体细胞克隆技术扩繁超细型二狼山绒山羊的应用研究

【目的】通过体细胞克隆技术生产超细型二狼山绒山羊克隆个体,为该技术在地方优质羊品种资源扩繁及新品种培育中的应用提供理论依据。【方法】选择1只4岁龄羊绒细度为13.89μm的二狼山绒山羊(♂),采集耳组织并分离培养成纤维细胞,以其为供体细胞,利用体细胞克隆技术开展超细型二狼山绒山羊的扩繁研究,通过克隆羊体重、羊绒细度、繁殖性能等指标评估该技术的可行性。【结果】试验成功建立了稳定的山羊卵母细胞体外成熟培养及体细胞克隆技术体系,卵母细胞成熟率为44.8%,孤雌激活卵裂率、囊胚率分别为83.0%、22.4%;二狼山绒山羊克隆胚的卵裂率、囊胚率分别为77.8%、13.7%。获得5只克隆羊个体,其生长发育正常,二狼山绒山羊母羊自然交配共获得16只健康的F1代个体,具有正常繁殖能力。克隆个体羊绒细度极显著低于同龄对照个体(P<0.01)。【结论】本研究通过体细胞克隆技术成功克隆了超细型二狼山绒山羊个体,其具备正常生产性能和繁殖性能,并保留了超细羊绒的特性,为地方优良羊种质资源扩繁和新品种培育应用研究奠定了基础。

利用体细胞克隆技术扩繁超级公猪的应用价值分析

培育超级公猪用于生产优质商品猪是种猪育种企业的理想目标。常规育种技术选育种公猪时,受测定群体规模及选择强度的影响,仅能培育出少量的超级公猪。同时,少量的超级公猪受到时间、空间、公猪利用效率的限制,根本无法满足养猪业的巨大需求。利用体细胞克隆技术可以在不改变动物基因的前提下批量复制优秀个体。国内外多家单位通过体细胞克隆技术在地方猪遗传资源保护、猪育种新材料创制与新品种培育、人类疾病模型制备、人类异种器官移植、生物反应器等领域做了大量研究。本文对利用体细胞克隆技术扩繁超级公猪在养猪生产中的应用现状进行了综述,并分析和展望了其在养猪行业的巨大应用价值和广阔前景。

具野稻细胞质的胞质型雄性不育系的体细胞克隆变异II.体细胞克隆温敏核不育突变

在胞质型水稻雄性不育系IR66707A和IR69700A经离体培养而获得的136个体细胞克隆中,发现了温敏核不育突变5例。这类突变体在广州地区的自然气候下,早季至晚季前期表现为不育,晚季后期表现为可育。盛夏,在幼穗发育至花粉形成阶段对部分突变材料进行短日照处理,发现对短日照敏感的不育系农垦58S转换为可育,而供试的5例突变及另一对照培矮64S却与未经处理的材料一样仍表现为不育,表明它们的育性与日照长度的变化无关。在同一发育时期进行低温处理的结果显示,低温处理10d及10d以上者可发生育性转换,自交结实率在17.23%-42.19%之间,而未经处理的材料仍然表现不育,表明它们的育性转换与温度有关。以正常品种为父本与突变体杂交,F1全部为可育;F2可育与不育个体的分离比为3:1;以F1为父本与之测交,TF1代中可育与不育个体的分离比为1:1。遗传分析表明,这种温敏核不育突变为一对隐性核基因所控制。获得了由胞质型雄性不育变为胞核型雄性不育的突变体,这在体细胞克隆变异领域中是一种典型的突变。

体细胞克隆山羊微卫星DNA分析

用 10对山羊微卫星DNA多态性引物对 2只体细胞克隆济宁青山羊、青山羊供体细胞、受体奶山羊母羊以及具有亲缘关系的 3只对照济宁青山羊进行微卫星DNA分析 .结果表明有 5对山羊微卫星DNA多态性引物 ,即SR CRSP1,SR CRSP5 ,SR CRSP6 ,SR CRSP7和SR CRSP2 4 ,扩增产物有明显的多态性 .扩增产物经过 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染 ,结果 2只体细胞克隆山羊的微卫星DNA指纹与供体细胞完全相同 ,而且不同于其受体母亲也不同于其他所有同品种不同个体的对照青山羊 .证明体细胞克隆山羊基因组来源于供体细胞 .

陕北白绒山羊种公羊的体细胞克隆

【目的】利用体细胞核移植技术克隆陕北白绒山羊优秀种公羊个体。【方法】以特别优秀成年陕北白绒山羊种公羊耳部皮肤成纤维细胞为供体细胞,体外培养成熟的陕北白绒山羊卵母细胞作为受体,利用显微操作方法对成熟卵母细胞进行去核操作,然后将供体细胞注射到其卵周隙内,经电融合将其导入去核卵母细胞内形成核移植重组胚。利用钙离子载体Ionomycine联合蛋白酶抑制剂6-甲基氨基嘌呤(6-DMAP)对核移植重组胚进行激活处理,挑选激活后完整的胚胎继续进行体外培养,然后在2～16细胞期时将克隆胚胎移植到相应的同期发情受体母羊体内,利用PCR-RFLP技术鉴定克隆羊。【结果】构建了体细胞核移植胚胎253枚,重组胚胎的融合率为71.54%(181/253),体外培养后的卵裂率为68.33%(123/180),囊胚发育率为25.20%(31/123);在此基础上,构建了537枚克隆胚,将其中卵裂的359枚分别移植到32只代孕母羊体内,移植60d后,有2只受体母羊确认妊娠,最终1只受体母羊妊娠第4月流产出2只死羔;另1只受体母羊维持到期并顺产体细胞克隆羊1只。经遗传学鉴定,2只流产羊羔与1只存活个体均为体细胞核移植后代。【结论】获得陕北白绒山羊克隆个体,建立了相对完善的陕北白绒山羊克隆技术体系。

Mash2基因在体细胞克隆牛肺脏中DNA甲基化状态分析

体细胞核移植(体细胞克隆)技术在动物生产、医药工业、治疗性克隆以及对珍稀濒危动物的拯救有重要意义,然而克隆效率低下以及克隆动物发育异常,严重制约了克隆技术的发展和应用.在体细胞核克隆中,供体核来自高度分化了的体细胞,发生在核移植后几小时内供体核的重编程,决定了克隆胚胎的发育能力.印记基因是由等位基因表观遗传修饰的不对称导致的基因表达具有亲本选择性,而DNA甲基化是调控印记的一个主要方式.印记基因Mash2在胚胎发育和器官形成过程中起着非常重要的作用.为了探求核移植过程中Mash2基因DNA甲基化的表观重编程是否充分,利用亚硫酸氢盐测序法对出生48h内死亡的体细胞核移植牛和正常对照牛肺脏中Mash2基因的DNA甲基化状态进行分析.结果显示,尽管位于Mash2基因启动子和第一个外显子处的CpG岛在正常牛和克隆牛中甲基化水平都不高(20.04%,5.55%),但克隆组的甲基化水平仍显著低于正常对照组(P<0.05).甲基化模式正常组中9N3有5种不同的形式,9N4仅1种;而克隆组9C3和9C5也分别是1种.推测Mash2基因的异常DNA甲基化很可能是导致克隆牛肺脏发育异常的一个重要原因.

体细胞克隆牛和转基因体细胞克隆牛的遗传学分析(英文)

分析了来自同一细胞系的体细胞克隆牛甜甜、庆庆、浒娃及来源同一培养转基因体细胞系转基因体细胞克隆牛九妹、乐娃和 1个妊娠 8个月转基因流产胎牛 8C2以及随机抽取的 1头鲁西黄牛 (LX)、 1头褐斯坦牛 (HS)在 2 4个微卫星位点标记牛的基因型 .结果表明 2 4个多态位点均表现出多态 ,等位基因数为 1～ 5个 ,平均为 3 17个 .根据网上公布的数据 ,按其最高频率计算 ,甜甜、庆庆、浒娃、九妹、乐娃、 8C2与培养细胞系、转基因细胞系间匹配概率为 1 17× 10 -3 6,根据本研究观察到的数据计算 ,匹配概率为 1 90× 10 -2 3 ;而与随机抽取的 1头鲁西黄牛及褐斯坦牛的基因型分别在 2 3和2

内蒙古白绒山羊的体细胞克隆

内蒙古白绒山羊是具有悠久历史的绒肉兼用的品种,对荒漠和半荒漠环境有较强的适应性.山羊绒是来自绒山羊的细绒毛,具有极高的商业价值.为了扩大优秀绒山羊数量,本试验尝试利用体细胞克隆技术进行绒山羊克隆研究.从一只成年优秀公绒山羊中,取其耳缘组织,培养获得成纤维细胞.从当地屠宰场获得山羊卵巢,抽取卵母细胞并体外培养成熟.然后以绒山羊成纤维细胞为核供体,通过体细胞克隆技术生产克隆胚胎.核移植重构胚的融合率、卵裂率和囊胚发育率分别为75.8%,72.6%和11.6%.将处于1-至2-细胞期的胚胎移植入同期发情受体母山羊输卵管中,于2009年4月30日诞生了一只克隆绒山羊.该克隆羊的生长状态及产绒量与细胞核供体山羊相一致,呈现良好的发育态势,说明体细胞克隆技术可以成为良种绒山羊的扩繁途径.

我国体细胞克隆牛的研究进展

近年来,由于体细胞克隆技术在畜牧业生产、疾病治疗、生物学基础理论研究及濒危动物保护等诸多领域所蕴藏的巨大应用价值,克隆效率成为科学界研究的热点问题。对克隆技术的相关影响因素进行了综述,研究表明,不同细胞系影响到体细胞克隆牛效率,胎儿细胞和颗粒细胞重构胚的囊胚发育率、犊牛成活率比成年成纤维细胞高。关于卵母细胞和克隆胚胎冷冻保存的研究表明,玻璃化冷冻法可以用于克隆胚胎以及卵母细胞的冷冻保存。在此基础上,讨论了国际上哺乳动物体细胞克隆研究新进展和体细胞克隆的效率,指出体细胞克隆中亟待解决的问题。

成纤维生长因子(FGF2)和成纤维生长因子受体(FGFR1)在新生死亡体细胞克隆牛组织中的表达

为了探讨成纤维生长因子及其受体在克隆动物出生死亡以及器官发育异常中的可能作用,本研究用荧光定量RT-PCR技术分析了成纤维生长因子基因(FGF2)及成纤维生长因子受体基因(FGFR1)在来自2种供体细胞(成年成纤维细胞和胎儿成纤维细胞)的出生死亡克隆牛的6个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑)中的表达。结果表明:FGFR1的表达在来自两种供体细胞的体细胞克隆牛的心脏(P<0.05)和肝脏(P<0.05)显著升高,FGF2基因在体细胞克隆牛组织中的表达未发现异常。由于FGFR1在胚胎发育和器官形成中起重要作用,所以FGFR1的异常表达可能是造成克隆动物出生死亡以及器官发育异常的原因之一。

延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤的初步研究

为了优化体细胞克隆胚胎体外培养液,提高体细胞的克隆效率,以CR1aa+5%FBS+0.3%BSA为基础培养液,分别添加0、60、80、100和120μmol/LH2O2观察延边黄牛体细胞克隆胚胎的氧化损伤情况和体外发育模式,并研究1、4和7 mmol/L GSH对延边黄牛重组胚的保护作用。结果表明:(1)添加0、60、80μmol/LH2O2组卵裂率显著要高于100μmol/L和120μmol/L组(P<0.05),添加H2O2的组囊胚发育率显著低于未添加组(P<0.05);(2)随着H2O2处理浓度的升高,重组胚发育速度增加,但是发育停滞现象也更明显;(3)在培养液中添加GSH后,1 mmol/L组卵裂率显著高于7 mmol/L组(P<0.05),与0和4 mmol/L组差异不显著(P>0.05),囊胚发育率显著高于其它组(P<0.05)。可见,在体细胞克隆胚胎体外发育过程中H2O2对其具有氧化损伤作用,不利其体外发育,在培养液中添加1 mmol/L GSH对体细胞克隆胚胎的氧化损伤具有明显的保护作用。

受体母猪排卵状况对体细胞克隆胚胎移植效率的影响

为了确定猪体细胞克隆胚胎的受体母猪最佳发情阶段，本研究比较了供受体同期化方案对猪体细胞克隆胚胎输卵管内移植后30d受胎率和妊娠足月率的影响。将体外培养2d的猪体细胞克隆胚胎，移植到发情第1～2天的受体母猪。根据受体母猪卵泡发育与排卵状况将受体猪群分为2个类别：卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段（组一）；卵泡发育处于排卵前阶段或完全排卵阶段（组二）。结果发现：（1）组一6头受体母猪胚胎移植后30d受胎率为100％；而组二10头受体母猪受胎率为40％，二者差异显著（P〈0．05）。（2）组一6头受体母猪全部产仔，妊娠足月率为100％；组二10头受胎母猪2头产仔，妊娠足月率为20％，二者差异极显著（P〈0．01）。以上结果表明：体外培养2d的猪体细胞克隆胚胎发育阶段与即将排卵或正在排卵的受体母猪的子宫环境同期性最好，得到了理想的胚胎移植效率。

牛体细胞克隆胚胎类ES细胞集落的筛选及其核移植

对第 7d的牛体细胞克隆囊胚进行体外增殖培养 ,分离筛选类ES细胞 ,并对其进行了传代培养。接种在饲养层上的体细胞克隆囊胚细胞 ,在传代的 2 4h内增殖形成小集落 ,2～ 3d有雀巢状的集落出现 ,筛选形态相同的细胞集落进行传代培养 ,4～ 5代后 ,皿底出现多个大小不等的多细胞单层集落。将传 4～ 5代的细胞集落接种到无饲养层的 4孔培养皿中培养 ,2 4h出现多细胞单层集落 ,4～ 7d长满皿底 ,并形成上皮样细胞 ,呈网状 ,将其作为核供体细胞进行核移植实验。结果有 80 % (40 5 0 )核 质融合的移核重构胚发生卵裂 ,5 % (2 4 0 )发育至桑椹胚期 ,2 5 % (1 4 0 )发育至囊胚期 ,92 5 % (37 4 0 )停止在 2～ 4细胞期。结果表明 :采用牛体细胞克隆胚胎的类ES细胞进行核移植 。

一例体细胞克隆水牛肺、脾脏的组织结构观察

应用石蜡切片及HE染色技术对体细胞克隆水牛的肺脏及脾脏形态进行了详细的观察。结果表明,体细胞克隆水牛的肺脏结构不清楚,细支气管管壁内的皱壁消失,肺泡相互挤压在一起,肺内含有大量胶原纤维和弹性纤维;脾脏白髓的淋巴组织以弥散性为主,脾窦内填充有大量黏液,血液含量少,整体染色偏蓝,表明淋巴组织没有得到正常的发育。

应用负压气相培养系统生产体细胞克隆牛的研究

以 - 35℃低温冷冻保存 3个月的Vari Fe 8mos和Fahru Fe 9mos死亡牛胎儿皮肤上皮细胞 ,为核供体细胞 ,应用点击去核方法 ,和 - 30 0mmHg、2 %CO2 、8%～ 10 %O2 、38.5℃和 10 0 %湿度负压气相培养系统 (负压组 ) ,进行了克隆牛试验研究 ,并与吸引和挤压及常压培养法进行了比较。结果表明 ,采用点击去核法对体外成熟培养18h、2 2h、2 4h的卵母细胞进行去核 ,去核成功率分别为 90 .0 %、75 .8%和 5 5 .6 %,18h组显著高于 2 2h组 (P <0 .0 5 ) ,极显著高于 2 4h组 (P <0 .0 1) ;而且 ,点击去核法去核率为 90 .0 %,极显著地高于吸引法的 6 8.3%(P <0 .0 1) ,与挤压法去核率 88.3%差异不显著 ;采用点击去核法囊胚发育率达 34 .1%,显著高于吸引法的 18.0 %(P <0 .0 5 ) ,与挤压法的 2 0 .9%差异不显著。负压组重构胚的卵裂率达 70 .0 %,显著高于常压组的 6 3.8%(P <0 .0 5 ) ,负压组囊胚发育率达 35 .8%,极显著高于常压组的 2 3.2 %(P <0 .0 1) ,负压组克隆囊胚细胞数为 10 8± 3.3个 ,极显著多于常压组的 98± 3.3(P <0 .0 1)。将第 6天的克隆桑椹胚和囊胚每 2～ 3枚装入 1支 0 .2 5ml塑料细管中 ,移植给同期发情处理的 5头受体奶牛的黄体侧子宫角中 ,最终获得 2头牛妊娠 ,并于 2 0 0 1年 11月 3日和 11月

籼稻体细胞克隆雄性不育系54257/162-5及其保持系

本文报道了籼稻雄性不育系54257/162-5的基本特性,其母本54257及父本162-5均为离体培养起源的体细胞无性系,分别来自 IR_(54)及IR_(52)。 不育系54257/162-5已回交8代,不育株率100％,自交不结实。花粉败育方面,部分个体表现为典败,部分个体表现为染败,或典败与染败兼而有之。试验表明,不育系54257/162-5个体间这种花粉败育的“分离”并非父本不纯所致,乃该不育系固有的特点。 以114恢、测64、IR_(24)、3550、测222及丰桂6号等6个野败型不育系之恢复系与野败不育系及 54257/162-5测交,恢复程度有较大差异。只有3个(114恢、测64及测222)能使54257/162-5的育性恢复;2个(IR_(24)及3550)只能达到半恢复;有1个(丰桂6号)不仅不能恢复,而且保持了其雄性不育。这表明,不育系54257/162-5与野败不育系在细胞质上可能既有相似的一面,也有相异的一面。 讨论了保持系体细胞克隆162-5的基因型,认为它是由恢复系IR_(52)经离体培养直接变为保持系。这在体细胞无性系变异中尚属首例。

体细胞克隆猪的研究进展

哺乳动物克隆不仅可以保护濒危动物 ,而且与干细胞工程技术相结合能应用于克隆性治疗 ,是目前生物技术领域研究的热点之一 ,具有重大的科学意义和应用价值。由于体细胞克隆猪在人类器官移植方面具有巨大的应用潜力 ,已成为当今体细胞克隆研究的热点。从 2 0 0 0年开始 ,在不同国家相继诞生了体细胞克隆猪及转基因猪 ,但是其成功效率很低 ( 1 %～ 2 % )。主要综述了影响体细胞克隆猪的几个因素 ,涉及胞质受体、供核细胞、显微操作。

一例体细胞克隆黄牛肺脏的组织结构观察

作者应用石蜡切片及HE染色技术对体细胞克隆黄牛的肺脏及其细胞类型和形态进行了详细的观察。结果表明,光镜下,该体细胞克隆黄牛肺脏的组织结构与自然繁殖的黄牛肺脏的组织结构基本一致,包括支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊及肺泡等结构,但体细胞克隆黄牛的细支气管管壁内的皱壁消失,其黏膜以单层立方上皮为主;肺泡处于半充容状态,肺泡腔狭小,肺泡膈较厚,其中含有较多胶原纤维和弹性纤维。肺泡壁的细胞结构不清,肺泡腔内有内容物,可能是发生病变引起。

哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展

哺乳动物体细胞克隆技术在动物育种及珍稀动物保护领域具有极其广阔的应用前景,但极低的成功率限制了这项技术的应用。相关学者从不同方面进行了研究,试图提高体细胞克隆技术的成功率。综述了近年来哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展,为其相关研究提供必要的参考。

牛磺酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

研究了体外培养液中添加不同浓度的牛磺酸对重组胚发育率的影响。试验中设计了4个牛磺酸浓度组,分别是0、7.0、14.0、21.0 mmol/L。各浓度组之间的卵裂率没有差异,其中低浓度组7.0 mmol/L的囊胚发育率较其他组高,随着浓度的上升囊胚发育率逐渐降低。体外培养液中添加牛磺酸的最佳浓度为7.0 mmol/L,能够显著提高延边黄牛体细胞克隆牛重组胚的发育率。