传染性造血器官坏死病病毒CJ-13株糖蛋白的原核表达及免疫原性

【目的】克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)CJ-13株糖蛋白(G蛋白)基因,构建原核表达载体,并检测其在大肠杆菌BL21中的表达情况,为IHNV诊断试剂盒和疫苗的研制奠定基础。【方法】设计1对G基因特异引物对G基因进行RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T Easy载体上,构建重组质粒pGEM-T Easy-G,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将G基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,构建传染性造血器官坏死病病毒G基因原核表达质粒pET-32a-G,转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法对表达产物进行分析。【结果】成功克隆了IHNV G蛋白基因,该基因长度为1 527bp。成功构建了原核表达质粒pET-32a-G,诱导表达出约76ku的产物,与预期分子质量大小相符。Western blot分析结果显示,所表达的G蛋白能够被小鼠抗IHNV血清识别。间接ELISA结果显示,小鼠抗G蛋白血清能够识别IHNV全病毒。【结论】成功构建了IHNV G蛋白原核表达系统,重组G蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。

传染性造血器官坏死病病毒参考蛋白的研制

为规避活病毒作参考物质存在的生物安全风险,本研究利用毕赤酵母表达系统表达了传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的糖蛋白来制备参考蛋白,作为IHNV免疫学检测参考物质。本研究选用IHNV糖蛋白基因(IHNV-G)为目的基因,根据Gen Bank中IHNV全基因序列设计特异性引物,以IHNV-uk株病毒核酸为模板,通过RT-PCR获得糖蛋白基因片段,将其克隆至真核表达载体p PICZαA,转入毕赤酵母感受态细胞GS115中,使外源基因与酵母基因融合,通过1%甲醇诱导表达外源蛋白,SDS-PAGE分析显示获得可溶性表达蛋白,分子量大于70 ku。经Western Blot和ELISA分析,该表达产物可以被IHNV多抗特异性识别。0.1531 mg的重组蛋白与0.3125TCID50 IHNV在ELISA实验中反应原性相当,–20°C可稳定保存2个月,说明其在一定程度上可替代病毒作为参考物质。该研究为IHNV ELISA检测试剂盒的开发奠定基础。

传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)分离株病原学研究及全基因组序列分析

为初步了解东北地区某虹鳟养殖场的一株传染性造血器官坏死病病毒株的病原学特征,将该病毒株进行虹鳟鱼苗人工回接感染试验。结果显示,一周内人工感染试验鱼均出现明显的临床症状。将病死虹鳟鱼苗研磨过滤除菌后接种到胖头鱼肌肉细胞系(FHM),出现了特征性病变(CPE),用传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)4组水生动物病毒的6对特异性引物对该毒株进行race-PCR,扩增其全长。结果显示,该病毒基因组全长为11 132 nt,基因组序列中4种核苷酸G、A、T、C含量分别为24.28%、28.67%、19.46%、27.59%。将序列与多株GenBank中已发表的IHNV毒株相应基因进行比较。结果显示,分离株G基因与韩国株ChYa07和PcKw11同源性较高,分别为97.8%和97.5%,其进化树分析结果显示,CJ-13株与韩国株和日本株在遗传进化关系上较近。

传染性造血器官坏死病病毒糖蛋白杆状病毒表达系统的构建及其抗原性分析

为研究传染性造血器官坏死病病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)主要结构蛋白糖蛋白(G),本研究采用RT-PCR方法从IHNV中提取RNA并进行反转录,经PCR方法扩增获得1 380bp的G蛋白基因片段,将其克隆到pFB-LIC-Bse杆状病毒载体中,成功构建了重组质粒pFB-LIC-Bse-G,转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,获得了重组杆粒rBacmid-G。将重组杆粒转染至Sf9昆虫细胞,获得了重组杆状病毒。间接免疫荧光(IFA)和Western blotting分析显示,重组G蛋白可与抗组氨酸单抗(Anti-His)、抗IHNV鼠血清发生特异性反应,表明本研究克隆的IHNV G蛋白在真核表达系统中得到正确表达,且该蛋白具有良好的抗原性。本试验结果为研究G蛋白的功能及开发IHNV新型疫苗奠定了基础。

传染性造血器官坏死病病毒G基因全长cDNA克隆及重组表达研究

本研究旨在克隆G基因全长并与其他传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)株进行分析,为IHNV的预防检测提供依据。通过提取IHNV-G蛋白RNA并进行扩增,将其克隆到p MD-18T并与p Chlamy-4载体相连,重组到莱茵衣藻中并提取总蛋白,结果可得:扩增片段长度为1 500 bp,经SDS-PAGE电泳得到一条大约为58 k Da的蛋白条带,Westen Blot分析结果显示,重组莱茵衣藻所表达的蛋白可以与6×HIS标签抗体特异性结合;并且以重组表达的G蛋白为抗原,鼠抗IHNV血清为一抗,辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG为二抗,再次进行Westen Blot检验,其结果显示,经诱导后的G蛋白能与鼠抗IHNV血清反应,并在58 k Da处出现了一条明显的特异性条带,具有良好的反应原性。表明重组莱茵衣藻表达系统构建成功。

两株传染性造血器官坏死病病毒的分离及其糖蛋白基因序列分析

对所分离编号为20101008和20101032的两株传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的糖蛋白编码基因进行遗传进化分析,以揭示我国毒株与其他不同国家和地区毒株间的遗传进化关系。以反转录RCR(RT-PCR)法扩增其糖蛋白(G)编码基因,然后克隆入PMD-18T载体并测序。应用DNAStar和MEGA4.0软件,将20101008和20101032的G基因与多株GenBank中已发表的IHNV毒株相应基因进行比较。结果表明两株病毒间G编码基因的核苷酸和推导出来的氨基酸同源性分别为98%和81.9%,其氨基酸序列分别发生了35和20处氨基酸的替换。20101008和20101032与日本、韩国分离株同源性较高,核苷酸及推导出来的氨基酸同源性分别为93.3%～96.4%和75.9%～84.6%;两株病毒在进化关系上亲缘关系最近,属于同一分支,均为基因U型传染性造血器官坏死病病毒,但其G基因的核苷酸序列以及推导出来的氨基酸序列与已知的基因U型IHNV都有一定的差异。

一株传染性造血器官坏死病病毒的分离和鉴定

为了了解传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）在国内的分布及致病性,试验采用病料接种敏感细胞、冰冻切片、接种细胞的间接免疫荧光技术、RT-PCR技术及特异性扩增片段测序等分子生物学方法对分离的一株病毒进行鉴定。结果表明：接毒后的鲤鱼上皮细胞（EPC细胞）在36小时开始圆缩,逐渐形成网状结构,最后崩解脱落;应用间接免疫荧光技术可检测到冰冻切片中和接种病料后的EPC细胞中有特异性荧光;通过RT-PCR技术可获得大小约为786bp的DNA片段;测序结果显示,获得的扩增片段与IHNV株核酸序列的同源性为91%~100%;BLAST序列比对结果及进化树分析表明,该分离株与国内分离株20101008（KJ421216.1和KF600727.1）、HLJ-09（JX649101.1）、zyx（HM099906.1）、LQN131107（KJ441078.1）的进化关系最近。说明分离株与20101008（KJ421216.1）、HLJ-09（JX649101.1）、zyx（HM099906.1）等国内分离株有着相同的起源。

传染性造血器官坏死病病毒的重组及安全效价分析

本试验目的是构建转基因莱茵衣藻,用于鱼类口服疫苗的应用。通过提取传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)-G蛋白RNA进行扩增,将其克隆到p MD18T并与p Chlamy-4载体相连,重组得到莱茵衣藻并提取总蛋白,将重组的总蛋白通过给小鼠灌胃并利用流式细胞仪测其免疫指标评价其安全效应。结果:扩增片段长度为1 500 bp,经SDS-PAGE电泳得到1条大约为58 k Da的蛋白条带,Westen Blot分析结果显示,重组莱茵衣藻表达的蛋白可以与6×HIS标签抗体特异性结合,具有良好的反应原性;流式细胞仪检测结果显示,灌胃转基因莱茵衣藻组CD4^+、CD8^+T淋巴细胞含量都有所增加,小鼠未出现死亡。表明转基因莱茵衣藻构建成功。其安全性稳定,可以用于鱼类口服疫苗的推广使用。

间接酶联免疫法检测鲑鳟鱼类传染性造血器官坏死病病毒

目的建立快速检测传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的间接酶联免疫法。方法以传染性造血器官坏死病毒G蛋白(IHNV-G)为抗原,免疫实验白兔,制备兔抗IHNV免疫血清,通过ELISA对兔抗血清进行效价及特异性评估,并通过PCR方法进行验证。结果应用间接ELISA技术,检测到抗血清对IHNV-G和IHNV的效价分别达到1:32000和1:16000,与其他对照病毒无交叉反应。与PCR检测结果符合率达到98%。结论本文建立的间接酶联免疫法方法具有良好的灵敏性和特异性,为IHNV的检测提供了快捷、高效的技术手段。

一株传染性造血器官坏死病病毒的致病性研究

为了对分离于山东某虹鳟养殖场的一株传染性造血器官坏死病毒株（IHNV-Sn1203）进行致病性检测与研究,将该IHNV-Sn1203毒株进行虹鳟鱼苗人工回接感染实验。结果显示,8d内人工感染实验鱼累计死亡率高达100%。收集大批濒死的病鱼样本,制备病理组织切片;利用鲤上皮细胞（EPC）进行细胞感染实验、病毒电镜观察、空斑实验、病毒滴度检测和聚类分析。病理组织切片显示,该病毒可造成虹鳟造血器官广泛性坏死;细胞感染实验结果显示,接种24 h后EPC细胞出现葡萄串状典型细胞病变（cytopathic effect,CPE）,72 h后大部分细胞崩解脱落形成网状孔洞;电镜下清晰可见弹状病毒粒子大量存在于细胞质内,其在EPC细胞上的滴度为10^8.36TCID50/mL,并能形成2～4 mm空斑。对病毒核蛋白氨基酸序列的聚类分析结果显示,该病毒与标准毒株RB-1和WRAC的同源性分别为97%和93%,与国内报道的zyx株具有最高的同源性（99%）。研究表明,IHNV-Sn1203毒株能够在鱼体及敏感细胞中稳定繁殖,产生典型病变,具有较高的病毒滴度,对虹鳟鱼苗有很高的感染性和致死性。

鱼类传染性造血器官坏死病病毒糖蛋白的截短表达及免疫原性检测

目的研究鱼类传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)糖蛋白不同区域对免疫原性的影响。方法本研究通过DNAStar 6.0软件分析糖蛋白跨膜区、疏水性及抗原性后,对其进行截短表达;纯化后的糖蛋白制备兔抗血清,ELISA检测兔抗血清的效价,用间接免疫荧光技术检测纯化后蛋白的免疫原性。结果 SDS-PAGE结果显示,截短糖蛋白相对分子质量(Mr)为40 000,纯化后的糖蛋白经高效液相色谱检测纯度达到90%。利用纯化后的蛋白制备兔抗血清,ELISA结果显示,所制备的兔抗血清与糖蛋白的反应效价为1∶80 000,与IHNV-Sn株细胞培养物的反应效价为1∶20 000;间接免疫荧光结果显示,兔抗血清与IHNV-Sn分离株及参考毒株均能发生特异性的反应。结论实验所表达的糖蛋白与天然的病毒表面糖蛋白具有几乎相同的免疫原性。

传染性造血器官坏死病病毒高效RT-PCR检测方法的建立

传染性造血器官坏死病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV），属弹状病毒科（Rhabdoviridae），诺拉弹状病毒属（Novirhabdovirus），IHNV是该属代表种。IHNV病毒粒子含有一条全长约为11kb的线状、反义、单股RNA。

1株传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的分离与鉴定

将虹鳟鱼苗研磨过滤除菌后接种到胖头鱼肌肉细胞系(FHM)后出现了特征性病变(CPE),电镜下观察到IHNV病毒粒子。用传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)和传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)等水生动物病毒特异性引物对该毒株进行RTPCR试验,结果显示,用IHNV的引物能扩增出阳性片段。将分离株暂时命名为CJ-13。应用DNAStar和MEGA5.2软件,将CJ13的N基因与多株GenBank中已发表的IHNV毒株相应基因进行同源性比对和构建系统树。核苷酸同源性显示CJ-13株与HV7601株的N基因同源性高达97.1%,推导出的氨基酸序列同源性为95.2%。系统进化树表明,CJ-13分离株与HV7601株遗传进化关系较近,属于同一分支。

四川彭州地区养殖虹鳟传染性造血器官坏死病病毒的分离、鉴定及病理学观察

近期,四川省成都彭州市某虹鳟养殖场暴发流行疾病,导致养殖虹鳟死亡率高达 90%。现场采样观察发现患病鱼主要症状为背部发黑,鳔壁、腹膜严重出血,心包积 液,空肠、空胃和显著肠炎。同时对病鱼进行细菌学与组织病理学检测,细菌学检查结 果为阴性,病理学观察发现脾脏有典型凝固性坏死,肝脏组织广泛变性、坏死,肠道黏 膜下层水肿,肠上皮充血及上皮细胞脱落坏死,脑膜和心外膜水肿。将病鱼的脾组织研 磨过滤除菌后,腹腔注射60尾健康虹鳟,注射组均表现为急性死亡(累计死亡率达 85%),试验鱼出现与自然发病鱼相同的症状而对照组无异常。取病鱼的脾脏组织研磨过 滤后接种胖头鲤细胞(fathead minnow cell,FHM),细胞感染3 d后出现典型的细胞病变效 应(CPE)。针对编码IHNV糖蛋白(Glycoprotein,G)基因进行逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR)检测显示,患病鱼、人工感染病鱼和病变细胞均为IHNV阳性,扩增序列与IHNV糖 蛋白基因同源性为98.2%。对该病毒分离株的G基因进行系统发育分析,结果显示,该分 离株与亚洲分离株聚为一簇,属于JRt基因型。

虹鳟传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病重组腺病毒载体的构建

传染性造血器官坏死病和传染性胰腺坏死病是以感染鲑科鱼类为主的两种传染病。为克隆传染性造血器官坏死病病毒IHNVG基因和传染性胰腺坏死病病毒IPNVVP2基因,并构建其重组腺病毒载体。利用RT-PCR方法分别扩增出IHNVG基因和IPNVVP2基因,通过多基因片段同源重组技术将IHNVG基因和IPNVVP2基因克隆到pAdTrack-CMV载体上,经过线性化后与pAdEasy-1载体在BJ5183菌体内同源重组,构建出重组腺病毒质粒,经PCR及NotⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,再经PacⅠ线性化后用于转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒。通过绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达来监控重组腺病毒的复制情况,用western blot法分别检测糖蛋白(G蛋白)和VP2蛋白的表达,并测定重组病毒的滴度。结果显示,克隆出的IHNVG基因和IPNVVP2基因总长度为3036 bp。该病毒在HEK-293细胞中分别表达出蛋白分子质量约为58 kD和54 kD的产物,其滴度为1.0×10^(9.5)mL^(-1)TCID_(50)。结果表明,研究成功获得IHNVG基因和IPNVVP2基因重组腺病毒,该病毒在HEK-293细胞中滴度较高,能够稳定表达。研究结果为下一步研发传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病二联疫苗奠定了基础,并为进一步防控传染性造血器官坏死病和传染性胰腺坏死病提供了参考。

虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒蛋白生物信息学分析

传染性造血器官坏死病(infectious haematopoietic necrosis,IHN)是虹鳟鱼养殖过程中面临的主要病毒性疾病,目前针对该病尚无可行的治疗方法,研发相应疫苗十分必要。本研究通过生物信息学方法,在NCBI中获得基因登录号,使用ProParam软件分析传染性造血器官坏死病病毒N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和NV蛋白的理化性质,并用SOMPA软件对5种蛋白的二级结构进行预测,使用ABCpred软件和SYFPEITHI软件预测5种蛋白的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位,并用VaxiJen 2.0软件评估抗原性。结果表明:N蛋白和G蛋白为稳定蛋白,5种蛋白均具有良好的亲水性,二级结构预测结果显示N蛋白、P蛋白和NV蛋白α螺旋占比较高,分别为59.34%、56.96%和40.54%,M蛋白和G蛋白无规则卷曲占比较高,分别为37.95%和55.51%;B细胞抗原表位预测结果表明N蛋白有11个、P蛋白有5个、M蛋白有3个、G蛋白有9个、NV蛋白有1个;T细胞抗原表位预测结果表明N蛋白有CTL表位9个、Th表位9个,P蛋白有CTL表位1个、Th表位5个,M蛋白有CTL表位1个、Th表位4个,G蛋白有CTL表位4个、Th表位5个,NV蛋白有CTL表位2个、Th表位3个。综上所述,N蛋白和G蛋白为稳定蛋白,具备良好的亲水性,抗原表位丰富,有良好的疫苗开发价值。

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) LAMP检测方法的建立

本研究建立了一种检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)的环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。根据GenBank中注册的IHHNV-VN基因序列设计出6条特异性引物,成功建立了IHHNV-LAMP检测方法。该方法检出限为6 copies/μl,且与对虾其它常见疫病均无交叉反应。采用LAMP和常规PCR方法对40份具有典型IHHNV感染症状的对虾样品进行检测,结果显示:LAMP方法的阳性检出率为97.5%,PCR方法的阳性检出率为85%,表明建立的IHHNV-LAMP方法不仅具有高灵敏度、高特异性而且还有较高的准确性,能够为对虾传染性皮下及造血组织坏死病的早期快速诊断提供技术支撑。

传染性造血器官坏死病病毒RT-RAA-LFD检测方法的建立与应用

为针对传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)建立一种可实现现场快速、准确的检测方法,结合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,在IHNVG基因保守区域设计引物和探针,通过优化反应时间和温度等条件,建立了可用于IHNV现场可视化检测的RT-RAA-LFD方法。优化后的检测方法在35℃水浴锅中恒温反应15 min即可实现对IHNV目的基因片段的有效扩增。结果显示:该方法可以特异性地检测出IHNV,不与其他常见鱼类病毒发生交叉反应;对IHNV质粒标准品的检测下限可以达到2.15×101 copies/μL;采用该方法和实时荧光RT-PCR、实时荧光RT-RAA同时对35份临床样本进行检测,其阳性符合率为100%。上述结果表明,本研究针对IHNV成功建立了一种快速、准确、便捷的试纸条检测方法,并可适应于多种场合。

鱼类传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的酵母表面展示

糖蛋白(glycoprotein,G)是鱼类传染性造血器官坏死病毒的主要表面抗原,是病毒检测及疫苗研制的主要靶基因。为了对其进行酵母表面展示,本研究利用本实验室保存的含有IHNV-Sn1203毒株G基因的质粒为模板,PCR扩增富含抗原表位的糖蛋白基因片段后,连接酵母表面展示载体p YD1,构建重组质粒p YD1-G。将p YD1-G转化酿酒酵母EBY100细胞后,利用半乳糖诱导G蛋白的表达。利用细胞免疫荧光、Western Blotting及流式细胞仪检测酵母表面G蛋白的表达情况。细胞免疫荧光结果显示,转化了p YD1-G重组质粒的酵母细胞表面呈现出特异性荧光;Western Blotting结果显示,经半乳糖诱导后G蛋白在酵母细胞表面获得了成功表达;流式细胞仪检测结果表明,随着半乳糖诱导时间的增加,G蛋白的表达量随之增加,并在诱导48 h时达到峰值。以上研究表明G蛋白在酵母细胞表面获得了成功表达,本研究为以酵母为活载体的新型口服疫苗的研制奠定了基础。

一例虹鳟感染传染性造血器官坏死病毒的诊断及防控方案

在养鱼业中,传染性造血器官坏死病(IHN)是发病率较高的疾病之一。随着进口虹鳟和养殖鳟鱼行业的发展,可能会导致传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的传播。世界动物卫生组织(WOAH)已将其纳入《水生动物卫生法典》,在我国,农业农村部发布的《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》将其列二类动物疫病,是一种必须要上报的动物疫病。