补充褪黑素的人卵母细胞体外培养成熟技术在COH周期中的应用

目的比较同一控制性超促排卵(COH)治疗周期中,体内成熟与改良技术体外培养成熟(IVM)的卵母细胞的早期胚胎发育能力及临床结局,探讨补充褪黑素的IVM技术在临床中的应用。方法收集159例患者在COH周期中的920个成熟卵母细胞进行常规体外受精(IVF/ICSI)处理,同时收集同周期中1283个未成熟卵母细胞,在添加褪黑素的改良IVM培养基中培养成熟后行ICSI处理。通过回顾性分析,比较常规助孕技术与改良IVM技术这两种方式,对辅助生殖治疗的助孕结局和妊娠结局的影响。结果与从COH周期中收集到的行常规IVF/ICSI处理的成熟卵母细胞相比,经改良IVM技术促成熟的卵母细胞的优质囊胚形成率较低。但经胚胎移植后,两种方式获得的成熟卵母细胞的临床结局包括临床妊娠率、足月产率、婴儿体长、新生儿Apgar评分,差异均无统计学意义。结论IVM可以提高从COH周期中回收的未成熟卵母细胞的卵子利用率,改善辅助生殖技术助孕患者的妊娠结局。

非人灵长类多能干细胞体外培养和诱导分化的研究进展

干细胞在疾病发生、细胞治疗、药物筛选和临床应用等方面具有巨大价值。自日本科学家Shinya Yamanaka发现诱导多能干细胞以来,相关的研究立即成为研究热点并持续至今。小鼠干细胞的研究为其它动物的相关研究开辟了道路,但在药物筛选和疾病治疗等方面有很大局限性。非人灵长类与人类具有更高的基因同源性,在生理、病理、生殖、药理、神经等多方面与人类高度相似,是研究人类疾病和开发人用药物的理想动物模型。非人灵长类研究也是新药在进入临床实验前必须的一个环节。非人灵长类干细胞的研究在疾病的机理研究和药物开发中越发重要,同时避免了伦理问题。本文从体外培养系统的优化和诱导分化的方法两个方面对非人灵长类多能干细胞的相关研究进行了综述,以期为非人灵长类干细胞进一步深入研究提供参考。

牛球虫体外培养研究进展

牛球虫病(bovine coccidiosis)是由一种或多种艾美耳属球虫引起的具有高度致病性的寄生性原虫病,流行范围广泛,可导致患牛出现营养吸收不良、发育迟缓、水样或血样腹泻等症状,甚至引起死亡,严重危害养牛业的发展。目前主要通过药物预防对牛球虫病进行防控,但随着耐药虫株的出现以及人们对于兽药残留问题的关注,抗球虫新药的研发刻不容缓。体外培养作为实验动物研究的替代方案,可以人工模拟牛球虫自然宿主的体内环境和条件,且成本相对较低,对于研究球虫的入侵机制、球虫与宿主的相互作用以及抗球虫药物的药效评价具有重要意义。在已建立的体外培养体系中,牛球虫可以完成从子孢子到卵囊的部分或全部内生性发育过程,这为研究虫体的生命周期阶段和新的防治策略开辟了新的途径。笔者通过查阅国内外牛球虫体外培养的相关资料,对球虫子孢子的分离和纯化、原代细胞及细胞系培养、体外培养条件和影响因素以及体外培养的应用方面进行了详细阐述,以期为牛球虫的安全有效疫苗和防治药物的研发提供参考。

瘤胃纤毛虫体外培养技术研究进展

瘤胃纤毛虫是一类主要生活在反刍动物瘤胃内的单细胞真核微生物,可能在瘤胃高效降解植物纤维、调节瘤胃发酵速率和参与瘤胃温室气体甲烷产生等方面具有重要作用。深入探究瘤胃纤毛虫的功能及其对宿主的影响,实现其体外培养是一项不可或缺的技术手段。综述了瘤胃纤毛虫体外培养技术研究进展,首先介绍了瘤胃纤毛虫体外培养的国内外研究现状,然后概述了影响瘤胃纤毛虫体外培养的因素,最后指出建立的瘤胃纤毛虫体外培养体系的应用及前景,为建立稳定可控的瘤胃纤毛虫体外单种生长与增殖培养体系提供参考。

不同条件下小鼠肺泡巨噬细胞体外培养的实验研究

目的:应用文献报道的肺泡巨噬细胞(AMs)体外培养方法,利用GM-CSF、TGF-β和PPAR-γ激动剂罗格列酮(简称GTR)培养体系,分析不同年龄小鼠、不同来源前体细胞产生AM样细胞或AMs的特征。方法:收取不同周龄小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)、骨髓单个核细胞以及胚胎15~17 d小鼠肝脏单个核细胞,种入12孔板,置于GTR体系中培养。流式细胞术检测产出细胞AM表面标志分子F4/80、CD11b、CD170和CD11c表达。结果:培养后,光镜下BALF来源细胞基本呈圆形,骨髓来源细胞近半呈圆形,胎肝来源细胞85%左右呈圆形。4周龄小鼠BALF-AMs比例接近90%,比例和数量均随小鼠年龄增加而增加,12周龄小鼠BALF-AMs数量接近1×106个。4周龄小鼠骨髓源AM样细胞比例不到20%,8周龄和12周龄小鼠比例为40%~45%,数量随小鼠年龄增加而增加,12周龄小鼠骨髓源AM样细胞数量约为0.8×106个/孔。胎肝源AM样细胞比例约为84%,1个孔产出的AM样细胞约为4×106个。结论:不同年龄小鼠、不同来源前体细胞产生AM样细胞或AMs的纯度和数量有较大差别,应根据具体研究要求选择合适方法。

鸡球虫体外培养模型及应用研究进展

鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠上皮细胞内所引起的一种寄生性原虫病,感染鸡体重减轻、营养不良、肠道损伤等,严重危害养鸡业的健康发展。球虫的生命周期包括从无性阶段到有性阶段的转换并局限于一个宿主。目前对球虫的研究主要包括在细胞生物学及其不同生命阶段的蛋白质表达和运输机制、宿主细胞入侵和宿主-寄生虫相互作用、新型药物靶标筛选等方面。鉴于研究问题的多样性,以及减少和取代动物试验的要求,建立高效的体外培养模型成为研究鸡球虫生物学特性、抗球虫疫苗和药物的基本条件。笔者重点阐述了鸡球虫体外培养模型及其在药物抗虫效果研究中的应用,包括鸡胚培养模型、二维培养模型(原代细胞培养模型、传代细胞系培养模型)及三维类器官培养模型。越来越多培养技术的突破为研究球虫生命周期阶段和干预策略开辟了新的途径,也为深入了解鸡球虫致病机制、抗球虫药物研发提供依据。

重组pET30a-EgM9蛋白高免兔血清对体外培养细粒棘球绦虫发育的影响

探究egM9基因在细粒棘球绦虫性成熟发育过程中的调控机制。利用重组pET30a-EgM9蛋白高免血清对细粒棘球绦虫进行体外干预试验,观察干预后虫体的发育情况。在体外培养模型中,用pET30a-EgM9蛋白高免兔血清作用于体外培养30 d的虫体,通过Western blot检测虫体蛋白的免疫反应性,RT-qPCR分析虫体中EgM9基因的表达水平。显微观察表明经高免血清干预后虫体明显向成囊方向发育。Western blot直接法表明高免兔血清可以与虫体蛋白形成复合物,间接法证明EgM9多克隆鼠血清未与上述复合物发生抗原抗体特异性结合。RT-qPCR验证EgM9高免兔血清可刺激虫体中的EgM9基因的表达。说明通过高免血清体外干预,可促进EgM9在基因和转录水平上的表达,为筛选细粒棘球绦虫终末宿主疫苗候选基因提供理论依据。

玻璃化冷冻囊胚复苏后不同体外培养时间对临床妊娠结局的影响

目的 探讨玻璃化冷冻的扩张期囊胚解冻复苏后不同的培养时间对临床妊娠结局的影响。方法 回顾性分析我院2021年1月1日至2022年12月31日期间通过玻璃化冷冻的D5及D6囊胚移植周期临床资料,共1 867周期。根据囊胚复苏后体外培养时间将其分为A组(<2 h,n=958)和B组(2~4 h,n=909),再根据移植囊胚的数目分为两个亚组,移植1枚囊胚定义为A1组(n=843)和B1组(n=798),移植2枚囊胚定义为A2组(n=115)和B2组(n=111)。比较各组HCG阳性率、临床妊娠率、胚胎着床率、多胎率、早期流产率及最终活产率之间的差异。结果 患者的平均年龄、不孕年限、内膜厚度以及基础激素水平等在A1和B1组、A2和B2组之间均无显著差异(P>0.05)。妊娠结局方面,移植1枚囊胚的两组(A1和B1)间HCG阳性率、临床妊娠率、胚胎着床率、多胎率、早期流产率、异位妊娠率和活产率比较均无显著差异(P>0.05);移植2枚囊胚的两组(A2和B2)比较,A2组的HCG阳性率显著高于B2组(91.30%vs. 79.28%,P<0.05),A2组临床妊娠率(81.74%vs. 71.17%)、胚胎着床率(61.30%vs. 54.05%)、活产率(67.83%vs. 63.06%)也均高于B2组,但差异无统计学意义(P>0.05)。Logistic分析结果表明,移植2枚冻融囊胚时体外培养时间<2 h是HCG阳性率的独立影响因素[OR=2.210,95%CI(1.028,4.752),P=0.042]。结论 双囊胚移植周期解冻后应尽量在2 h内移植,以便获得更好临床结局;单囊胚移植者解冻后在4 h内移植临床妊娠结局并无明显差异。

动物精原干细胞体外培养研究进展

精原干细胞(SSCs)作为成体干细胞之一,可将遗传信息向子代传递,在雄性动物的精子发生过程中起到至关重要的作用。根据SSCs的生物学特征并通过有效的细胞分离手段将睾丸中的SSCs进行分离,进一步纯化并体外培养,才能更加深入地研究其相关机制。随着测序技术及基因编辑技术的发展和成熟,对于SSCs的研究手段和应用范围也在不断扩展。因此,文章主要对SSCs的生物学特征、鉴定、分离、纯化、体外培养以及与SSCs研究中联合使用的新技术进行了总结,以期为SSCs体外培养方法选择及其相关研究提供参考。

芝麻酚对体外培养人结肠癌HCT-8细胞的影响及其机制

目的:探讨芝麻酚对体外培养人结肠癌HCT-8细胞的影响及其机制。方法:体外培养人结肠癌HCT-8细胞,分为对照组、芝麻酚50μmol/L组、芝麻酚100μmol/L组和芝麻酚250μmol/L组共4组,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测各组不同作用时间细胞增殖率,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测各组Janus激酶2/信号转导与转录激活因子3(JAK2/STAT3)信号通路相关蛋白、增殖相关蛋白和凋亡相关蛋白表达水平。结果:经芝麻酚处理24、48、72 h后,HCT-8细胞的OD值从高到低依次为对照组>芝麻酚50μmol/L组>芝麻酚100μmol/L组>芝麻酚250μmol/L组,HCT-8细胞的抑制率从低到高依次为对照组<芝麻酚50μmol/L组<芝麻酚100μmol/L组<芝麻酚250μmol/L组,差异有统计学意义(P<0.05);经芝麻酚处理后HCT-8细胞凋亡率从低到高依次为对照组<芝麻酚50μmol/L组<芝麻酚100μmol/L组<芝麻酚250μmol/L组,差异有统计学意义(P<0.05);各组JAK2/GAPDH和STAT3/GAPDH蛋白表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);芝麻酚处理后HCT-8细胞中p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白表达水平从高到低依次为对照组>芝麻酚50μmol/L组>芝麻酚100μmol/L组>芝麻酚250μmol/L组,差异有统计学意义(P <0.05);芝麻酚处理后HCT-8细胞中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、c-Myc和B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)蛋白表达水平从高到低依次为对照组>芝麻酚50μmol/L组>芝麻酚100μmol/L组>芝麻酚250μmol/L组,差异有统计学意义(P<0.05);芝麻酚处理后HCT-8细胞中Bax蛋白表达水平从低到高依次为对照组<芝麻酚50μmol/L组<芝麻酚100μmol/L组<芝麻酚250μmol/L组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:不同剂量芝麻酚均对体外培养人结肠癌HCT-8细胞具有抑制增殖、诱导凋亡作用,其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路的激活有关。

不同孕期羊水间充质干细胞体外培养方法的比较

背景：以往对羊水间充质干细胞的培养多采集孕中期羊水,对妊娠其他阶段羊水进行间充质干细胞培养的研究还很少,特别是系统地对不同孕期羊水和不同培养基进行间充质干细胞培养的效果还未见报道。目的：比较不同孕期羊水中间充质干细胞体外培养的效果。方法：采用两种不同细胞培养基分别对60份妊娠时间为15~42周的羊水进行间充质干细胞的分离培养,观察间充质干细胞培养过程中生长状况及间充质干细胞培养成功率;细胞化学染色法检测间充质干细胞的化学性质;MTT法检测传代后间充质干细胞的生长曲线。结果与结论：采用含体积分数为10%胎牛血清的PRMI-1640培养基和AmnioMAXⅡ complete羊水专用细胞培养基对孕期为37~42周羊水的间充质干细胞培养成功率分别为8%和44%,孕期为21~36周羊水的间充质干细胞成功率分别为20%和60%。而孕期为15~20周的羊水用两种培养基培养成功率为100%。细胞化学染色结果显示：POX、SB（-）,ACP、PAS、AENE（＋）,而NAP有1%为（＋）,不同孕期染色结果无差异。MTT法测定羊水间充质干细胞的生长曲线呈＂S＂形。孕期在15~36周的羊水间充质干细胞可以传15代以上仍然旺盛,而孕期为37~42周的羊水间充质干细胞传10代即表现为生长缓慢。结果表明采用AmnioMAXⅡ complete羊水专用细胞培养基可以明显提高晚期羊水间充质干细胞培养的成功率。羊水的最佳采集时间为15~20周。背景：以往对羊水间充质干细胞的培养多采集孕中期羊水,对妊娠其他阶段羊水进行间充质干细胞培养的研究还很少,特别是系统地对不同孕期羊水和不同培养基进行间充质干细胞培养的效果还未见报道。目的：比较不同孕期羊水中间充质干细胞体外培养的效果。方法：采用两种不同细胞培养基分别对60份妊娠时间为15~42周的羊水进行间充质干细胞的分离培养,观察间充质干细胞培养过程中生长状况及间充质干细胞培养成功率;细胞化学染色法检测间充质干细胞的化学性质;MTT法检测传代后间充质干细胞的生长曲线。结果与结论：采用含体积分数为10%胎牛血清的PRMI-1640培养基和AmnioMAXⅡcomplete羊水专用细胞培养基对孕期为37~42周羊水的间充质干细胞培养成功率分别为8%和44%,孕期为21~36周羊水的间充质干细胞成功率分别为20%和60%。而孕期为15~20周的羊水用两种培养基培养成功率为100%。细胞化学染色结果显示：POX、SB（-）,ACP、PAS、AENE（＋）,而NAP有1%为（＋）,不同孕期染色结果无差异。MTT法测定羊水间充质干细胞的生长曲线呈＂S＂形。孕期在15~36周的羊水间充质干细胞可以传15代以上仍然旺盛,而孕期为37~42周的羊水间充质干细胞传10代即表现为生长缓慢。结果表明采用AmnioMAXⅡcomplete羊水专用细胞培养基可以明显提高晚期羊水间充质干细胞培养的成功率。羊水的最佳采集时间为15~20周。

小鼠耳蜗毛细胞体外培养研究方法

目的建立耳蜗Corti器体外培养模型.方法取刚出生2～3天小鼠耳蜗,采用鼠尾胶表面平铺培养并结合荧光染色方法观察耳蜗毛细胞的生长情况.结果耳蜗基底膜经1～5天培养,内、外毛细胞和支持细胞生长良好,排列有序,无任何衰亡和缺损.结论耳蜗Corti器可以在体外培养环境存活一定时间并健康生长.

牛体外受精技术的研究——单层细胞预培养时间对牛早期胚胎体外培养效果的影响

将2469枚经体外成熟、体外受精后获得的牛早期胚胎(2～8细胞阶段)随机放入7组不同日龄(分别预培养0～9天)的牛卵泡颗粒细胞单层细胞滴中进行“复合”培养,然后观察这些胚胎在体外培养条件下继续发育至囊胚和孵化囊胚阶段能力的差异。结果随单层细胞预培养时间的延长(0～4天内),牛早期胚胎的囊胚发育率、发育速度及囊胚胎孵化率均呈逐渐升高的趋势;尔后,培养效果又稍有下降。经统计学检验,各组间囊胚发育率(31.7～39.2%)和囊胚孵化率(61.1～72.6%)及7日龄囊胚发育比率(41.8～58.5%)均无显著差异(P>0.05)。这表明,利用不同预培养时间(0～6天)的颗粒细胞单层与牛早期胚胎“复合”培养,都同样具有促进胚胎在体外条件下发育到囊胚和孵化囊胚阶段的能力,但以使用预培养2～4天单层细胞进行“复合”培养效果较佳。

大鼠神经干细胞体外培养

目的:介绍一种较成熟的大鼠神经干细胞体外培养方法。方法:取新生大鼠(1d之内)侧脑室前角周围的脑组织,用EDTA:胰蛋白酶(1:1)消化,制成单细胞悬液,以2-5×105个细胞/ml接种于无血清培养基中。观察其增殖、分化情况,并用nestin、GFAP、NSE免疫细胞化学对细胞进行定性。结果:培养细胞呈悬浮生长,具有增殖能力,倍增时间为2d,nestin阳性。诱导分化后细胞贴壁生长,体积增大,并发出形态各异的突起。可见GFAP和NSE阳性细胞。结论:培养细胞经鉴定为神经干细胞。本方法简单、易操作,可行性强。

鸡胚胎体外培养的研究

鸡胚体外培养系统包括 :将鸡胚从蛋壳中取出转入代用蛋壳Ⅰ中补加蛋清至满 ,用保鲜膜封口固定 ,38℃、翻蛋角 90°、RH40 %孵化 72h ,然后转入代用蛋壳Ⅱ中用保鲜膜封口固定 ,38℃、翻蛋角 40°、RH5 0 %孵化至 1 8d ,之后转入恒温箱停止翻蛋在 37 5℃、RH6 0 %的条件下孵化至出雏。通过以上培养系统 ,在手工翻蛋 (4次 /d)的情况下分两组处理 1 7只鸡胚 ,孵化率为 1 1 8% (2 /1 7) ,两只雏鸡中一只为弱雏 ;在自动翻蛋 (1次 /h)的情况下处理 40只鸡胚 ,孵化率为 2 2 5 % (9/4 0 )。孵出的小鸡经正常饲养能够长大并产卵。通过自动翻蛋体外培养系统可以获得满意的效果。实验过程中发现 ,两次转移对胚胎和卵黄造成的损伤、卵黄膜与代用蛋壳的粘连。

骨碎补总黄酮对成骨细胞体外培养作用的机制研究

目的: 研究骨碎补总黄酮不同剂量组对成骨细胞体外培养的作用机理。方法: 购买UMA 106 01成骨细胞株进行成骨细胞培养, 观察碱性磷酸酶 (ALP) 活性和3H TdR掺入的情况。结果: 骨碎补总黄酮能提高用UMR 106细胞培养的细胞内ALP活性, 并且在不同时间 24、48、72h有相应变化, 有一定的量效、时效关系, 以 48h最为理想。骨碎补总黄酮对3H TdR的掺入 48h比 24h有明显增加, 有时效关系。结论: 骨碎补总黄酮对成骨细胞分化和增殖均有促进作用。

牛附红细胞体体外培养试验

用RPMI 164 0、M 199、D MEM 3种培养液作为基础培养基 ,再分别按体积分数加入 40 %的犊牛血清 ,采用普通恒温培养箱 (3 7℃ )进行牛附红细胞体体外培养。结果表明 ,牛附红细胞体在RPMI 164 0培养基中 ,每 12h更换 1次培养液 ,并补充适量正常红细胞 ,获得了高达 99%的感染率 ;连续传代培养可达 44代以上。

补阳还五汤药物血清对体外培养大鼠皮层神经元缺氧后p53和p21表达的影响

目的:探讨补阳还五汤对体外培养大鼠皮层神经元缺氧凋亡的作用,以及对神经元缺氧过程p53、p21基因表达的影响。方法:采用Daniel方法建立神经元缺氧凋亡模型,加入补阳还五汤药物血清,应用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色法经流式细胞仪检测神经元凋亡率,免疫组化法流式细胞仪检测p53和p21的表达。结果:补阳还五汤显著抑制缺氧导致的神经元凋亡,下调p53和p21基因的表达。结论:补阳还五汤对神经元缺氧凋亡有抑制作用,p53和p21基因表达下调是其机制之一。

大鼠脑的神经干细胞的体外培养、增殖和分化

采用无血清培养基分离和培养大鼠脑的神经干细胞,并通过免疫荧光细胞化学技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向分化潜能的鉴定。鉴定结果表明,所分离培养的细胞为大鼠神经干细胞,具有神经干细胞的特征,并可在体外大量增殖和较长期培养,可经诱导分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞,是进行诱导分化的良好细胞模型。本文讨论了神经干细胞传代培养中应予以注意的问题和对策。