伏马菌素B_(1)脱毒研究进展

伏马菌素B_(1)(FB_(1))是由镰刀菌产生的水溶性代谢产物,存在于镰刀菌污染了的谷物、油料作物、坚果、饲草和饲料中,是常见的真菌毒素之一。FB_(1)会对神经系统、呼吸系统、消化系统和生殖系统产生不同毒性作用,给农牧业造成不可估量的经济损失。如何对FB_(1)进行脱毒,以降低其毒性作用,是目前研究的热点。因此,本文对FB_(1)的物理脱毒、化学脱毒、生物脱毒及其应用进行综述,重点对常用于FB_(1)生物脱毒的菌株和酶及其脱毒效果、脱毒机制进行了深入探讨,以期为提高FB_(1)脱毒效率和开发新的FB_(1)脱毒方法提供参考和思路。

树突状细胞的力学免疫学角度探究伏马菌素B1的免疫毒性机制

目的伏马菌素B1(fumonisin B1,FB1)是一种具有免疫毒性的真菌毒素,树突状细胞(dendritic cells,DCs)在免疫调控中起着关键作用,本研究通过研究FB1对m DCs的生物力学特性和免疫功能的影响,从力学免疫学角度探究免疫抑制作用的机制。方法分离鼠源骨髓细胞并诱导为m DCs,采用细胞凋亡检测试剂盒检测不同浓度FB1对m DCs凋亡的影响;利用50μmol/L FB1处理m DCs后,检测m DCs的电泳率、膜流动性,原子力显微镜检测m DCs的杨氏模量,Transwall系统观察m DCs的迁移能力;激光共聚焦显微镜观察细胞形态和骨架结构变化,实时荧光定量PCR检测m DCs表面分子及细胞骨架结合蛋白基因的转录水平,混合T淋巴细胞反应检测m DCs的抗原提呈能力,流式细胞术检测m DCs表面分子的表达水平,Western blot分析Rho/ROCK/LIMK/Cofilin信号通路相关蛋白及磷酸化水平的变化。结果FB1处理m DCs后未发生凋亡,电泳率、膜流动性、杨氏模量、趋化迁移和抗原提呈能力均被抑制;细胞体积变大、丝状伪足变短,细胞骨架结构发生显著变化,细胞骨架相关蛋白Cofilin、Cap Z、Apr2/3 complex的m RNA表达水平降低;细胞骨架相关蛋白Rho和ROCK1的表达下降,Cofilin的蛋白磷酸化水平增加。结论FB1显著抑制m DCs的生物力学特性、迁移能。

玉米制品中伏马菌素污染情况调查研究

伏马菌素污染在世界范围内普遍存在,主要污染粮食及制品,特别是对玉米及其制品影响最大。为掌握并了解我国玉米制品伏马菌素污染状况,从东北、西北、南部、华北、华南、中部等6个地区12个省(区、市)采集样品120份检测伏马菌素。结果显示,34份玉米制品检出了伏马菌素,总检出率为28.3%;各省(区、市)玉米制品伏马菌素检出率不同,山东省检出率最高(70.0%);来自山东省、陕西省、辽宁省的5份玉米制品中伏马菌素含量高于2000μg·kg^(-1);34份含伏马菌素的样品中,74%的玉米制品中同时检出了多种真菌毒素。

基于磁性纳米颗粒伏马菌素B双探针竞争ELISA检测方法的建立

建立一种基于磁性纳米颗粒能同时检测样品中伏马菌素B_(1)(fumonisin B_(1),FB_(1))、FB_(2)和FB_(3)总量的双探针竞争酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法。采用通过活化酯法制备磁性纳米颗粒-FB_(1)捕获探针,利用改良过碘酸钠法合成McAb-HRP探针,对检测步骤进行优化,确定最佳反应条件。所建立检测方法对FB_(1)和FBs的检测范围分别为0.07~1.98 ng/mL和0.10~9.86 ng/mL。在玉米样品中加标回收率范围为86.2%~105.1%。所建立方法检测结果与液相色谱-串联质谱检测结果的相关系数(R^(2))为0.9966。双探针竞争ELISA检测法检测速度快、准确性高、重复性好,为玉米中伏FBs的快速筛选提供了新方法。

啤酒中伏马菌素的测定

本研究的主要目的是对斯洛伐克啤酒的伏马菌素污染情况进行调查.文中提出了合理的处理和分析方法,该方法对伏马菌素B1和B2的检出限均达到了接近1μg/L的水平,对于伏马菌素B1和B2的回收率分别是94%和79%.在样品的预处理中,文中采用了免疫亲和纯化的方法对来自国内的啤酒样品进行纯化,测定的结果显示了所有的样品中所含的伏马菌素都低于检出限.

液相色谱-电喷雾串联质谱法测定食品中的伏马菌素

通过固相萃取富集伏马菌素,采用液相色谱-电喷雾串联质谱法测定玉米和芦笋中的伏马菌素B1(FB1)、伏马菌素B2(FB2).在最佳色谱条件下,伏马菌素B1、伏马菌素B2的保留时间分别为5.2 min 和8.8 min,样品空白无干扰.离子化技术采用电喷雾正离子方式,以多反应监测(MRM)方式进行检测.该法检出限为80 pg;线性定量范围为0.01～10mg/L;回收率为78.3%～104.9%;相对标准偏差为2.2%～14.2%.利用ESI/MS/MS对伏马菌素B1、伏马菌素B2进行了质谱解析,分别选择特征离子峰m/z 352、528和m/z 336、512作为伏马菌素B1、伏马菌素B2准确定性的依据.方法灵敏度高,选择性好,准确度高,可为食品中伏马菌素的风险评估提供灵敏、准确的分析方法.

市售花生、玉米中黄曲霉毒素与伏马菌素污染水平调查

[目的]了解南京市市售花生、玉米及其制品的黄曲霉毒素(aflatoxin,AFT)和伏马菌素B(FumonisinB,FB)的污染水平,就两者的联合污染水平进行探讨。[方法]收集南京市超市和农贸市场的部分花生、玉米及其制品,采用ELISA法测定FB与黄曲霉毒素B(1AFB1)的含量。[结果]超市所采集的19份样品AFB1的检出率为68%,平均含量为0.53μg/kg,FB的检出率为21%,平均含量为0.56mg/kg。农贸市场所采集的49份样品AFB1的检出率为59%,平均含量为6.98μg/kg,FB的检出率为76%,平均含量为9.89mg/kg。所有玉米及其制品样品AFB1和FB的联合污染率为33%,其中超市样品的联合污染率为21%,农贸市场样品的联合污染率为38%。[结论]南京市市售花生、玉米及其制品中存在AFB1和FB的污染,且玉米及其制品存在联合污染问题。

我国主要食品中伏马菌素污染水平分析与风险评估

【目的】评价我国主要食品中伏马菌素（Fumonisins）的污染状况和风险水平,为相关食品安全管理部门制定伏马菌素限量标准及其他管理政策提供科学依据和相应数据支持。【方法】对我国18个城市中大米及其制品、面粉及其制品、其他谷物及其制品、干豆类和坚果5类食品中的伏马菌素进行抽样检测,结合2002年中国居民营养与健康状况调查数据库的食物消费数据和人口学数据,按照世界卫生组织（WHO）推荐的风险评估方法原则,对我国不同性别年龄组人群对伏马菌素的摄入量进行暴露评估研究,并对其健康风险进行描述。【结果】在总计485份样本中有35份样本检出伏马菌素,伏马菌素平均含量为0.04mg/kg;我国不同性别年龄组人群对伏马菌素的总体平均摄入量为0.162~0.369μg/（kg·d）,远小于联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会（JECFA）对伏马菌素设定的暂定每日最大耐受摄入量（PMTDI）2μg/（kg·d）。【结论】我国主要食品中伏马菌素风险较低,处于可控水平。

液相色谱-串联质谱法测定牛奶中伏马菌素FB_1和FB_2及其水解代谢物

建立了MAX混合阴离子固相萃取柱净化-高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中伏马菌素FB1和FB2及其水解代谢产物HFB1和HFB2的方法。牛奶样品经水稀释后,经MAX柱直接净化,甲醇洗脱得到FB1和FB2,经液相色谱-串联质谱负离子扫描测定,1%乙酸甲醇洗脱得到HFB1和HFB2,经液相色谱-串联质谱正离子扫描测定。结果表明,添加浓度为0.l～5.0μg/L,牛奶中FB1和FB2及其水解代谢产物的回收率为76.4%～92.3%;相对标准偏差(RSD,n=5)为5.9%～12.5%;方法检出限(LOD)均为0.03μg/L;定量限(LOQ)均为0.1μg/L。本方法操作简单,灵敏度、回收率和重复性均良好。

谷物中伏马菌素B_1酶联免疫分析法的建立

以匙孔血蓝蛋白(KLH)为载体,采用碳化亚二胺法人工合成伏马菌素B1(FB1)抗原FB1-KLH,免疫大白兔获得特异性良好的抗FB1多克隆抗体;在多克隆抗体的基础上建立伏马菌素B1的间接竞争酶联免疫吸附分析方法,该方法IC50为11.7μg/L,最低检出限1.1μg/L,平均批内和批间变异系数分别为5.8%、10.2%;分析不同溶剂对标准曲线和加标回收率的影响,确定PBS溶液为样本最佳提取溶剂;在玉米、小麦、大米、高粱谷物样本中添加50～500μg/kg的FB1标准品,平均回收率在70.5%～105.6%之间。将该方法应用于40份谷物样本中FB1的检测,检测结果与高效液相色谱的相关系数(R2)为0.9547。该方法简单、灵敏、快速、准确,适用于谷物中FB1的检测。

水稻穗腐病菌强致病力且高产伏马菌素菌株筛选

【目的】旨在确立稳定高效的水稻穗腐病人工接种技术,鉴定不同菌株致病力。利用已有的伏马菌素检测方法分析测定两种培养基中不同菌株的伏马菌素合成能力,基于上述方法筛选强致病力高产伏马菌素菌株。【方法】分别在水稻孕穗期和抽穗期采用注射法和喷雾法接种,观察不同时期、不同接种方法下层出镰刀菌的致病性和稳定性;利用适合的接种方法和液相色谱-串联质谱检测法比较不同菌株的致病力和产毒能力。【结果】在花粉母细胞减数分裂期-花粉母细胞成熟期采用注射法接种水稻穗腐病,发病率较高且稳定;在花粉母细胞形成期-始穗期接种对水稻产量影响较大。基于该方法成功筛选出了强致病力菌株FP4、FP6、FP8、FP9、FP10;经HPLC-MS/MS分析测定了层出镰刀菌产生伏马菌素能力,获得了强致病力高产毒菌株FP4和FP9。稻谷培养基比玉米培养基更适合层出镰刀菌合成伏马菌素。【结论】水稻穗腐病初侵染为花粉母细胞形成期-花粉母细胞减数分裂期,最佳侵染时期为花粉母细胞形成期-齐穗期;穗腐病对水稻产量的影响与感病时期密切相关。

伏马菌素检测方法的研究进展

伏马菌素(Fumonisin)主要是由串珠镰刀菌产生的一类真菌毒素,污染情况遍布世界各地,由于伏马菌素能引起马脑白质软化症和猪肺水肿,并且与人的食管癌发病率有关,因此,引起人们越来越多的重视。综合叙述了测定玉米和玉米制品中检测伏马菌素的方法,如气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC)、液相-质谱联用(LC-MS)、酶联免疫(ELISA)等检测方法。

柱后衍生-高效液相色谱法测定玉米中伏马菌素B_1和B_2

建立了邻苯二甲醛(OPA)柱后衍生-高效液相色谱测定玉米中伏马菌素B1和B2(FB1和FB2)的方法。采用ZORBAX SB-C18色谱柱,以0.1mol/L磷酸二氢钠溶液(pH 3.3)-甲醇为流动相,梯度洗脱。流动相流速为0.8mL/min,柱温40℃;衍生剂的流速为0.4mL/min,衍生温度为室温。实验对衍生剂缓冲液的pH、衍生剂的浓度和流速、激发和发射波长等重要条件进行了优化。结果表明,衍生剂的pH在10.5、OPA的质量浓度为2g/L、流速为0.4mL/min、激发波长335nm、发射波长440nm时测定效果良好,FB1、FB2在0.2～20mg/L范围内线性关系良好,相关系数大于0.999;FB1和FB2的检出限均为0.02mg/kg;在0.1～4.0mg/kg范围内,3个添加水平的平均回收率为82.5%～89.8%。该方法精确、简单、快速,适合玉米中FB1和FB2的测定。

伏马菌素B_1人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

本研究合成并鉴定伏马菌素B1(FB1)人工抗原,通过动物免疫制备敏感性高、特异性好的鼠源FB1多克隆抗血清。采用碳二亚胺(EDC)法将FB1分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成免疫抗原FB1-BSA和检测抗原FB1-OVA,经鉴定后,分别按10和30μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔3周,最后1次免疫30d后,断尾采血,制备多抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定敏感性和特异性。结果表明,免疫的6只小鼠效价均达1∶104以上,3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为61.3ng/ml,且具有良好的特异性。本试验成功合成了FB1人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的鼠源多克隆抗体血清,为FB1单克隆抗体制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。

抗伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及试剂盒的研制

目的为了能够快速检测粮谷类食品中伏马菌素B1的污染水平,研制具有我国自主知识产权的针对伏马菌素B1快速检测试剂盒.方法制备了能分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,建立了敏感、特异、快速的酶联免疫吸附试验检测方法,最终形成具有中国自主知识产权的伏马菌素B1快速检测试剂盒.结果该试剂盒所用单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,亲和常数为8.3×10^-8mol/L.该抗体与其他结构类似物无明显交叉反应,具有较高的特异性.试剂盒对伏马菌素B1最低检出限5ng/ml,标准曲线的线性范围（50～500ng/m1）,回归方程Y=-0.582X＋1.793（r=0.99,P＜0.05）;对玉米作50ng/ml,200ng/ml和500ng/ml 3个加标浓度的回收率在71.89%～112.95%之间;试剂盒在常温状态下有效期至少10个月;实验室内的变异系数和实验室间的变异系数均小于20%.

伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及免疫学检测方法初步应用

拟制备灵敏高、特异性强的抗伏马菌素B_1(FB_1)单克隆抗体,并初步应用于FB_1的检测,以期为FB_1的免疫学快速检测提供技术支持。采用碳二亚胺法(EDC)制备人工抗原FB_1-BSA和FB_1-OVA。以免疫原FB_1-BSA免疫BALB/c小鼠,每四周免疫一次。四免后,小鼠脾B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,采用ELISA筛选,建立分泌抗FB_1抗体的单克隆杂交瘤细胞株;采用动物体内诱生腹水方法制备出抗FB_1单抗,并鉴定单抗的各种性能;初步建立FB_1免疫学检测方法。结果得到1株稳定分泌抗FB_1单抗的杂交瘤细胞株2E11-H3,该细胞株分泌的mAbs的效价高达1∶1.02×10~6,亲和力常数平均值为7.98×10^(10) L·mol^(-1),亚型为IgG_3。FB_1mAbs的工作浓度为1∶6.0×10~4,与FB_1发生特异性反应,间接竞争ELISA测得IC_(50)=43.65ng·mL^(-1);与FB_1结构类似物FB_2和FB_3的交叉反应率分别为385%和72.4%,与其他霉菌毒素及载体蛋白BSA和OVA均无交叉反应。样品回收率在85.85%~114.07%,平均值为98.81%;变异系数为10.11%。本研究制备出了灵敏度高、特异性强、亲和力高的FB_1单抗,并初步建立FB_1免疫学检测方法。

伏马菌素B_1免疫检测方法的研究

本研究建立了用于检测粮食、饲料中伏马菌素Ｂ１（ＦＢ１）的快速、灵敏、简便的免疫检测方法—建立在单克隆抗体基础上的直接竞争性酶联免疫吸附测定方法（ＤＣ—ＥＬＩＳＡ法）；其最低检出浓度为１０ｎｇ／ｍｌ，线性范围在１０ｎｇ～５μｇ／ｍｌ。对新疆、安徽、黑龙江、哈尔滨四省市玉米样品中的ＦＢ１含量进行了测定，结果表明１５６份样品中有３４份检出ＦＢ１，阳性率为２１．７９％，含量在０．１８～３１．３２μｇ／ｇ范围内，平均含量为１２．０４μｇ／ｇ。

食管癌高发区玉米中伏马菌素B1的检测

目的：检测串珠镰刀菌主要代谢产物ＦｕｍｏｎｉｓｉｎＢ１在华北食管癌高发区玉米中的含量并比较高发区和低发区的含量差别。方法：反相高效液相色谱柱前衍生荧光法。结果：正常玉米ＦＢ１的阳性率为９０９０％，平均含量为１４０±０５０μｇ／ｇ。霉变玉米的阳性率为１００％，平均含量为８８９１±１３０７μｇ／ｇ。结论：高发区的串珠镰刀菌污染率和ＦＢ１含量比较高。

某食管癌高发区人群伏马菌素摄入量及尿二氢神经鞘氨醇/神经鞘氨醇比值的调查

为探讨伏马菌素与人类食管癌发生的关系 ,对食管癌高发区鹤壁市郊部分居民的伏马菌素摄入水平及尿二氢神经鞘氨醇 神经鞘氨醇 (Sa So)比值进行了调查。该地居民长期食用玉米 ,95 %的玉米样品检出了伏马菌素 ,其总伏马菌素含量 (伏马菌素B1、B2、B3之和 )为 7 2～ 72 6 8μg kg。估算受检者的伏马菌素摄入量为男性 0～ 4 84μg (kg·d) ,女性 0～ 4 0 4μg (kg·d)。检测他们的尿Sa So比值并与食管癌低发区睢县人群 (未接触伏马菌素 )比较 ,虽然两地女性尿Sa So比值间差异无显著性 ,但男性尿Sa So比值间差异存在显著性 ,食管癌高发区高于低发区。

伏马菌素B_1特异单链抗体的同源建模及分子对接模拟研究

目的分析伏马菌素B1(Fumonisin B1,FB1)与其特异单链抗体的分子互作模式。方法通过同源建模构建和优化抗FB1单链抗体的三维结构,结合Procheck和Verify 3D等方法评价得到稳定的抗体模型,利用分子对接研究单链抗体与其抗原FB1的结合特性、疏水性和表面静电力作用。结果单链抗体的互补决定区参与同其抗原FB1的结合,抗体与抗原之间不仅形成稳定的氢键,疏水性和静电力的匹配也很好。结论氢键结合力、分子间疏水相互作用和静电力的共同作用,使得单链抗体形成一个能够与FB1高度互补的相互作用区域,并在抗体与抗原的特异性识别及结合稳定性等方面起着关键作用。