假病毒中和试验对狂犬病毒中和抗体效价的检测效能分析

目的:组织不同的实验室分析假病毒中和法(Pseudo Virus-based Neutralization Assay,PBNA)对不同样品的狂犬病病毒中和抗体水平的检测能力,并比较其与经典的快速免疫荧光灶抑制试验(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test,RFFIT)以及小鼠中和试验法(Mouse Neutralization Test,MNT)的相关性。方法:共9家实验室,分别采用PBNA、RFFIT以及MNT法对6份样品进行狂犬病病毒中和抗体检测,每个实验室进行3~5次重复实验。采用配对t检验及Pearson相关系数对3种检测方法的结果进行统计学分析。结果:PBNA与RFFIT、PBNA与MNT、RFFIT与MNT Pearson相关系数分别为0.985、0.988和0.974,抗体几何平均滴度进行t检验,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:3种方法重复检测6份样品的定量结果具有高度的相关性,PBNA法可作为《中华人民共和国药典》方法RFFIT、MNT的一种替代或补充方法,用于人用狂犬病疫苗临床血清、狂犬病人免疫球蛋白及抗狂犬病血清的狂犬病病毒中和抗体效价检测。

基于hACE2转导建立SARS-CoV-2 spike假病毒感染病证结合的小鼠病毒肺炎模型

目的建立与评价一种安全、经济、有效的病证结合小鼠新冠病毒感染肺炎模型。方法30只KM种小鼠随机分为空白组、对照组及实验1组、实验2组、实验3组,每组各6只。每天把KM小鼠置于模拟寒湿环境中4 h,将表达hACE2的重组腺相关病毒(pAAV-hACE2)采用改良悬挂法气管内给药转导至肺组织,继以新型冠状病毒(SARS-CoV-2)spike假病毒采用相同的气管内给药方式造模。观察各组小鼠一般情况,检测体重变化、肺指数、血清炎性因子及肺部病理变化。结果免疫组化法显示h ACE2在小鼠肺组织中有效表达;在寒湿环境中给予SARS-CoV-2 spike假病毒后,实验组小鼠表现出类似疫毒犯肺证候的体征;且同样喂养条件和时间下,与空白组和对照组小鼠比较,实验组小鼠出现体重下降;实验1、2、3组小鼠出现肺指数显著增大(P<0.05或P<0.01),血清炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)显著升高(P<0.01),肺组织病理改变明显。结论本研究成功建立了一种安全、经济、有效的病证结合小鼠新冠病毒感染肺炎模型。

乙型脑炎病毒部分NS1基因假病毒的构建

目的构建耐核酸酶的含乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)部分非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)基因的假病毒,为JEV的实验室核酸检测提供质控品,提高检测质量。方法将JEV部分NS1基因、蚊18S RNA基因和人GAPDH基因片段次序连接克隆到该质粒上,构建重组载体pET-MS2-JEV;转化大肠杆菌后表达纯化假病毒,并对其进行耐受性和稳定性评估。结果构建了重组载体pET-MS2-JEV,表达获得的假病毒具有耐核酸酶、耐物理化学因子的特性,可在4℃和-20℃条件下稳定保存。结论本研究获得了稳定性好的含JEV部分NS1基因的假病毒,可作为JEV实验室核酸检测的质控品。

基于TGF-β1/Smad3信号通路探讨甘露消毒汤对SARS-CoV-2假病毒感染hACE2转基因小鼠的调控机制

目的利用SARS-CoV-2假病毒技术,通过TGF-β1/Smad3信号通路相关蛋白的表达变化,探讨GXT对SARS-CoV-2感染的作用机制。方法将60只实验小鼠,随机分为正常组、模型组、甘露消毒汤组,除正常组小鼠外,其余2组小鼠运用SARS-CoV-2假病毒滴鼻进行造模,造模后进行药物干预,于药物干预的第7天进行取材。测定各组小鼠的各类指标、肺组织病理形态改变,同时运用ELISA法测定IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-6的表达;运用qPCR法测定TGF-β1、Smad3、CD9、CD63的mRNA含量;采用WB法检测TGF-β1、Smad3、CD9、CD63的蛋白表达。结果模型组:小鼠中的肺指数以及肺组织病理评分升高,在HE染色后观察到小鼠的肺泡间隔增厚并伴有炎性细胞浸润,组织中TGF-β1、Smad3、CD9、CD63mRNA及蛋白的表达升高,血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量升高,IL-10表达下降(P<0.05);GXT组:肺指数、肺组织病理评分下调(P<0.05),HE染色可见炎性细胞浸润减少,小鼠肺组织中TGF-β1、Smad3、CD9、CD63mRNA及蛋白表达降低(P<0.05),血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低,IL-10含量升高(P<0.05)。结论GXT能够通过下调炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β,上调抗炎因子IL-10,抑制炎性病理反应过程,减轻假病毒小鼠肺组织炎性反应,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad3通路有关。

用于中和抗体评价和进入抑制剂筛选的多变异株SARS-CoV-2假病毒体系构建与评估

目的:构建一种高滴度SARS-CoV-2假病毒(PsV)体系,用于中和抗体体外评价与病毒进入抑制剂的筛选。方法:共转染慢病毒载体质粒psPAX2、pCDH-Luc与SARS-CoV-2 Spike(S)蛋白表达质粒,收获的假病毒上清感染ACE2-293T细胞。通过测定p24蛋白含量反映PsV滴度,Western blot检测S蛋白在PsV中的表达。利用原始株、D614G、Gamma、Delta、Omicron PsV亚型对1株S蛋白单克隆抗体的中和能力进行评价。采用两种已报道的病毒进入抑制剂氯喹、角叉菜胶检测对Omicron PsV进入的影响。结果:慢病毒载体成功掺入了S蛋白,Western blot结果显示665Y位突变的S蛋白表现出与野生型全长S蛋白(180 kD)不同的切割形式(90 kD)。三质粒体系包装出的PsV滴度更高,S蛋白表达质粒、转移质粒与包装质粒比例在1∶3∶3时为原始株PsV包装的最佳条件。该条件下包装出的5种PsV滴度均在20 ng/ml以上。PsV可有效感染ACE2-293T细胞,双报告基因GFP与萤火虫荧光素酶表达明显,化学发光数值高达106。基于原始株S蛋白的单克隆抗体可有效中和原始株PsV,对原始株PsV的中和作用是对变异株PsV的10~30倍。病毒进入抑制剂氯喹与ι-角叉菜胶可显著抑制Omicron PsV进入宿主细胞。结论:成功构建了高滴度的SARS-CoV-2 PsV进入体系,该体系以荧光素酶报告基因为指示,包含原始株和D614G、PsV Gamma、Delta、Omicron 4种变异株PsV,可有效评价中和抗体与病毒进入抑制剂活性,区分二者对不同变异株的敏感性差异对抗SARS-CoV-2药物研发有重要意义。

内含埃博拉病毒GP基因序列假病毒粒子的构建及应用

目的:构建内含埃博拉病毒(EBOV) GP基因序列的假病毒粒子,针对EBOV GP基因建立实时荧光定量PCR检测方法。方法:人工合成GP基因序列,克隆至慢病毒包装载体pGWLV-pseudovirus中,转化DH5α感受态细胞,筛选得到阳性克隆pGWLV-GP质粒。将重组质粒转染293T细胞,培养48 h后进行除菌,纯化后获得高纯度假病毒,通过RT-PCR鉴定该假病毒粒子含有EBOV GP基因。通过荧光定量qPCR对假病毒颗粒进行计数后,利用本研究所获得的假病毒颗粒制备用于EBOV核酸检测的标准品。结果:建立了基于EBOV GP基因的Taqman荧光定量PCR检测方法。结论:该方法所用标准品模拟了真实病毒粒子的结构,无生物传染性,经检测均匀性和稳定性良好,可作为EBOV核酸检测的阳性标准质控品,实现对核酸检测的全程监控。

15种岭南中草药抑制新冠假病毒感染细胞的药效筛选研究

目的筛选防治新型冠状病毒感染(COVID-19)的岭南特色中草药。方法通过荧光素酶发光检测技术,采用假病毒中和药效实验方法,对15种岭南地区特有中草药进行筛选并评估。结果草药降真香展示出较为明显的中和病毒作用,其抑制率为(83.6±4.0)%,草药山大颜与布渣叶有轻度的中和病毒作用,抑制率分别为(46.1±3.2)%、(58.7±5.9)%,其他草药则未表现出明显的中和病毒作用。结论岭南特色道地中药材在COVID-19的临床防治中具有潜在的应用价值,本研究结果为进一步的药物筛选和临床用药提供参考依据。

三种病原体核酸检测用假病毒标准品的制备和评价

本文通过制备和定值的人类免疫缺陷病毒、狂犬病毒、新型冠状病毒的标准品,使用内部含有特异性核酸序列的慢病毒体系进行假病毒包装和基因测序,并采用数字PCR方法定值,对其均匀性、稳定性和适用性进行评价,从而确定特征量值及扩展不确定度(k=2)。结果表明:3种假病毒核酸序列与NCBI数据库中的序列一致。

SARS-CoV假病毒中和试验技术的建立及评价

为避免传统的SARS病毒中和试验需要操作活毒而存在的生物安全隐患,建立了基于假病毒系统、操作较安全的SARS中和试验技术平台。本研究应用高效表达SARS-CoV S(密码子优化的全长S蛋白,简称S)的真核表达载体(pVRC8304),与HIV慢病毒包装质粒(p CMV△8.2)及转移质粒(pHR′CMV EGFP)3个质粒载体系统共同转染人胚肾细胞293T,包装了SARS假病毒;通过SARS假病毒感染的RD-A细胞中标记基因EGFP表达的分析,确定SARS假病毒能有效进入细胞,建立了可在BSL-2级实验室操作的SARS病毒中和试验技术平台。用该技术平台对不同免疫血清进行了中和抗体分析,并比较了基于假病毒和基于SARS活病毒的中和试验效果。结果显示:SARS假病毒和SARS活病毒两个中和试验系统获得中和抗体滴度变化趋势一致,表明本研究构建的SARS假病毒可替代SARS活病毒用于建立操作上安全的SARS病毒中和试验技术平台。

三种丙型肝炎包膜感染性假病毒颗粒的制备及初步应用研究

本研究构建携带HCV代表株H77（1a）、中国HeBei株（1b）以及JFH-1株（2a）丙型肝炎病毒完整的E1-E2包膜糖蛋白基因的表达质粒，间接免疫荧光法及Western blot验证了其在细胞膜（293细胞）上的正确表达。三种包膜质粒分别与慢病毒包装质粒pHR’CMV△8．2及携带EGFP报告基因的自灭活（Self—Inactivating，SIN）转移质粒pCS-CG共转染293FT细胞，产生三种不同基因型的丙型肝炎包膜感染性假型（pseudotyped）病毒颗粒，免疫荧光与Western blot分析验证了E1／E2包膜糖蛋白在假病毒颗粒上的表达与掺人，利用p24 ELISA法及感染性实验对HCV假病毒进行滴定。从上清中获得的HCV假病毒可以在体外感染肝癌细胞系Huh7及Huh7-CD81（且后者上的感染效率约为前者上的2～3倍）；利用针对HCVE2蛋白的具有广谱交叉中和活性的单克隆抗体AP33建立了基于上述假病毒颗粒的丙肝病毒体外中和抗体滴定方法，并应用于丙型肝炎患者体内的中和抗体水平的研究。本研究成功包装了包括中国流行株在内的3种不同基因型的HCV包膜感染性假病毒颗粒并建立了基于假病毒颗粒的HCV体外中和抗体检测方法，为研究HCV感染早期特性及特异抗病毒药物的体外筛选提供了有效模型，并可用于HCV感染者体内及HCV基因工程疫苗免疫后中和抗体水平的分析。

人乳头瘤病毒16型假病毒中和实验的建立和初步应用

探讨了应用多质粒磷酸钙共转染方法在293FT细胞中生产HPV16(human papillomavirus type 16)假病毒。蛋白印迹检测显示在转染后细胞的裂解上清中具有很好的L1蛋白活性,通过透射电镜可观察到形态与天然病毒粒子相似的假病毒颗粒。对293FT细胞的感染实验显示,该假病毒可有效将EGFP报告质粒导入靶细胞中进行表达,经测定其滴度约为2×107TU/mL。通过与4株HPV16对照单抗的中和实验证明该假病毒可有效应用于中和实验。应用该方法从18株抗HPV16L1的单克隆抗体中鉴定获得了2株中和单抗3D10、PD1。所建立的HPV16假病毒生产和中和实验方法具有快速高效、低成本和易于检测的优点,适于进行较大规模应用,为快速准确鉴定HPV16中和单抗和候选疫苗的免疫保护效果提供了有效手段。

人乳头瘤病毒假病毒制备方法的优化

人乳头瘤病毒假病毒可广泛应用于中和抗体鉴定和疫苗免疫性评估等研究.本研究对多质粒共转染293FT细胞生产HPV假病毒的方法进行了深入优化,结果显示不同的HPV结构蛋白表达质粒转染比例对于假病毒生产效率有显著的影响,HPV主要结构蛋白L1的表达水平是影响生产效率的主要因素,L2表达质粒的用量过高或过低均不利于假病毒的生产,而报告质粒的用量对假病毒生产效率的影响相对较小.综合比较显示,在该体系中L1和L2表达质粒和报告质粒以合适比例(如1∶1/10∶1/2)进行共转染可获得更为理想的生产效率.本研究同时也在293FT细胞中对磷酸钙转染方法进行了优化,通过磷酸钙与质粒用量的交叉配比试验获得了较优的转染条件.通过优化,建立了更为高效的HPV假病毒大量制备方法,在HPV16、HPV18、HPV6、HPV11假病毒生产中的应用结果显示较原方法可显著提高生产效率.本研究为HPV假病毒中和实验的规模化应用提供了有利条件.

应用假病毒技术研究HIV-1复制抑制剂

建立以HIV-1复制为靶点的细胞水平假病毒药理筛选模型,并运用该模型筛选化合物库中随机选取的化合物。细胞水平的HIV-1假病毒药理筛选模型是应用水泡性口膜炎病毒的外壳糖蛋白(vesicular stomatitis virusglycoprotein,VSV-G)包装HIV-1核心建立的,简称VSVG/HIV模型。细胞被VSVG/HIV感染后,病毒携带的报告基因的表达水平(荧光素酶活性或GFP阳性细胞比例)反映了HIV-1的复制水平。对HIV-1复制有抑制作用的化合物应用VSVG/MLV模型对其特异性地进一步检测。被感染细胞中报告基因的表达水平与病毒稀释度呈显著的剂量依赖效应。阳性药物齐多夫定(zidovudine,AZT)、拉米夫定(lamivudine,3TC)、去羟基苷(didanosine,DDI)可剂量依赖性地抑制HIV-1的复制,其IC50分别为48.5 nmol.L-1、0.13μmol.L-1和1.73μmol.L-1,与文献报道一致。在随机筛选的500个化合物中有3个化合物可以抑制HIV-1的复制,IC50分别为1.92、5.38和3.39μmol.L-1,而对MLV的复制无影响。VSVG/HIV假病毒系统是一种安全、有效的针对HIV-1复制的药理筛选模型。当将此模型与VSVG/MLV模型联合使用时,可判断化合物作用的特异性。实验表明:3个化合物,2-甲硫基-5-(4-甲基苯并)酰胺基-1,3,4-噻二唑(化合物A)、N-(3-羟基苯基)-2-(4-异丁基苯基)丙酰胺(化合物B)和N-(4-甲基吡啶基)-4-甲基苯磺酰胺(化合物C)可以特异性抑制HIV-1的复制。

含组氨酸纯化标签的假病毒表达载体的构建与应用

为了RNA类病毒进行核酸检测提供一种更稳定、更方便的全程监控技术,本文研究了含组氨酸纯化标签的假病毒监控内标和阳性对照的制备方法.通过基因工程手段将6个组氨酸插入MS2噬菌体包膜蛋白的β-发夹环结构中,成功构建带组氨酸纯化标签假病毒的通用表达载体.外源基因序列插入载体后,经诱导表达与镍离子亲和层析纯化后,可获得高浓度、高纯度的假病毒,在4℃和-20℃条件下,可用SM缓冲液稳定保存1年以上.

裂谷热假病毒颗粒研制及鉴定

裂谷热是危害严重的人畜共患病,为了给该病的分子生物学检测提供RNA阳性质控品,制备了裂谷热假病毒颗粒并进行了检测和验证。将pGEM-T-RVF质粒与假病毒载体p-MS2质粒分别进行PstI和HindⅢ双酶切,然后连接构建p-MS2-RVF重组质粒。将p-MS2-RVF重组菌进行表达、酶消化及盐沉淀后纯化假病毒颗粒,在特性检测的基础上,借助荧光RT-PCR方法进行鉴定。结果表明,裂谷热假病毒颗粒耐核酸酶,室温至少保持1个月,稳定,易运输;荧光RT-PCR检测表明最低可达到4.25×102copies检测限。构建的裂谷热假病毒颗粒将为裂谷热分子生物学检测提供阳性质控物质。

整合HA蛋白的HIV假病毒展示禽流感病毒感染宿主细胞机制

通过将高致病性禽流感病毒HA蛋白整合到HIV颗粒,包装成表达HA蛋白的假病毒粒子(命名为HIV/H5-HA),并对所包装的假病毒的生物学功能进行了研究.通过RT-PCR获得了H5N1亚型禽流感病毒完整的血凝素基因(HA)并克隆到真核表达载体pcDNA3·1(+)上,通过与假病毒构建体系的2种质粒pCMV△8·2和pHR′-CMVLacZ共转染293T细胞,包装成假病毒颗粒.利用LacZ染色和HA假病毒颗粒感染MDCK等6种细胞株并对标记基因LacZ进行检测.结果表明,HIV/H5-HA与天然的禽流感病毒相似,具有广泛的细胞嗜性;Western印迹和FACS检测结果,和HA假病毒颗粒的电镜照片确认了HA基因在假病毒颗粒表面得到了表达;HIV/H5-HA能够凝集鸡红细胞,并且pH值依赖性测定表明,HA假病毒需要低pH值才能实现正确的入侵宿主细胞.本研究结果显示:禽流感病毒H5N1亚型的HA基因得到了有效的包装,并且所包装的假病毒颗粒能够表达具有高度生物活性的HA蛋白.同时,假病毒模型的建立为进一步研究禽流感病毒与宿主之间的免疫应答提供了一种新的途径.

基于假病毒筛选抗病毒药物的研究进展

假病毒是一种整合其他病毒囊膜糖蛋白所形成的具有外源性病毒囊膜、而自身基因组仍保持着源病毒基因组特性的一类病毒。假病毒因丧失了病毒的自我复制能力,具有安全性高等优点,已被广泛用于包括HIV、H5N1、HCV等病毒的研究。本文介绍了基于假病毒技术进行研究的优势及局限性,还通过总结大量研究成果阐明了利用假病毒技术进行药物筛选的可行性与有效性。假病毒药物筛选平台作为一种新型、安全、可靠的实验手段,将为抗病毒药物的研究做出更多的贡献。

基于假病毒的人乳头瘤病毒小鼠感染模型的建立及HPV16VLP疫苗保护性评价

目的建立基于假病毒的人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)小鼠感染模型并应用于HPV16 VLP疫苗的保护性评价。方法利用293FT细胞制备携带Luc报告基因的HPV16假病毒,纯化后检测HPV16假病毒滴度和性质;利用醋酸甲羟孕酮和β-雌二醇处理雌性BAL B/c小鼠,然后用壬苯醇醚-9(N-9)化学损伤BALB/c小鼠阴道,6 h后用HPV16假病毒感染小鼠阴道,48 h后使用活体检测仪检测小鼠阴道中Luc报告基因的表达情况;最后,利用该感染模型评价HPV16 VLP疫苗的保护能力。结果获得了含有Luc报告基因的HPV16假病毒,建立了HPV假病毒纯化方法;Western blot结果显示HPV16假病毒中含有L1和L2蛋白;建立了HPV假病毒感染小鼠模型,并通过不同剂量的假病毒感染实验表明,该感染模型所需的最低假病毒剂量是1.7×104TRLU;利用该模型获知HPV16 VLP疫苗具有较强的抵抗HPV16假病毒感染的能力,当中和抗体滴度为256时即可阻碍HPV假病毒感染。结论本研究成功地建立了HPV假病毒小鼠感染模型,并运用该模型评价了HPV16 VLP疫苗的保护作用,为HPV中和抗体研究和候选疫苗的免疫保护评价提供了有效工具。

HIV-1假病毒包装及感染条件优化

目的对人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)假病毒包装及感染条件进行优化,获得高重复性、高稳定性和高滴度的假病毒包装方法和较高的感染效率。方法采用pSG3△env质粒与pcDNA3.1-SF162rev/env质粒共转染293T细胞包装病毒,对HIV假病毒骨架质粒与env真核表达质粒转染比例、转染试剂与质粒比例、假病毒收获时间对HIV假病毒包装滴度的影响进行实验,同时对感染过程中假病毒接种剂量与二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-Dextran)使用浓度进行了优化。结果在包装过程中当HIV假病毒骨架质粒与env真核表达质粒转染比例为4∶1、转染试剂与质粒比例为3∶1,转染后培养48hHIV-1假病毒的滴度最高;在假病毒感染过程中,15μg/mL的DEAE-Dextran可有效增加假病毒的感染效率且不会对细胞造成较大毒性。结论通过对包装和感染过程中关键条件的优化,可以有效提高HIV-1假病毒的包装和感染效率,增加实验技术稳定性,为新型抗艾滋病药物筛选和艾滋病疫苗评价等研究奠定了基础。

假病毒技术在抗H5N1禽流感病毒中药筛选中的应用及评价

目的:建立基于假病毒技术的抗H5N1禽流感病毒中药筛选方法,利用血清药理学的方法系统评价攻下方、解毒方、凉血方和扶正方4类中药复方体外对H5N1禽流感病毒活性的影响及其机制。方法:构建整合H5N1禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白的假病毒,雄性Wistar大鼠25只灌胃不同中药制备复方中药血清。采用犬肾(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞和人胚肾细胞293T为研究对象,将不同浓度药物血清分别与假病毒或靶细胞体外培养后,观察药物血清对假病毒活性的直接抑制作用,通过流式细胞术检测药物血清对H5N1禽流感病毒HA蛋白表达的影响。结果:HA蛋白特异性中和抗体2B4在50μL(抗体总量500μg)、25μL(抗体总量250μg)及12.5μL(抗体总量125μg)的剂量条件下均可以有效抑制假病毒的感染活性,从而证实利用假病毒技术筛选药物的方法的可行性。与对照血清相比,4种复方中药含药血清体外对假病毒均无明显抑制作用(P>0.05),也不能有效预防假病毒感染(P>0.05),不能抑制H5N1流感病毒HA蛋白的表达。结论:假病毒技术是一种安全、高效、精确的筛选抗H5N1禽流感病毒中药的方法;4类复方中药含药血清并不含有作用于H5N1假病毒HA蛋白及唾液酸α-2,3半乳糖苷受体的有效成分或单体。