仿刺参体腔细胞和血细胞类型及体腔细胞数量研究

本文应用光镜、电镜技术研究了仿刺参(Apostichopus japonicus)体腔细胞和血窦中血细胞的形态、结构、周年体腔细胞总数及主要类型的细胞数量。研究结果表明,仿刺参体腔细胞和血细胞形态结构相同,作者将体腔细胞分为淋巴样细胞、球形细胞、变形细胞、透明细胞、纺锤细胞和结晶细胞,其中球形细胞又分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。血窦中血细胞除未见结晶细胞外,其余与体腔细胞相同。体腔细胞和血细胞均以淋巴样细胞、变形细胞、球形细胞为主,透明细胞、纺锤细胞次之,结晶细胞数量最少。从形态和结构分析,作者认为仿刺参体腔细胞和血细胞来源可能相同。周年平均的体腔细胞总数为(3.85±0.21)×106个/mL,淋巴样细胞为(1.58±0.11)×106个/mL,占细胞总数的(41±1.47)%;球形细胞为(1.16±0.13)×106个/mL,占细胞总数的(30±0.89)%;变形细胞为(0.99±0.07)×106个/mL,占总细胞数的(25±0.98)%,三种主要类型细胞占细胞总数的(96±1.53)%。

虾夷马粪海胆体腔细胞的类型及功能

取平均壳径分别为1 9cm和4 4cm虾夷马粪海胆(Strongylocentrotusintermedius)进行实验观察。结果表明,海胆体腔有2种类型的细胞,即变形吞噬细胞和色素细胞。变形吞噬细胞形状不定,能伸出伪足,核较大,线粒体、溶酶体等细胞器丰富。色素细胞具突起,内有紫红色颗粒,颗粒溶于酒精等多种溶剂中,使得电镜下细胞内含有大量空泡,细胞核很少见,细胞器较少。变形细胞离体后可凝集,具吞噬酵母的能力,吞噬能力与温度成正相关。色素细胞具有辅助的免疫功能。

不同种海胆体腔细胞类型及体液中的酶活力

以中国主要经济海胆马粪海胆（Hemicentrotus Pulcherrimus）、虾夷马粪海胆（Strongylocentrotus intermedius）、光棘球海胆（Strongylocentrotus nudus）、紫海胆（Anthocidaris crassispina）以及杂交种海胆马粪海胆（♀）×虾夷马粪海胆（♂）、虾夷马粪海胆（♀）×光棘球海胆（♂）、马粪海胆（♀）×紫海胆（♂）和紫海胆（♀）×光棘球海胆（♂）为对象，进行海胆的血细胞及体液中酶活力的研究。结果表明，海胆血细胞可分为4类，分别为色素细胞、纤毛游走细胞、变形吞噬细胞和无色球形细胞，比例分别为4．56％～10．96％、9．69％～12．18％、76．40％～85．36％和0．35％～1．03％；海胆血细胞体外有凝聚和吞噬现象。不同种海胆体液中酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（ALP）、超氧化物歧化酶（SOD）和溶菌酶（LSZ）的酶活力测定结果显示，紫海胆血清中各种酶的活性都较高，其中碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性在6种海胆中都是最高的，分别为2．871U／mg和182．149U／mL。马粪海胆（♀）×虾夷马粪海胆（♂）的溶菌酶活性最高，为0．085U／mL；虾夷马粪海胆（♀）×光棘球海胆（♂）的酸性磷酸酶活性最高，为1．070U／mg，但差异均不显著（P〉0．05）。

不同病原菌刺激后仿刺参幼参体腔细胞中免疫相关酶的应答变化

给体质量(6.4±1.1)g的仿刺参体腔注射10~0μL灿烂弧菌、假交替单胞菌、希瓦氏菌和蜡样芽孢杆菌(细菌终密度为10~7~10~8 cfu/mL),以体腔注射10~0μL无菌海水的仿刺参作对照组,注射后0、4、12、24、48、72h和96h取样测定了体腔细胞中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶的活力。结果显示,蜡样芽孢杆菌刺激12h后仿刺参体腔细胞中的酸性磷酸酶活力均高于对照组,其余3种病原菌刺激后的12h也显著高于对照组(P<0.05);在试验菌株刺激后的各个时间点体腔细胞中酚氧化酶活力均低于对照组;在4种病原菌刺激后4h和12h体腔细胞中过氧化氢酶和碱性磷酸酶活力均显著高于对照组(P<0.05);希瓦氏菌刺激后体腔细胞中超氧化物歧化酶活力始终低于对照组。研究结果表明,仿刺参体腔细胞对病原菌的刺激在短时间内有较强的应激防御反应;仿刺参体腔细胞中的酸性磷酸酶可能在应对革兰氏阳性菌的入侵中发挥重要免疫作用;超氧化物歧化酶受到希瓦氏菌的抑制,酚氧化酶对4种病原菌无法产生有效的免疫应答,这可能是4种病原菌导致仿刺参发病的原因之一。

刺参体腔细胞的超微结构观察

应用透射电镜观察刺参(Apostichopus japonicus)体腔细胞的超微结构,结果显示刺参体腔细胞可分为四种类噜型:大颗粒细胞、小颗粒细胞、透明细胞和淋巴样细胞.大颗粒细胞呈圆形,直径约5～10μm,胞内充满1.5～3μm的高电子密度颗粒;小颗粒细胞圆形,直径约7～8μm,细胞颗粒0.5～1.5μm;透明细胞形状不规则,直径约5～7μm,胞质较透明,细胞核大、着色浅,细胞表面常有伪足形成;淋巴样细胞多呈圆形,直径5μm左右,细胞核大、着色深,胞质较少.

蚯蚓体腔细胞彗星试验检测阿散酸在泥浆体系中降解前后的遗传毒性变化

配制不同浓度的阿散酸标准液,与某养猪场附近的表层土壤混合形成泥浆系统,放在摇床上连续培养30d.在第0、1、2、3、4周取出适量降解液,分别用分光光度法测定阿散酸的降解率;用彗星试验检测降解液对赤子爱胜蚓体腔细胞DNA的损伤.结果表明,阿散酸低浓度时在泥浆体系中能被较快降解,500mg/L的降解率达到了25%;蚯蚓体腔细胞彗星试验表明,所有降解液均具有遗传毒性,可导致蚯蚓体腔细胞DNA明显损伤,与对照相比具有显著性差异(P<0.05).

土壤B[a]P叠加污染对蚯蚓体腔细胞SOD、POD和MDA的毒性效应

采用累积试验方法,研究土壤苯并[a]芘（B[a]P）多次叠加污染对赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）体腔细胞超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和丙二醛（MDA）的毒性效应.结果表明,随着土壤中B[a]P暴露时间的延长,蚯蚓体腔细胞的SOD、POD活力和MDA含量呈初期（1～14 d）下降速率较快,尔后（14～56 d）下降速率减小的变化趋势.在叠加污染条件下,0～ 20 cm深度土壤中蚯蚓体腔细胞SOD活力和MDA含量在14d时分别比一次污染低20.97％和15.96％,POD活力比一次污染高20.44％;而在＞20～40 cm深度土壤中蚯蚓体腔细胞SOD、POD活力和MDA含量在14d时分别比一次污染低52.89％、18.00％和70.60％.表明B[a]P叠加污染土壤中蚯蚓体腔细胞的毒性效应低于一次污染.

几种重金属对刺参体腔细胞超氧阴离子(O_2^-)产生的影响

测定重金属(Zn2+、Pb2+、Cd2+、Cu2+)对刺参体腔细胞吞噬过程中超氧阴离子(O2-)产生的影响。结果表明:Cu、Zn、Pb、Cd均能抑制刺参体腔细胞吞噬过程中超氧阴离子(O2-)的产生。低浓度重金属离子Zn2+(1、5、10mg.L-1),Pb2+(0.5mg.L-1),Cd2+(0.05mg.L-1)处理刺参体腔细胞能使其吞噬过程活性氧产生增加;高浓度重金属离子Zn2+(50、100、200mg.L-1),Pb2+(1、5、10、50、100mg.L-1),Cd2+(0.5、5、10、50、100mg.L-1)处理能明显地抑制刺参体腔细胞吞噬过程中的超氧阴离子(O2-)的产生,Cu2+在浓度为0.1mg.L-1时就开始对超氧阴离子(O2-)的产生抑制,随着浓度的加大,抑制作用明显。

仿刺参体腔细胞吞噬与凝集功能及其与温度的关系

采用光镜和电镜技术研究了仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞的吞噬和凝集功能及其与温度的关系。结果表明:仿刺参体腔细胞中球形细胞和变形细胞具有较强的吞噬功能,当异物的大小、性质不同时,其吞噬过程和吞噬能力存在一定差异。当体腔细胞吞噬洋红颗粒时,试验进行6 h其吞噬率最高(48.01%),108 h时吞噬过程结束;当体腔细胞吞噬酵母时,试验进行4 h其吞噬率最高(35.17%),且体腔细胞的凝集现象较多,到96 h时吞噬过程结束。仿刺参体腔细胞的吞噬能力与温度关系密切,18℃下吞噬百分率和吞噬指数最高,12℃下次之,4℃和25℃下最低。仿刺参离体的体腔细胞很快发生凝集反应,且温度和异物刺激都会影响体腔细胞的凝集作用时间和强度。

4种抗凝剂对刺参体腔细胞的抗凝效果

研究了不同浓度的柠檬酸钠、肝素钠、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）和草酸钠对刺参Stichopus japonicus体腔细胞的抗凝效果。结果表明，3．8mg／mL的柠檬酸钠、1．0～1．5mg／mL的EDTA-Na2、0．2～0．6mg／mL的肝素钠、1．0～1．5mg／mL的草酸钠均能较好地保持体腔细胞的形态活性，适合用作刺参体腔细胞的抗凝剂。4种抗凝剂中EDTA-Na2的效果最好。

作为土壤污染生物标志物的蚯蚓体腔细胞提取方法比较

比较了纤维针法(FNE)、电压刺激法(EE)、超声波刺激法(UP)、纤维针与超声波刺激结合法(CM)四种蚯蚓体腔细胞提取方法。结果表明:单位体重细胞数由大到小依次为CM>UP>EE>FNE,细胞的成活率由大到小依次为CM>FNE>EE>UP,其中CM法提取的单位体重细胞数(106个)较多(4.638±0.138)且存活率(%)最高(97.258±0.161)。CM法所提取的体腔细胞能满足作为土壤污染风险评估生物标志物的要求,可以为在细胞水平、亚细胞水平和分子水平对污染土壤开展风险评估提供技术支持。

仿刺参体腔细胞单克隆抗体的制备及特性分析

应用杂交瘤技术制备了4株稳定分泌抗仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对其单克隆抗体的特性进行了分析。结果表明:单抗1C7和1H7主要结合淋巴样细胞,单抗2E8可与所有体腔细胞结合,单抗4E9主要结合球形细胞;单抗2E8、4E9与仿刺参体腔液具有明显的交叉反应,单抗1C7和1H7则与体腔液无交叉反应;单抗1C7和4E9属于IgG1,2E8属于IgG2a,1H7属于IgM亚型;单抗1C7和1H7均可识别相对分子质量为37 000的蛋白,单抗2E8可同时识别相对分子质量为37 000和61 000两种蛋白,单抗4E9可识别相对分子质量为108 000的蛋白。该单抗的制备为进一步研究仿刺参体腔细胞和体腔液之间的关系,体腔细胞的分类、分布、发生、分化及功能提供了新的工具。

仿刺参体腔细胞染色方法的研究

通过改变固定时间、孵育时间、染色时间及温度、分色方式等染色条件，研究不同染料、不同染色条件对仿刺参Apostichopus japonlcus体腔细胞的染色效果，并以观察体腔细胞内的颗粒、细胞核、细胞质和伪足的着色情况和细胞整体轮廓清晰程度为标准，筛选了适用于仿刺参体腔细胞的理想染色方法。结果表明：25℃室温下，采用滴片制片法，用湿盒孵育15～30min，用甲醇固定1～2min，用φ（Wright’s）：φ（Giemsa）=1：1的混合液染色1～2min，水洗，用中性树胶封片，在此条件下对仿刺参体腔细胞的染色效果最好。

仿刺参体腔细胞CD35的化学发光免疫检测

应用化学发光免疫检测(Chemiluminesent Immunoassay,CLIA)技术检测仿刺参Apostichopus japoni-cus体腔细胞CD35。单克隆CD35一抗抗体,用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗,选择对碘苯酚作为发光增强剂,鲁米诺和过氧化氢作为辣根过氧化物酶的底物;对照组用无菌海水代替一抗和二抗,进行化学发光免疫检测。结果显示:试验组发光值(1 321 596.00)和对照组(16 773.20)的发光值差异极显著(P<0.01);仿刺参体腔细胞膜上能够检测到CD35的存在,表明仿刺参体腔细胞膜上具有补体受体。

刺参体腔细胞的电镜制样技术研究

设计2种不同的固定方法,比较2种固定方法在刺参体腔细胞的扫描电镜制样和透射电镜制样中固定效果的优劣。选择能使体腔细胞充分分散的固定方法用于扫描电镜制样;而将能使体腔细胞凝聚成团的固定方法用于透射电镜制样。获得了令人满意的体腔细胞扫描和透射电镜照片。以多聚赖氨酸法、明胶法和聚乙烯醇缩甲醛法收集、黏附固定后的体腔细胞,实验结果显示:3种方法均可起到黏附体腔细胞的作用,通过探讨玻片黏附体腔细胞的有效方法,建立适用于海产无脊椎动物体腔细胞、血细胞、生殖细胞和原生动物、细菌等样品的扫描电镜制样方法。

土壤苯并[a]芘多次叠加污染对蚯蚓体腔细胞抗氧化酶的毒性效应

苯并[a]芘（B[a]P）是具有典型＂三致＂效应的持久性有机污染物, 在土壤中逐步累积, 对土壤环境质量造成潜在的威胁。一次污染条件下, B[a]P进入土壤的过程与较低剂量逐步累积的污染过程存在一定差异, 在一定程度上会高估B[a]P的环境风险。本试验采用一次污染和多次累积污染2种方法, 模拟污染物在土壤中逐步累积的过程, 研究土壤B[a]P叠加污染的有效性特征及其在蚯蚓（Eisenia foetida）体内的富集规律, 分析蚯蚓体腔细胞超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的毒性效应。结果表明, 随着土壤中B[a]P培养时间的延长, B[a]P有效含量、蚯蚓富集量和蚯蚓体腔细胞SOD、POD活性均呈逐渐下降的趋势。在多次叠加污染和一次污染条件下, 土壤B[a]P有效含量在培养前期（1~28 d）下降速率分别为2.37 μg·kg-1·d-1和3.35 μg·kg-1·d -1, 后期（28~56 d）下降速率逐步减缓为0.24 μg·kg-1·d-1和0.53 μg·kg -1·d-1; 蚯蚓体内B[a]P富集量在培养前期（1~28 d）下降速率分别为6.94 μg·kg-1·d-1和14.84 μg·kg-1·d-1, 后期（28~56 d）逐步减缓为0.73 μg·kg-1·d-1和1.64 μg·kg-1·d-1。蚯蚓体内B[a]P富集量与土壤B[a]P有效含量（Tenax吸附提取量）之间呈极显著正相关（P〈0.01）, 相关系数（R2）为0.914 7。蚯蚓体腔细胞SOD和POD活性与土壤B[a]P有效含量和蚯蚓体内B[a]P富集量之间分别呈极显著正相关（P〈0.01）, 相关系数（R2）分别为0.754 3（SOD）、0.829 6（POD）和0.704 0（SOD）、0.727 1（POD）。在叠加污染条件下, 土壤B[a]P有效含量比一次污染低17.1%~38.6%（P〈0.05）, 蚯蚓富集量比一次污染低22.6%~46.8%（P〈0.05）, 蚯蚓体腔细胞SOD和POD活性分别为一次污染酶活性的49.6%~82.7%和75.5%~109.6%, 差异达到显著水平（P〈0.05）。这表明土壤B[a]P多次叠加污染对蚯蚓体腔细胞的毒性效应低于一次污染。

用流式细胞术研究二氢吡啶对刺参体腔细胞免疫功能的影响

给刺参(Apostichopus japonicus)幼参投喂含二氢吡啶(Diludin)的饲料3、6、9、12、18和24 d后,采用流式细胞术测定其体腔细胞的吞噬率和死亡率。结果显示,试验组体腔细胞的吞噬率在6 d后显著升高,死亡率除24d外一直显著高于对照组,但随着时间的延长呈降低趋势。这表明投喂含二氢吡啶的饲料能增强刺参幼参体腔细胞的免疫力。

紫外线对刺参体腔细胞内Ca^(2+)浓度与凋亡的影响

通过激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪,检测紫外线对刺参体腔细胞内Ca^(2+)浓度变化及凋亡的影响。将鲜活刺参随机等分3组:对照组刺参为未经UVA照射;UVA组刺参为经UVA(15 W/m2)照射30min;药物处理-UVA组刺参为钙离子螯合剂(BAPTA-Na,IC50=1.47mmol/L)灌入刺参体腔内后,再经UVA照射30min。刺参经室温避光分别静置0、1、2、3和4h后采集其体腔细胞待检。结果表明,与对照组相比,UVA组刺参体壁"化皮"程度随静置时间延长而逐渐加重,并伴随"吐肠"现象的发生;其体腔细胞内Ca2+浓度随着静置时间的延长而逐渐升高,2h时达到最高值,随后下降;体腔细胞凋亡率在3h后达到最高值,随后降低。药物处理-UVA组刺参体壁"化皮"程度随静置时间延长而未见明显变化;其体腔细胞内Ca^(2+)浓度和细胞凋亡率均显著低于UVA组。推断紫外线照射刺参导致刺参体壁发生"化皮"现象,其体腔细胞内Ca^(2+)浓度的升高促进了细胞凋亡率的上升。

一种发光蚯蚓--磷微蠕蚓(Microscolex phosphoreus)体腔细胞的超微结构

应用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜对磷微蠕蚓(Microscolex phosphoreus)的体腔细胞进行观察,基于各种细胞的形态特征、胞质内细胞器和颗粒组成、伪足形状及行为特征等将其归纳为三类:黄色细胞、阿米巴样细胞、粒细胞。从外观上看,黄色细胞由几个个体较大的黄色细胞体组成,其细胞质内缺少细胞器;阿米巴样细胞呈明显球形或椭圆形的花朵状,经常可见几个至十几个细胞形成聚合体,胞质内细胞器丰富;粒细胞胞质的颗粒是其主要特征,其星状伪足常处于细胞一端,细胞质内细胞器含量比较丰富。本文将磷微蠕蚓的三类细胞与其它种蚯蚓中相关体腔细胞的形态和超微结构进行了异同比较。

铜砷单一污染对蚯蚓体腔细胞的影响

蚯蚓是土壤污染的重要指示者。本实验的主要目标就是要研究重金属对蚯蚓以及参与防御反应的体腔细胞的影响。人工土壤用4个浓度的铜与砷染毒,然后把成熟的赤子爱胜蚓在其中分别放置2、7与14d。结果表明,随着金属离子浓度的增大与时间的增加,蚯蚓的生长率不断降低。中性红保持时间与重金属的剂量有一定的联系,浓度越高,中性红保持时间越短,随着时间的增加甚至会减少为0。黏附细胞吞噬活性与细胞吞饮作用也受到重金属的影响而减弱,这也说明重金属对蚯蚓中与免疫相关的体腔细胞影响较大。或许,免疫功能的破坏导致蚯蚓在重金属污染的土壤中生存活力较差。