琼脂糖凝胶直接杂交快速鉴定低拷贝数转基因

采用常规的ＰＣＲ方法检测低拷贝数转基因有一定困难．提出一种使用琼脂糖凝胶直接杂交的方法，结果明确、简单可行，是转基因动物中低拷贝数转基因鉴定的一种较好方法．

全基因组扩增法应用于低拷贝数DNA检测

目的建立基于多重置换扩增(MDA)技术的全基因组扩增(WGA)方法,实现对低拷贝数(LCN)DNA样品进行分析。方法采用REPLI-g试剂盒对样本进行等温全基因组扩增,扩增产物采用ProfilerPlus试剂盒确定样本的十个STR基因座的等位基因型。结果10pgDNA模板经全基因组扩增后,能够进行DNA分型。结论全基因组扩增可以用于LCN的DNA分析,帮助提高微量物证的检出成功率。

pUC衍生质粒的一个低拷贝数突变型

本文报道大肠杆菌的ColE1类似质粒的一个低拷贝数突变型。从载体质粒pUC4衍生的重组质粒pPGVT3在大肠杆菌宿主DF2145中是不稳定的,以pPGVT3转化DF2145时在4o℃培养得不到转化子。用诱发点突变的羟胺体外处理pPGVF3质粒DNA,得到一个稳定性提高了的突变质粒pPGVT3HA,突变的位置被确定在质粒的pUC部分,突变降低了pUC及其衍生质粒的拷贝数。文中对质粒的稳定性与拷贝数的关系作了讨论。

检测低拷贝数HBV DNA含量的临床研究

目的:了解不同试剂在应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)以及巢式PCR方法在检测低拷贝数的HBV DNA量的差异与灵敏度。方法:用上海复星医学科技发展有限公司(A方法)检测出了68例HBV DNA结果为5.1×101-1.0×103拷贝数/亳升的低拷贝数标本。然后,三家不同公司的试剂(方法 B、方法 C、方法 D)对这些样本进行复核。另外,巢式聚合酶链反应PCR法检测此68例标本。随访巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA的病人。结果:用四种方法(A、B、C、D)检测的68个样本的HBV DNA拷贝数结果如下:无拷贝(0,9,12,4);101-102(21,17,18,22);102-103(47,36,28,35),大于103(0,6,10,7)。同时,用巢式聚合酶链反应检测此68例标本,有55例检测为阳性,有13为阴性结果。巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA含量的病人,随访发现此10病人有8例均在1~3月后出现HBV DNA的反跳,并伴肝功能的不正常,其HBV DNA的含量均在104拷贝数/毫升以上。结论:目前所用的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)的方法和试剂对低拷贝数HBV DNA存在不稳定性和不确定性。巢式PCR法对低拷贝数HBV DNA的检测灵敏度要远高于实时荧光定量PCR法。该研究提示测对抗病毒治疗过程中患者进行低拷贝数HBV DNA的检将提供有效的药物评价和预后信息。

低拷贝模板DNA分型及其在法医学中的应用

近年来,低拷贝模板类生物物证在法庭科学领域中的应用越来越广泛。然而由于其自身存在的一些限制性因素,始终是法庭科学工作者关注的一个焦点。本文从低拷贝模板DNA的定义及其在法庭科学应用中的有效性、应用范围、分型策略、质量控制、重复性原则、随机阈值等方面对低拷贝数分型及其在法庭科学应用中的最新研究进展进行了综述。

低深度拷贝数变异测序在胎儿先天性心脏病中的应用研究

目的评价低深度拷贝数变异测序(CNV-seq)技术在产前诊断CHD致病基因中的临床应用价值,探索CHD与染色体亚显微异常的关系,为CHD的早期诊断、治疗和遗传阻断提供理论依据。方法选取2017年1月至2019年5月在广西柳州市妇幼保健院被产前超声诊断为胎儿心脏异常伴或不伴心外异常的孕妇,经过纳入标准及排除标准的筛查,共181例胎儿CHD纳入研究。对181例胎儿同时进行染色体核型分析及CNV-seq分析,得出的结果进行基因型-表型分析。结果染色体核型分析检出染色体畸变共有20例(20/181,11.0%);CNV-seq分析技术检出染色体拷贝数异常43例,检出率为23.8%(43/181),其中有明确致病意义的为15.5%(28/181)(包括染色体核型分析检出的20例染色体畸变),临床意义不明的为3.9%(7/181)。结论运用CNV-Seq技术对胎儿CHD进行产前诊断,较传统的染色体核型分析方法能显著提高染色体畸变的检出率,鉴定疾病相关性CNV,为进一步了解CHD的发病机制提供理论依据,也为CHD的早期诊断、治疗和遗传阻断提供临床证据。

低深度基因组拷贝数变异测序(CNV-Seq)联合染色体核型分析在胎儿嵌合体诊断中的应用价值

在胎儿嵌合体诊断中,予低深度基因组拷贝数变异测序(copy number variation sequencing,CNV-Seq)+染色体核型分析,评价应用诊断价值价值。方法:以常规诊断的孕妇为分析对象(2019.01-2020.12),获98份羊水标本,予CNV-Seq、染色体核型分析,评价对胎儿嵌合体的诊断价值。结果:98份羊水标本,CNV-Seq+G带核型分析,染色体嵌合体检出11(11.22%)例,其中核型检测出9(9.18%)例, CNV-Seq检出9(9.18%)例,CNV-Seq、染色体核型分析均检出胎儿染色体嵌合7(7.14%)例。在11份异常羊水标本中,NIPT、超声及NT、高龄、唐氏筛查检出嵌合体检出4(36.36%(4/11))份、4(36.36%(4/11))份、1(9.09%(1/11))份、2(18.18%(2/11))份。CNV-Seq联合染色体核型分析为胎儿染色体嵌合体的病例中,性染色体数目或结构异常4例,常染色体数目、结构异常6例、1例,其中性染色体、常染色体异常嵌合病例1、3例,CNV-Seq、染色体核型分析结果不一致。结论:在胎儿嵌合体诊断中,应用CNV-Seq联合染色体核型分析,诊断价值明确,能弥补羊水穿刺诊断的不足,能为产前遗传咨询提供实验室诊断结果,推荐使用。

子宫内膜癌分子分型的研究进展

子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,临床工作根据形态学特点及激素依赖性将其分为两个亚型,即激素依赖型和非激素依赖型。2013年癌症基因组图谱网络根据不同的分子特征将子宫内膜癌分为4个分子亚型,即POLE突变型、微卫星不稳定型、低拷贝数变异型、高拷贝数变异型。但该分组方法需要基因组测序,成本昂贵、操作复杂,不适合广泛的临床应用。因此,在这个分子分型的基础上MC Alpine团队在2015年对该方法进行改良,提出子宫内膜癌的主动分子风险分类器,并在2018年确定分类器的最终验证步骤。这个主动分子风险分类器已被广泛应用。

低深度全基因组测序拷贝数变异分析技术在性发育异常患儿诊断中的应用价值

目的探讨低深度全基因组测序拷贝数变异分析(CNV-seq)技术在性发育异常(DSD)患儿诊断中的应用价值。方法纳入2019年10月至2020年10月至郑州大学第一附属医院就诊的5例身材矮小或外阴发育异常的DSD患儿。在外周血染色体核型分析、全外显子组测序(WES)、SRY基因检测的基础上,进行CNV-seq检测以明确病因。结果患儿1和2的社会性别为女性,染色体核型均为46,XY,WES结果为阴性,CNV-seq结果分别为46,XY,+Y(1.4)和46,XY,-Y(0.75)。其余3例患儿均携带可疑的Y染色体,综合分析发现其核型分别为45,X[60]/46,X,del(Y)(q11.221)[40]、45,X,16qh+[76]/46,X,del(Y)(q11.222),16qh+[24]和45,X[75]/46,XY[25]。结论联合运用CNV-seq等分子遗传学技术明确了46,XY DSD患儿的Y染色体拷贝数变异及45,X/46,XY DSD患儿可疑Y染色体的性质,为其临床诊疗提供了重要的依据。

自然流产及指征引产组织与染色体异常的关系

目的探讨自然流产及指征引产组织与染色体异常的关系。方法采用低深度高通量全基因组拷贝数变异测序(CNV-Seq)技术对自然流产组织和指征引产胎儿组织进行染色体检测,其中自然流产标本141例,指征引产标本69例。结果自然流产组织141例,指征引产组织69例均检测成功。141例自然流产组织中染色体异常65例,检出率为46.10%,其中染色体数目异常46例,意义不明或良性结构异常12例,致病性结构异常7例;69例指征引产组织中染色体异常28例,检出率为40.58%,其中染色体数目异常13例,意义不明或良性结构异常10例,致病性结构异常5例。结论染色体异常(数目和结构)是导致自然流产和指征引产的主要原因,采用CNV-Seq技术检测自然流产和指征引产组织有利于查找遗传学病因,对再次生育指导有重要意义。

浓缩DNA法结合miniSTR分型技术检验微量DNA

目的优化低拷贝数DNA STR分型方法。方法对采用磁珠法或Chelex-100法提取DNA,Identi-filer试剂盒扩增,未获得分型结果的日常检案检材,采用物理浓缩法或过柱浓缩法浓缩DNA,采用miniFilerTM试剂盒再次扩增分型。结果 127例检材中,47例磁珠法提取DNA未获得分型的样品,分型成功率为36%;80例Chelex-100法提取DNA未获分型的样品,分型成功率为30%。结论采用浓缩法和miniFilerTM试剂盒,可以提高日常检案中低拷贝数检材的STR检验分型成功率。

提高PCR扩增大DNA片段的特异性和产量

聚合酶链式反应(PCR)技术仅产生数年,却以惊人的速度广泛应用于分子生物学各个领域。它能快速、特异地扩增出任何所希望的目的基因或DNA片段,用于基因克隆、测序、突变体和重组体构建、基因表达调控的研究、基因多态性分析、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医鉴定等诸多方面。目前PCR扩增DNA片段长度可达到近50kb,这在生物学研究特别是在基因组图谱的绘制和测序中将起到革命性作用。扩增片段的能力达到近20～50kb,也将具有其它潜在的应用价值,如可以分离出完整的基因。

低深度全基因组测序技术在儿童智力障碍/全面发育迟缓诊断中的应用

评估低深度全基因组拷贝数变异测序技术(Copy Number Variation Sequencing, CNV-Seq )在儿童智力障碍/全面发育迟缓诊断中的作用。方法 选择2020年1月-2023年10月,在玉林市妇幼保健院就诊或检测的200例智力障碍/全面发育迟缓儿童作为研究对象,采集外周血样本进行CNV-Seq检测,部分患儿同时接受染色体核型分析检测。对检测结果进行统计分析。结果 CNV-Seq共检出阳性拷贝数变异(CNVs)62例,阳性率31%,致病相关CNVs共43例,致病相关CNVs检出率21.5%。致病性CNVs分布广泛,以5Mb以下为主(8%)。43例CNV-Seq检出致病相关CNVs的病例中,14例同时接受核型分析检测,核型分析漏检率为35.71%。结论 基因组拷贝数变异是导致儿童智力障碍/全面发育迟缓的重要遗传学因素,CNV-Seq可为其提供有效的诊断依据。

一种改进的快速Southern杂交方法

本文提出一种使用琼指糖凝胶直接杂交的方法,结果明确、简单可行,是微量核酸、低拷贝基因鉴定以及疾病核酸诊断的一种较好方法。

生物固氮

902174 重组质粒[专,日]/Kyowa-Hakko/J0 1225-483:04.03.88-JP-049867(08.09.89)04.03.88 as049867.89-304907/42(14页)[译自DBA,1990,9(2),90-00897]披露了一个含有缺陷性 nifL 基因。

应用CNV-Seq技术分析163例肠管回声增强胎儿的染色体拷贝数变异

目的评估低深度全基因组拷贝数变异测序技术(copy number variation sequencing,CNV-seq)在胎儿肠管回声增强(echogenic fetal bowel,EB)孤立型及合并其他超声软指标(合并型)中的诊断价值及遗传病因分析,为临床遗传咨询提供指导。方法以2017年12月至2021年6月就诊于本中心共163例为研究对象。采集羊水(162例)或绒毛(1例)进行CNV-Seq检测,结合生物信息学分析其致病性CNVs情况。结果163例中共检出13例(8.0%)阳性,包括9例(5.5%)非整倍体及4例(2.4%)CNVs。其中孤立型EB组和合并型EB组阳性率分别为1.7%(1/58)和11.4%(12/105),经卡方检验,两者存在显著差异(P<0.05)。两组中各发现一例Xp22.1重复,为女性DMD携带者,后健康出生。合并型EB组中发现9例非整倍体及2例致病性/疑似致病性CNVs,均引产。结论合并型EB胎儿的非整倍体及致病性CNVs阳性率远高于孤立型EB,且大部分终止妊娠。这提示在临床上相对于孤立型EB,需要更加关注合并型EB胎儿,及时进行产前诊断及遗传咨询。

不同类型胎儿先天性心脏病的产前诊断及预后分析

目的探讨不同类型胎儿先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)与染色体畸变的关系,评估低深度拷贝数变异测序在胎儿CHD的应用价值,为临床咨询及评估胎儿预后提供依据。方法纳入2017年1月至2019年5月在广西柳州市妇幼保健院被产前超声诊断为胎儿CHD伴或不伴心外异常的孕妇181例,根据是否伴有心外异常分为独立型CHD组146例和伴有心外异常CHD组35例,纳入研究病例同时采用染色体核型分析和低深度拷贝数变异测序(copy number variation sequencing,CNV-seq)分析,统计分析不同类型胎儿CHD的染色体畸变情况,随访所有病例的妊娠结局及新生儿情况。结果(1)染色体核型分析染色体畸变检出率为11.0%(20/181),CNV-Seq检出43例(43/181,23.8%)CNVs,其中28例(28/181,15.5%)为致病性CNVs,比传统染色体核型分析额外检出了8.4%的染色体畸变。(2)伴心外异常CHD组的染色体畸变检出率显著高于独立型CHD组,差异有统计学意义(40.0%vs.9.6%,P<0.05)。(3)随访:分娩活产儿117例(64.6%,117/181),终止妊娠62例,宫内死胎2例。结论CNV-seq技术提高了CHD胎儿的染色体畸变检出率,有利于产前临床咨询中正确评估胎儿的预后,为孕妇是否继续妊娠提供更客观的依据,有助于优化母婴结局;同时也是染色体核型分析有效的补充检测手段,为CHD胎儿的产前诊断提供了一种更具临床适用性检测技术。

罕见的6p重复伴末端缺失综合征1例患儿的临床表型及遗传学分析

目的探讨1例生长发育迟缓和智力低下(DD/ID)患儿的遗传学病因。方法选取2023年6月3日因"生长及智力发育迟缓、颅面部多发畸形、反复上呼吸道感染"就诊于深圳市龙华区妇幼保健院的1例女性DD/ID患儿及其父母作为研究对象。对患儿及其父母进行外周血染色体核型分析、低深度全基因组拷贝数变异测序(CNV-seq)和染色体微阵列分析(CMA),用荧光原位杂交(FISH)对候选拷贝数变异(CNV)进行家系验证。本研究通过深圳市龙华区妇幼保健院医学伦理委员会的审查(伦理号:2023052504)。结果患儿为8岁女性,具有不明原因的生长及智力发育落后、多发颅面部畸形、反复感染。患儿的外周血染色体G显带核型为46,XX,add(6)(q23),其父母核型未见异常。CNV-seq检测提示患儿6p25.3p22.3区存在21.38 Mb片段重复,6p25.3区存在0.78 Mb末端缺失。CMA检测证实患儿存在6p25.3(chr:934267_22310728)区段重复,6p25.3存在近端粒区(chr:156975_931936)缺失。FISH检测提示患儿的CNV为新发变异。结论联合外周血染色体G显带核型分析、CNV-seq、CMA及FISH检测确诊了1例DD/ID患儿的病因。患儿的异常表型可能是由6p重复伴末端缺失所致。

CNV-seq在高危孕妇产前诊断中的应用价值

目的探讨低深度全基因组拷贝数变异测序(CNV-seq)在高危孕妇产前诊断中的应用价值。方法选取2018年7月至2019年11月于本院就诊的271例高危孕妇为研究对象。根据无创产前检测(NIPT)的结果,将271例高危孕妇分为NIPT阳性组(n=83)和其他异常组(高龄、唐筛高风险、NIPT两次检测失败、不良孕产史、超声提示异常、自身表型异常)(n=188),应用CNV-seq技术对两组孕妇进行羊水细胞DNA的拷贝数变异(CNVs)检测,同时进行羊水细胞染色体核型分析,将二者的结果进行比对。结果在271例孕妇中,CNV-seq共检出致病性CNVs 56例(20.66%),核型分析共发现染色体畸变52例(19.19%),二者差异有统计学意义(P<0.05)。CNV-seq检测发现两组的CNVs的分型和分布差异具有统计学意义(P<0.05)。与NIPT阳性组相比,其他异常组的可能致病和意义未明CNVs的占比[2.41%(2/83)vs.5.32%(10/188)]显著偏高(P<0.05)。结论可将CNV-seq作为高危孕妇的一线产前诊断方法,并作为羊水细胞染色体核型分析的补充诊断工具。因其他异常因素就诊的NIPT阴性高危孕妇中,可能致病及意义未明的CNVs的检出率偏高。