伤害诱导普通白木香与奇楠种质沉香中倍半萜类成分及早期倍半萜合酶基因表达的差异分析

目的:明确伤害诱导普通白木香和奇楠种质所结沉香中倍半萜组分及其早期倍半萜合酶基因表达模式的差异。方法:采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析普通沉香和奇楠沉香中倍半萜组分的差异;对3年生普通白木香和奇楠种质茎干分别进行全断干伤害,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析伤害早期倍半萜合酶基因AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS18、AsTPS20、AsTPS23表达模式的差异。结果:奇楠沉香倍半萜组分显著不同于普通白木香所结沉香,2种沉香中分别检测到16、17个倍半萜成分,其中共有成分12个,且共有成分含量差异较大;两者的倍半萜合酶基因在伤害诱导早期表达模式也不同,伤害诱导24 h内,普通白木香中7个倍半萜合酶基因表达水平均上升,2 h达到最大值后下降,而奇楠种质中AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17和AsTPS23基因表达量在24 h内持续上升,AsTPS20基因表达量在6 h达到最大值,但AsTPS18基因表达量低,在伤害诱导0~24 h变化不明显,显著低于普通白木香种质。结论:普通白木香与奇楠种质所结沉香倍半萜类成分差异明显,且响应伤害诱导的倍半萜合酶基因在0~24 h表达模式显著不同,推测倍半萜合酶基因的差异诱导表达可能是2种种质形成的倍半萜成分差异较大的原因之一。

暴马桑黄倍半萜合酶基因SbTps1的克隆及表达分析

倍半萜(Sesquiterpenes)在动植物及微生物体内广泛存在,且具有重要的生理调节功能。本研究从暴马桑黄转录组数据库中筛选出1个编码暴马桑黄萜类合酶的基因,命名为SbTps1,并对其进行克隆及表达分析,经测序该基因全长1281 bp,编码426个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为48.17 ku。SDS-PAGE分析结果表明,在相对分子质量69.17 ku(包含21 ku标签蛋白)附近出现与预期大小一致的蛋白条带。系统发育进化树分析表明,暴马桑黄SbTps1蛋白和嗜蓝孢孔菌Tps蛋白同源性最高;荧光定量分析结果表明,SbTps1基因转录水平在不同发育阶段有差异性,并且在菌丝发酵培养第14天时SbTps1基因转录水平达到最高状态,该结果与鲍姆纤孔菌(Inonotus baumii)倍半萜合酶基因的转录水平变化趋势相似,因此可以推测SbTps1与倍半萜合成有关,初步鉴定该基因为倍半萜合酶基因,为后续暴马桑黄倍半萜合酶基因功能的研究奠定理论基础。

暴马桑黄倍半萜合酶基因SbTps2克隆及其响应茉莉酸甲酯的表达分析

【目的】对参与暴马桑黄Sanghuangporus baumii倍半萜合成途径的关键基因SbTps2及其启动子进行克隆和生物信息学分析,并解析不同浓度MeJA对该基因表达的影响。【方法】利用PCR扩增技术克隆暴马桑黄倍半萜合酶基因SbTps2 cDNA全长和启动子序列;用SWISS-MODEL、SignalP-3.0和SOPMA等软件对SbTps2基因和SbTps2启动子序列进行生物信息学分析;以暴马桑黄为试验材料,利用实时荧光定量技术,对不同浓度MeJA诱导下SbTps2基因相对表达量进行了比较分析。【结果】经测序,SbTps2基因全长1227 bp,编码407个氨基酸,蛋白分子量为45.73 kDa。根据暴马桑黄基因组已知的序列,并结合SbTps2基因cDNA测序结果分析基因的外显子和内含子表明,SbTps2基因包含3个外显子(核苷酸0~527 bp、592~898 bp和953~1348 bp)和两个内含子(528~591 bp和899~952 bp);SbTps2蛋白无跨膜结构与信号肽,该蛋白为亲水性不稳定蛋白。系统发育进化树分析结果表明,SbTps2蛋白与已报道的倍半萜合酶基因聚为一支;SbTps2启动子(1220 bp)生物信息学分析结果表明,它含有典型的启动子元件,如CAAT-box、TATA-box和MeJA等其他反应元件。荧光定量分析结果表明,SbTps2基因转录水平在不同浓度MeJA诱导时有差异性,并且在MeJA诱导浓度为200μM时SbTps2基因转录水平达到最高状态。【结论】通过对SbTps2基因的克隆与表达分析,为后续暴马桑黄倍半萜合酶基因功能的研究奠定了基础。

白木香倍半萜合酶基因AsSS4的克隆、原核表达与功能鉴定

通过RT-PCR方法从伤害处理的白木香树木质部中克隆得到沉香倍半萜合酶4(sesquiterpene synthase 4,As SS4)基因的全长开放读码框,该基因全长读码框为1 698 bp,编码包含565个氨基酸的蛋白质。将As SS4基因与原核表达载体p ET28a相连构建重组载体p ET28a-As SS4,把重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S中,用IPTG诱导重组菌,经SDS-PAGE电泳分析,获得分子质量约为64 k D的重组As SS4蛋白。利用镍凝胶亲和色谱法获得纯度较高的As SS4蛋白,以法尼基焦磷酸(FPP)为底物进行蛋白酶促反应,共催化产生5种倍半萜类成分:cyclohexane,1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-、β-elemene、α-guaiene、α-caryophyllene和δ-guaiene。本研究首次证实了白木香倍半萜合酶As SS4基因的功能,为揭示伤害诱导沉香倍半萜形成的分子机制奠定了理论基础。

Cloning, E. coli Expression and Molecular Analysis of a Novel Sesquiterpene Synthase Gene from Artemisia annua

A 1 886 bp full-length sesquiterpene synthase (AaSES) cDNA was cloned front a high-yield Artemisia annua L. strain 001 by a rapid amplification of cDNA end (RACE) strategy. AaSES is 59% identical to Artemisia cyclase cDNA clone cASC125, 50% identical to epi-cedrol synthase from A. annua , 48% identical to amorpha-4, 11-diene synthase from A. annua, 39% identical to the 5-epi-aristolechene synthase from tabacco, 38 % identical to vetispiradiene synthase front H. muticus, 41 % identical to the, delta-cadinene synthase from cotton. The coding region of the cDNA was inserted into a procaryotic expression vector pET-30a and overexpressed in E. coli BL21 ( DE3). The cyclase proteins extracted front bacterial culture were found largely in an insoluble protein fraction. AaSES expresses in leaves, stems a-rid flowers, not in roots as indicated by Northern blotting analysis.