导分化为DAPs遵循两个主要阶段,第1阶段是化学诱导产生中间态细胞,人i PSCs在含小分子化合物组合的神经诱导培养基中培养至第13天,其表观特征类似于原始神经上皮细胞。第2阶段,特异性诱导DAPs,将中间态细胞在神经分化培养基中诱导至第28天获得DAPs。CM-DiI染色后,定向移植帕金森(PD)大鼠模型右前脑内侧束(MFB),实验动物随机分为3组:健康对照组,模型组和DAPs移植组。移植后2周的大鼠全脑冷冻切片免疫荧光检测移植细胞在宿主脑内微环境中存活、迁移及分化状况,移植后8周,对细胞移植组PD大鼠进行行为学鉴定。结果 人iPSCs可在基质胶上稳定传代,具有正常的二倍体核型,表达多潜能性标记物OCT4、SOX2和Nanog,且碱性磷酸酶染色呈阳性。诱导分化至第13天获得原始神经上皮细胞形成玫瑰花结样结构,且能够表达其表面特征性标记物(SOX2、Nestin和PAX6,91.3%~92.8%)。诱导至第28天的DAPs高表达其特异性的标记物(TH、FOXA2、LMX1A和NURR1,93.3%~96.7%)。而且,DAPs移植PD大鼠脑内2周后,可分化为TH^(+),FOXA2^(+)与Tuj1^(+)神经元,移植后8周,移植组较模型组相比,经水迷宫实验(P<0.0001)和阿扑吗啡(APO)诱导的旋转实验(P<0.0001)检测,PD大鼠的运动功能得到明显改善。结论 人iPSCs经多级诱导可高效分化为中脑DA能神经元祖细胞,具备体内和体外分化为功能神经元与胶质细胞的潜能,并可显著改善PD大鼠的运动功能障碍,为hiPSCs-DAPs移植治疗神经系统损伤疾病奠定细胞基础和实验依据。

利用人诱导多能干细胞分化的心肌细胞评价莫西沙星和左氧氟沙星与抗心律失常药物联用的心脏毒性风险

目的利用人诱导多能干细胞分化的心肌细胞和实时细胞分析系统评价喹诺酮类抗生素莫西沙星和左氧氟沙星与抗心律失常药物奎尼丁、普鲁卡因胺和胺碘酮联用的心脏毒性风险。方法人诱导多能干细胞分化的心肌细胞接种于实时细胞分析系统Cardio E-Plate 96孔板并给予不同浓度的莫西沙星、左氧氟沙星、奎尼丁、普鲁卡因胺和胺碘酮,根据人诱导多能干细胞分化的心肌细胞的标准化细胞指数及标准化搏动频率筛选毒性浓度。以莫西沙星和左氧氟沙星最高无毒性浓度和最低有毒性浓度预处理24 h后,分别给予不同浓度的奎尼丁、普鲁卡因胺和胺碘酮,比较各组间标准化细胞指数的差异。结果莫西沙星、左氧氟沙星、奎尼丁、普鲁卡因胺和胺碘酮均可诱导标准化细胞指数降低(P<0.05)。莫西沙星与奎尼丁或普鲁卡因胺联合给药后可导致标准化细胞指数降低(P<0.05);左氧氟沙星与胺碘酮联合给药后可导致标准化细胞指数降低(P<0.05)。结论莫西沙星和左氧氟沙星与抗心律失常药物联用后可增加心脏毒性风险,基于人诱导多能干细胞分化的心肌细胞和实时细胞分析系统的体外评价模型在药物心脏毒性预测上具有应用前景。

人诱导多能干细胞自然分化过程中EMT变化研究

目的研究人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)自然分化过程中上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的变化过程。方法按常规方法 iPS细胞接种于单层饲养层细胞上培养并传代,通过EB的方式令iPS细胞自然分化,收集未分化的iPS细胞以及分化7d、14d、21d和28d的细胞,采用RT-PCR和Western Blot方法检测EMT相关基因及蛋白的表达水平。结果 RT-PCR和Western Blot结果表明,未分化人iPS细胞可见E-cadherin基因和蛋白的表达,分化后E-cadherin的表达明显减少,而N-cadherin基因和蛋白在细胞未分化时均未见表达,发生分化后表达明显上调;在人iPS细胞分化过程中,Snail和Slug转录因子以及蛋白都明显发生上调。结论人iPS细胞自然分化与EMT,即E-cadherin和N-cadherin转化有关。

非集落样、分散的人诱导多能干细胞可分化为球型可移植的功能性视网膜色素上皮细胞

目的:从人诱导多能干细胞(hiPSC)分化而来的视网膜色素上皮(RPE)细胞在治疗视网膜退行性疾病方面有很大的前景。本研究将探讨非集落样、分散的hiPSC分化为功能性RPE细胞(hiPSC-RPE细胞)的可能性,并提供一种基于细胞球的可选移植方法。方法:通过RT-PCR、免疫荧光和流式细胞术分析鉴定hiPSC-RPE。通过荧光素渗漏实验、跨上皮电阻测定、原子力显微镜观察、光感受器外节段吞噬实验、冰冻切片、死/活细胞染色、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色和免疫组化实验评估hiPSC-RPE的体内和体外功能。结果:hiPSC-RPE细胞阳性表达RPE细胞的生物标志物但不表达iPSC的生物标志物,例如CRALBP(97.4%)、EMMPRIN(93.8%)、Oct4(2.1%)和Sox2(2.0%)。hiPSC-RPE细胞表现出与RPE细胞一样的特性,包括屏障功能、吞噬活性和极性膜。hiPSC-RPE成球处理后细胞阳性表达nestin,并且SA-β-Gal染色减少(P<0.01)。hiPSC-RPE细胞球在脱细胞基质角膜上培养能形成单层。在碘酸钠诱导的RPE退化的青紫蓝兔视网膜下腔移植1个月,hiPSC-RPE细胞球能存活下来,并维持部分片状结构生长。结论:非集落样、分散的hiPSC能有效分化为功能性RPE细胞,而且移植后的hiPSC-RPE细胞球能在RPE退化的青紫蓝兔视网膜下腔维持部分片状结构生长。本研究可能为未来治疗RPE退行性疾病提供一种可选的细胞球移植方法。

特异性诱导人诱导多能干细胞向滋养层细胞分化

目的:通过反转录病毒转染技术成功建立了人诱导分化多能干细胞系(induced pluripotency stem cell,iPSC),并诱导它们向滋养层细胞定向分化,为研究人早期滋养层细胞的发育建立一种新的模型。方法:采用反转录病毒将八聚体结合转录因子-4(octamer-binding transcription factor-4,OCT4)、性别决定Y区域转录因子2[sex determining region Y(SRY)-box2,SOX2]、原癌基因c-Myc和Kruppel样因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4)转染到人肺部成纤维细胞中,经过筛选得到重编程后的人iPSC,然后用骨成型蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)将其诱导成为滋养层细胞。结果:通过该病毒转染体系成功获得iPSC,具有与人胚干细胞(human embryonic stem cell,hESC)相似的形态学及多向分化潜能,并成功将其诱导分化成为滋养层细胞。结论:通过重编程技术成功建立人iPSC细胞系,并具备与hESC相似的干细胞特性,为进一步研究胚胎早期滋养层细胞发育以及滋养层细胞恶性肿瘤的发生机制提供了一个新的平台。

特异性诱导人诱导多能干细胞向神经上皮细胞分化

目的:通过慢病毒转染技术成功建立了人诱导分化多能干细胞系(induced pluripotent stem cell,iPSC)并诱导它们向神经上皮细胞(neuroepithelial cells,NECs)定向分化,为研究人胚胎早期神经发育建立一种新的模型,并有望为临床神经系统病变的治疗提供一种新的移植选择。方法:采用慢病毒将转录因子八聚体结合转录因子-4(octamer-binding transcription factor-4,OCT4)、性别决定Y区域转录因子2[sex determining region Y(SRY)-box 2,SOX2]、Nanog同源盒(Nanog homebox,NANOG)、Lin-28同源因子(Lin-28 homolog,LIN28)、原癌基因c-Myc和Kruppel样因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4)导入到人胎肺成纤维细胞中,经过筛选得到重编程后的人iPSC,并在体外通过加入数种生长因子将其诱导成为NECs。结果:成功获得与成纤维细胞相同遗传背景的iPSC,具有与人胚干细胞(human embryonic stem cell,hESC)相似的形态学及多向分化潜能,且能在体外被诱导分化成为NECs,分化效率与hESC相似。结论:通过重编程技术成功建立人iPSC并将其定向诱导分化为NECs,为iPSC在神经系统疾病特别是遗传性或退行性神经病变的治疗和机制研究中的应用推广奠定了实验基础。

基于基因编辑技术的DMD人诱导多能干细胞模型构建

目的采用CRISPR/Cas9技术,构建杜氏进行性肌营养不良(DMD)大片段缺失的人诱导多能干细胞(hiPSCs)模型。方法采用电转质粒的方式,在正常的hiPSCs上用双sgRNA切割方案,切除dystrophin基因的52号外显子。结果T7E1分析显示,所选sgRNA切割效率最高可达91%,后续基因型鉴定显示成功获得了52号外显子切除的hiPSCs细胞系。结论基因编辑构建的hiPSCs模型可以作为后续DMD基因编辑治疗研究的体外细胞模型。

氯化铯增加人诱导多能干细胞来源心肌细胞自发动作电位的节律性

目的探讨氯化铯对人诱导多能干细胞来源心肌细胞自发动作电位以及起搏电流的影响。方法利用CHIR99021和IWP-2小分子在体外将人诱导多能干细胞分化为心肌细胞。通过免疫荧光和动作电位测定对转化心肌细胞进行形态学和电生理鉴定。利用膜片钳系统记录氯化铯对培养60 d人诱导多能干细胞来源心肌细胞自发动作电位及起搏电流的影响。结果免疫荧光显示人诱导多能干细胞来源心肌细胞高表达心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)心肌标志物,电生理鉴定提示其具有自发动作电位,2 mM氯化铯增快自发动作电位的频率(P=0.003,n=5)。2 mM氯化铯提高动作电位的静息电位(P<0.001,n=5),提高动作电位的阈电位(P<0.001,n=5),降低动作电位的振幅(P=0.002,n=5),缩短动作电位复极90%(APD90)的时间(P<0.001,n=5)。2 mM氯化铯抑制人诱导多能干细胞来源心肌细胞起搏电流的平台期电流以及尾电流有统计学意义(P<0.05,n=5)。结论氯化铯增加人诱导多能干细胞来源心肌细胞自发动作电位的自发节律性,并抑制其起搏电流。

人诱导多能干细胞向外周神经元分化的实验研究

【目的】探讨人诱导多能干细胞(hiPS细胞)在体外向外周神经元分化的能力。【方法】人诱导多能干细胞在无饲养层培养条件下维持培养,然后在神经培养基中悬浮培养分化为神经球,通过把神经球贴壁在多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的培养板上,利用流式分选细胞方法获得神经嵴干细胞(NCSC),通过把神经嵴干细胞在外周神经诱导培养基中诱导分化,获得外周神经元,利用免疫荧光染色的方法检测神经嵴干细胞和外周神经元的标记物。【结果】贴壁的神经球出现特征性的神经花环(Neural rosettes)结构,神经嵴干细胞从神经花环发生迁移;神经嵴干细胞向外周神经元诱导后出现神经丝结构,并表达外周神经元特异性标记物。【结论】人诱导多能干细胞在体外能高效向外周神经元分化。

麻黄碱及阿托品对人诱导多能干细胞来源心肌细胞动作电位的影响

目的探讨麻黄碱及阿托品对人诱导多能干细胞来源心肌细胞动作电位的影响,为人诱导多能干细胞来源心肌细胞的临床应用提供依据。方法利用免疫荧光鉴定人诱导多能干细胞多能性,并利用CHIR99021及IWP-2小分子在体外将其分化为心肌细胞。利用免疫荧光及膜片钳对获得的心肌细胞进行形态学及电生理鉴定。随后通过灌流系统添加500μmol/L麻黄碱及100μmol/L阿托品,并用膜片钳记录动作电位的变化。结果人诱导多能干细胞高表达多能性标志物oct4、sox2、nanog及tra-1-60。分化得到的心肌细胞高表达ctnt、α-actinin、mlc2v等心肌特异性标志物,同时具有自发节律的动作电位。麻黄碱及阿托品能够显著加快自发动作电位的频率,但对动作电位去极化幅度、最大去极化速率及90%动作电位时程无明显影响。结论麻黄碱及阿托品能够加快人诱导多能干细胞来源心肌细胞自发动作电位的频率,证明其具有良好的药物反应性。

低氧环境可体外促进人诱导多能干细胞分化为拟胚体

目的探讨人诱导多能干细胞向拟胚体分化过程中,生理性低氧环境在拟胚体悬浮和贴壁阶段的影响及其相关机制。方法本研究中拟胚体悬浮阶段分为悬浮常氧组(21%O_(2))和悬浮低氧组(5%O_(2)),贴壁阶段分为贴壁常氧组(21%O_(2))、贴壁低氧组(5%O_(2))、贴壁低氧组+HIF-1α抑制剂Echinomycin。首先采用免疫荧光法鉴定人诱导多能干细胞的多能性,人诱导多能干细胞消化后分别在21%氧气和5%氧气条件下悬浮培养5 d,利用显微镜观察悬浮阶段拟胚体的形成和形态变化,5 d后检测拟胚体中三胚层标记基因的表达情况。接着分别取等量的拟胚体接种到明胶包被的培养皿,继续在21%和5%氧气条件下培养2 d,观察贴壁阶段拟胚体的粘附性能和粘附后向外周扩增速度的差异,检测低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的表达情况,随后在5%氧气条件下使用HIF-1α特异性抑制剂Echinomycin后,再次检测低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的表达情况。结果常氧组和低氧组的拟胚体均具有三胚层分化的潜力。与常氧培养组相比,低氧组悬浮拟胚体周围的凋亡碎片明显减少,且较早出现囊性拟胚体,获得的拟胚体大小更加均匀一致。此外,低氧组的拟胚体贴壁数量明显高于常氧组(P<0.05),拟胚体贴壁后向外生长的速度明显快于常氧组(P<0.05)。低氧组HIF-1α的mRNA未显著上调(P>0.05),而β-catenin和VEGFA的mRNA显著上调(P<0.05);在蛋白质水平,低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的表达均上调(P<0.05)。低氧组使用HIF-1α特异性抑制剂Echinomycin后,低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的蛋白质表达均下调(P<0.05)。结论低氧条件不影响拟胚体的三胚层分化潜力。生理性低氧可以促进悬浮拟胚体的形成和成熟,并且能增强拟胚体的贴壁和贴壁后增殖性能,初步证实通过激活HIF-1α/β-catenin/VEGFA信号通路,提升人诱导多能干细胞的分化能力。

不同打靶位点影响人诱导多能干细胞MYO7A杂合突变位点的基因校正中CRISPR/Cas9介导的同源重组效率

应用CRISPR-Cas9系统对人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)进行基因编辑,为疾病模型的建立、致病机制研究、药物筛选及基因校正治疗疾病提供了更广阔的平台。相对于CRISPR-Cas9介导的基因敲除,应用该系统介导的同源重组实现基因点突变或突变校正效率要低、且难度偏大。为了实现对MYO7A杂合点突变(c.4118C>T)的人i PSCs的点突变校正,本文构建了表达maxGFP的pX330质粒。针对需校正的突变位点,设计5组识别序列并连接到maxGFP-pX330中构建靶向质粒。将5组打靶质粒分别转染HEK 293FT细胞48 h,细胞表达GFP;测序结果显示,MYO7A基因相应位点出现杂峰,表明打靶质粒具有打断活性。将同源模版单链寡核苷酸链(single-stranded DNA oligonucleotides,ss ODN)与打靶质粒共同电转入人i PSCs后48 h,经流式分选出(5. 8±2. 2)%的细胞表达GFP。分选后细胞行单克隆扩增并测序。结果显示,打靶质粒1和ss ODN组合对点突变校正未成功;打靶质粒2、3、4、5与ss ODN组合均获得了校正后的细胞株。本研究表明,打断位点是影响同源重组校正效率的关键因素。当应用CRISPR/Cas9(或其它核酸酶)介导的同源重组进行基因编辑操作时,可以同时选择多个打靶位点造成基因组不同位置上的双链打断(double-stranded break,DSB)位点,以获得目的单克隆细胞株。本研究为应用CRISPR-Cas9系统对人诱导多能干细胞进行基因编辑提供了有力参考。