香蕉枯萎和细菌性软腐病菌的多重PCR检测

香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense和细菌性软腐病菌Dickeya zeae的复合侵染为害给香蕉产业发展带来严重挑战,有必要建立相关病害的多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)检测技术。本文基于尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 1,FOC1)基因组contig 438区间(35 631-37 693 bp)(GenBank:AMGP01000438.1)和4号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 4,FOC4)基因组contig 195区间(4 028-6 126 bp)(GenBank:AMGQ01000195.1)存在160 bp插入序列差异设计特异扩增引物FOC-F/-R,同时以香蕉细菌性软腐病菌D.zeae的促旋酶B亚单位基因(the subunit B of gyrase gene)(GenBank:JQ284039)序列设计特异扩增引物gyrB-F/-R。多重PCR检测结果显示:本技术可在一次PCR扩增反应内同时检测香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种和细菌性软腐病菌;多重PCR的灵敏度结果表明:检测香蕉枯萎病菌的DNA浓度最低限为0.1 ng/μL,细菌性软腐病菌的灵敏度为103cfu/mL;检测结果稳定可靠。因此,本研究建立的多重PCR检测方法可有效应用于检测香蕉发病组织中的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌,也可用于香蕉种苗和田间土壤带病菌的监测,为香蕉种植保驾护航。

蓝莓枝枯病拮抗细菌HMQAU140045的鉴定和抑真菌活性

以蓝莓毛色二胞枝枯病菌假可可毛色二胞Lasiodiplodia pseudotheobromae为靶标菌,通过稀释平板法从山东青岛的蓝莓种植园根际土壤中分离出20株细菌,采用对峙平板法和菌丝生长速率法筛选得到一株对靶标菌具有明显抑制效果的拮抗菌株HMQAU140045,采用凹玻片法和菌丝生长速率法测定该菌株发酵滤液对靶标菌孢子萌发和菌丝生长的影响。结果表明,稀释50倍的发酵滤液的抑制率可达100%。离体枝条试验结果表明,发酵液不同组分对蓝莓毛色二胞枝枯病的防治效果均可达90%以上。菌丝生长速率法测定结果表明,该菌株抑真菌谱广,对包括4种蓝莓枝枯病菌在内的15种植物病原真菌具有良好的拮抗作用。通过形态观察、生理生化特性以及gyr B的序列分析,确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。试验结果表明,解淀粉芽孢杆菌菌株HMQAU140045具有较好的抑真菌活性。

环介导等温扩增联合横向侧流试纸(LAMP-LFD)对嗜水气单胞菌快速检测方法的建立

以嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因为检测靶标,设计6条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记探针,建立了嗜水气单胞菌的LAMP-LFD快速检测方法。该方法的流程可简单概括为将生物素标记的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)产物与FITC标记的探针进行特异性杂交,并使用横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)完成检测。经优化,LAMP最佳反应条件为63℃,反应30min,从LAMP扩增到LFD结果判读仅需40min,比常规PCR检测缩短近2h。试验结果表明,LAMP-LFD可特异性检出嗜水气单胞菌,对鳗弧菌等常见水产或食源性病原菌检测结果为阴性;其针对细菌纯培养物的检测灵敏度达2.03×101 CFU/mL或0.81CFU/反应,是常规PCR(以F3/B3为引物)的100倍;可从人工污染1×102 CFU/mL浓度的嗜水气单胞菌的鲫鱼肝组织匀浆样品中检测到细菌。嗜水气单胞菌(106 CFU)人工感染鲫鱼24h,传统的细菌分离培养方法可获得肝、肾的载菌量分别为1.2×105 CFU/g和6×103 CFU/g;利用LAMP-LFD技术可成功从鲫鱼的肝、肾组织中检测出该病原;以F3/B3为引物的PCR方法仅能从感染鲫鱼的肝组织中检测到该病原菌,表明面对实际感染样品,LAMP-LFD的检测灵敏度优于PCR方法。因此,该方法可快速、灵敏、特异地检测出嗜水气单胞菌,而且操作简单,仪器设备依赖性低,有望成为嗜水气单胞菌现场检测的常规技术手段。

草鱼出血病混合感染的嗜水气单胞菌的分离、鉴定与理化特性

从患出血病草鱼的肝脏病灶中分离筛选出2株致病菌。取病鱼样品组织过滤液接种CIK细胞、培养,电镜下观察到细胞质中含有草鱼呼肠孤病毒样颗粒和包涵体,病毒颗粒大小65nm～70nm,包涵体0.46μm～1.81μm。人工回归感染实验显示分离的菌株及细胞毒悬液均能使草鱼致病死亡。对分离菌株进行细胞形态学、理化特性分析及药敏试验,初步判定所分离的2株菌均为嗜水气单胞菌。进一步对菌株进行DNA分子鉴定,结果显示2株菌的16SrRNA基因、促旋酶亚单位蛋白(gryB)基因均与GenBank上的嗜水气单胞菌相应的基因具有较高的同源性。在根据已知序列分别构建的2个基因的分子系统进化树中2株菌均与嗜水气单胞菌聚类。同时2个菌株均可扩增到气溶素基因(aerA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahpA),提示它们均可能为嗜水气单胞菌强毒株。综合人工回归感染实验与毒力基因鉴定结果可认为所分析的草鱼出血病病例存在着病毒与嗜水气单胞菌的混合感染。