上海市某区生菜中阪崎克罗诺杆菌的半定量风险评估

为了评估上海市某区居民通过生菜暴露阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)的健康风险,本文按照微生物风险评估的程序,应用半定量风险评估工具Risk Ranger和sQMRA软件,结合居民膳食消费量数据进行评估。预计上海市某区健康成人每人每天因进食污染了阪崎克罗诺杆菌的生菜而患病的概率为1.66×10^(-9),每年发病7.63×10^(-3)例,风险系数为9,健康成人的发病概率很低。说明上海市某区即食生菜中阪崎克罗诺杆菌危害为低风险,可维持现有风险控制措施,但需严格执行生产过程风险监测,制定安全事件发生应急预案,并加强对消费者家庭食品安全的科普宣传。本研究为生菜中致病微生物风险评估补充数据,可供定量风险评估和食源性疾病的防控提供科学参考。

武汉地区住院患者克罗诺杆菌感染及其临床分离株分子特征与耐药性研究

目的:研究武汉地区住院患者克罗诺杆菌感染及其临床分离株分子特征与耐药性。方法:选取2021年6月~2022年5月在武汉市第一医院就诊的克罗诺杆菌感染住院患者137例为研究对象,对患者克罗诺杆菌分离株行血清型分型鉴定、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型分析、克隆群结构特征分析与耐药性检验。结果:483例患者检出克罗诺杆菌感染137例,总检出率28.36%。男、女检出率差异无统计学意义(P>0.05),年龄分布以低龄(0~6岁)检出率最高,科室分布以儿科检出率最高,感染后易发疾病类型为脑膜炎(P<0.05);血清型分型鉴定以O 1为主要血清型分型,占比36.50%(50/137),ST型分布以ST4、ST1为主,分别占比40.15%(55/137)和31.38%(43/137),CC结构特征以CC4、CC7为主,分别占比32.85%(45/137)和40.15%(55/137);经内切酶Xba I和Spe I酶切后,分成14个PFGE图谱类型,其中BQ9、BQ11和BQ12相似系数较高(98.0%);耐药性检验结果提示,氨苄西林的耐药性较强(67.15%),对测定的其他抗生素全部敏感,未发现多重耐药菌株。结论:武汉地区住院患者克罗诺杆菌感染血清型分型以O 1型为主,PFGE分子分型具有多样性,其中氨苄西林的耐药性较强。

阪崎克罗诺杆菌双抗夹心酶联免疫吸附检测方法的建立

为建立阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)的免疫学快速检测方法,分别制备了阪崎克罗诺杆菌的特异性单抗和多抗,建立阪崎克罗诺杆菌的双抗夹心酶联免疫吸附DAS-ELISA检测方法。结果:获得4株抗阪崎克罗诺杆菌单克隆抗体阳性细胞株,分泌抗体效价分别是1∶128000、1∶32000、1∶256000和1∶256000,抗阪崎克罗诺杆菌兔多克隆抗体效价是1∶128000。建立的阪崎克罗诺杆菌DAS-ELISA检测方法,分别以抗阪崎克罗诺杆菌兔多抗和单抗作为捕获抗体和检测抗体,兔多抗的最佳稀释度为1∶4000,单克隆抗体最佳稀释度为1∶1000,灵敏性可达1×106 CFU/mL;该检测方法具有良好的特异性,与常见的6种食源性病原菌都没有交叉反应,且能够同时检测6种克罗诺杆菌属细菌;重复性结果显示,该检测方法的批内批间变异系数均小于15%,具有良好的重复性。综上,利用抗阪崎克罗诺杆菌的单抗和兔多抗成功建立了DAS-ELISA方法,该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可为阪崎克罗诺杆菌的快速检测提供技术支撑。

重组酶介导的等温扩增结合CRISPR/Cas12a检测志贺氏菌和克罗诺杆菌

目的应用重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)结合成簇规则的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),建立志贺氏菌和克罗诺杆菌的快速检测方法。方法通过筛选志贺氏菌和克罗诺杆菌特异性基因,设计特异扩增引物、CRISPR脱氧核糖核酸(CRISPR deoxyribonucleic acid,crDNA)和探针,将靶标进行RAA扩增后,建立CRISPR检测方法。对方法的灵敏度、特异性和应用性进行评价,并与国标检测方法进行对比。结果本研究对志贺氏菌和克罗诺杆菌纯菌液DNA最低检出限分别为4.9×10^(3) CFU/mL、4.4×10^(4) CFU/mL,基因组DNA最低检出限为6.8×10^(‒3) ng/μL、5.7×10^(‒3 )ng/μL,特异性好,与其他病原菌无交叉反应。同时,该方法成功检测出加标猪肉样品和人工污染奶粉中的志贺氏菌和克罗诺杆菌,比国家标准检出限更低。结论本研究建立的RAA-CRISPR方法可有效应用于志贺氏菌和克罗诺杆菌的检测,这为快速筛查食品中是否污染这两种病原菌提供重要价值。

鸡源阪崎克罗诺杆菌的分离鉴定和生物学特性分析

为确定新疆阿克苏地区某鸡场鸡只精神不振、采食量减少和死亡的原因,本试验对采集自该鸡场病死鸡的肝脏等器官进行病原的分离鉴定、形态学观察、生化鉴定和16S rRNA基因PCR鉴定,通过PCR检测毒力基因的携带情况,并进行动物回归试验和药物敏感性试验以分析其致病力和耐药性。结果显示,从病死鸡内脏器官中分离到1株革兰阴性短杆菌,鉴定该分离菌株为阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii);该分离菌株携带sip和ompX两种毒力基因;在3~7 h处于对数生长期;可感染雏鸡,并引起雏鸡严重脱毛和死亡,死亡雏鸡以肝脏肿大出血和肺脏有出血点为主要病理变化,与自然发病鸡症状一致;对替加环素、阿米卡星和多黏菌素B表现为敏感,对多西环素、链霉素和新霉素表现为中介,对其他18种抗生素表现为耐药。结果表明,分离菌株对动物具有潜在的致病性。本试验首次在病死鸡中分离出阪崎克罗诺杆菌,扩大了鸡体内致病微生物的种类,并对该菌的生物学特性进行了初步探究,以期对动物源阪崎克罗诺杆菌感染的临床用药和防控提供参考。

鼠李糖乳酪杆菌对乳鼠肠道发育和阪崎克罗诺杆菌致坏死性肠炎的影响

为研究鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)SW-02对乳鼠肠道发育的影响,将新生C57BL/6小鼠以SW-02(1×10^(7) CFU/d)灌胃,饲养2周后,检测体质量、脏器指数、肠道组织苏木精-伊红染色、细胞增殖标志基因和紧密连接蛋白的mRNA水平及免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)水平;将新生小鼠分为对照组、阪崎克罗诺杆菌组(CS组)、SW-02干预组(CS+SW-02组),饲养至第10天,检测体质量、肠道组织苏木精-伊红染色、细胞增殖标志基因和紧密连接蛋白的mRNA水平及炎症因子水平,研究SW-02对阪崎克罗诺杆菌致坏死性小肠结肠炎的影响。结果显示,鼠李糖乳酪杆菌SW-02能够促进乳鼠早期的生长,促进机体肠道发育和免疫功能,还可以有效改善阪崎克罗诺杆菌对乳鼠肠道造成的损伤,降低炎症。

米面来源克罗诺杆菌的鉴定及毒力基因、耐药性分析

为了解江西省南昌市市售米面食品中克罗诺杆菌的污染状况、毒力基因特征以及耐药性情况,利用PCR扩增技术和16S rDNA测序分析对克罗诺杆菌进行鉴定,并对5种毒力基因进行扩增,同时通过肉汤微量稀释法对菌株进行8种抗生素的药敏试验。结果显示在68株克罗诺杆菌中,有47株属于阪崎克罗诺杆菌,检出率为68.12%,有10株属于丙二酸盐克罗诺杆菌,检出率为14.49%。阪崎克罗诺杆菌中的cpa基因检出率最高,为91.49%,其他依次为aut(80.85%)、hly(68.09%)和inv(42.55%),sip未检出;丙二酸盐克罗诺杆菌中则是aut基因检出率最高,为80%,另外cpa基因也有检出,检出率为30%,其他3种毒力基因均未检出。阪崎克罗诺杆菌中同时携带两种以上毒力基因的比例达到91.49%。克罗诺杆菌对于8种抗生素的耐药率普遍较低,阪崎克罗诺杆菌仅有2株对氨苄西林表现出耐药性,耐药率为4.26%,有1株同时对头孢曲松和头孢噻肟表现出耐药性;丙二酸盐克罗诺杆菌中仅有2株对呋喃妥因表现出耐受性。研究结果可为米粉及面条中食源性致病菌的风险评估提供一定的参考和数据支持。

GABA旁路在阪崎克罗诺杆菌耐干燥胁迫中的作用

阪崎克罗诺杆菌是婴幼儿配方奶粉(Powdered Infant Formula,PIF)中常见的食源性致病菌,γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid,GABA)是一种广泛存在于各种生物体内的非蛋白氨基酸,而gabT控制的氨基丁酸转氨酶是GABA代谢旁路的关键酶。该研究通过构建阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544 gabT基因敲除菌株(ΔgabT),探讨gabT控制的GABA(γ-氨基丁酸)代谢旁路对阪崎克罗诺杆菌抵抗干燥的作用。结果表明,ΔgabT在干燥胁迫下处理一周后存活率可达到28.64%显著高于野生型菌株(WT)的存活率1.57%。此外,GABA在ΔgabT中累积量高于WT,与存活率结果呈正相关,表明GABA累积能帮助阪崎克罗诺杆菌抵御干燥胁迫。扫描电子显微镜检测结果也显示ΔgabT菌株具有较完整的细胞形态,进一步验证了GABA积累有助于阪崎克罗诺杆菌在干燥环境胁迫下的生存。该研究为阪崎克罗诺杆菌中基于GABA旁路的靶向调控奠定了基础,为阪崎克罗诺杆菌防控提供新思路。

克罗诺杆菌DNA质粒标准样品的制备及在婴幼儿配方奶粉检测中的应用

选取阪崎克罗诺杆菌中atpD、gyrB、infB、fusA和glnS管家基因作为靶序列,构建质粒标准样品快速检测克罗诺杆菌。通过测序和菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对构建的重组质粒进行验证,传15代后对重组质粒进行测序验证质粒稳定性。制备的atpD、gyrB、infB、fusA和glnS质粒标准样品,对其进行定性实验,并检测其检出限和稳定性,然后使用atpD、gyrB、infB、fusA和glnS质粒标准样品对婴幼儿奶粉中克罗诺杆菌进行检测。通过菌落PCR和测序结果显示atpD、gyrB、infB、fusA和glnS质粒标准样品制备成功。PCR体系对质粒标准样品检测具有特异性,atpD、gyrB、infB、fusA和glnS检出限分别为1.14×10^(6)、1.07×10^(7)、1.09×10^(7)、1.73×10^(5)、7.54×10^(5)拷贝/μL。质粒冻干粉可以在-20、4、25℃稳定保存90 d。将质粒标准样品用于23份婴幼儿奶粉样品检测,检测出1份具有gyrB管家基因。参考GB 4789.40—2016《食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》的方法进行传统微生物分离检测,未检测出克罗诺杆菌。相较于传统方法质粒标准样品的应用极大提高了样品的检测效率。

克罗诺杆菌在婴儿配方奶粉及其加工环境中耐受性和耐药性研究进展

克罗诺杆菌(Cronobacter)是一种食源性致病菌,容易感染新生儿和低体重早产儿并引起坏死性小肠结肠炎、脑膜炎和败血症等疾病,致死率高达40%~80%,治愈后可能存在严重精神系统后遗症。由流行病学可知,婴幼儿感染克罗诺杆菌与婴儿配方奶粉(Powdered Infant Formula,PIF)的关系十分密切。近年来,克罗诺杆菌污染PIF事件频发并且因其耐药性给临床治疗带来巨大挑战,造成严重后果。究其原因,是由于该菌对PIF及其加工环境的耐受能力强,不易被完全消杀从而造成持续污染。因此,为详细了解克罗诺杆菌在不利条件下的生长特性,该研究从克罗诺杆菌耐热性、耐干燥性、耐酸碱性、耐紫外性以及耐药性多个角度综述目前克罗诺杆菌耐受性相关研究进展,以期为我国克罗诺杆菌的防控消杀以及临床治疗提供参考。

克罗诺杆菌分型技术研究进展

克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)是污染婴幼儿配方乳粉(powdered infant formulas,PIF)的主要食源性致病菌之一,可通过辅料的添加和加工环境进入PIF,可引起新生儿严重感染,导致菌血症、脑膜炎等疾病。因此,高时效性及高精度的菌株分型技术对于克罗诺杆菌的溯源和防控具有重要意义。文章对克罗诺杆菌常用的分型技术进行综述,包括血清分型、生化分型、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分型、脉冲场凝胶电泳分型、多位点序列分型、CRISPR-Cas阵列分析、随机多态性扩增DNA基因分型、核糖体分型、特殊基因分型和全基因组分型,并对上述各种方法的原理和溯源能力进行概述。

西双版纳进口食品中克罗诺杆菌分离鉴定、毒力基因及耐药性研究

为了解西双版纳进口食品中克罗诺杆菌的污染状况、毒力基因特征以及耐药性情况,该研究利用全自动微生物鉴定系统VITEK 2 compact和16S rDNA测序对克罗诺杆菌进行分离鉴定,通过PCR对4种毒力基因进行扩增,通过Kirby-Bauer纸片法对菌株进行14种抗生素的药敏试验,并对菌株BQ10进行了全基因组测序。结果显示,2.91%(5/172)的样品中存在克罗诺杆菌的污染,菌株中毒力基因ompX、cpa、hly的携带率为100%,且都未检出sip。分离株对头孢噻吩(cefothiophene,CFT)的耐药性最强,耐药率为69.23%(9/13),而对氨苄西林、阿莫西林、替卡西林、亚胺培南、环丙沙星等抗生素普遍敏感,未发现多重耐药菌株。全基因组测序结果显示BQ10的基因组大小为4.75 Mb,GC含量为54.69%,多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)为ST431型,通过毒力因子数据库VFDB和耐药数据库CARD预测到多种毒力基因和耐药基因。该研究结果为西双版纳进口食品中食源性致病菌风险评估、预警以及采取相关防控措施提供了一定的参考。

结合CRISPR/Cas12b与LAMP技术的乳粉中克罗诺杆菌属的检测

将CRISPR/Cas12b与环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法相结合,应用于乳粉中克罗诺杆菌属的检测。通过基因组比较寻找克罗诺杆菌菌株基因内部的候选保守序列,针对克罗诺杆菌属特异性关键基因序列设计LAMP引物和向导RNA靶向序列,对其进行条件优化、特异性检测,并用人工污染样品对体系的灵敏度、重复性进行验证。结果表明该方法具有良好的特异性,方法的灵敏度达到了0.1 pg/μL;人工污染样品可检测到初始菌量<10 CFU/g的样品,方法检出限为<10 CFU/100 g。将该方法应用于51份市售乳粉样品以及52份模拟生产环境样品的检测,结果与传统国标方法一致,并且大幅缩短了实验时间。该方法可用于乳粉中克罗诺杆菌属的快速检测。

氨苄西林胁迫下阪崎克罗诺杆菌维持连续休眠态的转录组学分析

阪崎克罗诺杆菌是奶粉中常见的食源致病菌,在压力胁迫下会进入连续休眠态。该研究通过转录组测序技术分析氨苄西林压力胁迫下形成的连续休眠态菌的基因表达变化差异,共筛选出220个显著上调基因和416个显著下调基因;并对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。结果表明,与代谢活性、运动能力(鞭毛合成)、细胞分裂相关基因表达整体显著下调;与药物外排泵、细胞形态改变相关的部分基因表达显著上调;GO富集分析结果还提示严谨反应、毒素抗毒素系统(TAS)相关基因表达显著上调,TAS可能通过调控下游mRNA和NAD+促进连续休眠态的形成。因此,在氨苄西林胁迫下严谨反应可能通过级联调节激活TAS表达,从而促进连续休眠态形成。在该状态下,阪崎克罗诺杆菌通过降低代谢活性、减弱运动能力、抑制细胞分裂,同时改变细胞形态,并增强药物外排能力,从而维持连续休眠态。研究结果为防控压力胁迫下产生的连续休眠态阪崎克罗诺杆菌奠定了理论基础。

婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的快速检测

为了缩短克罗诺杆菌(Cronobacter)的检测周期,提升克罗诺杆菌的检测准确性,该研究建立一种婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的快速检测方法。采用单因素试验筛选克罗诺杆菌的促进剂、抑制剂和修复剂的用量,制备克罗诺杆菌快速增菌培养基(RGM),并进行该方法特异性及增菌效果验证。结果表明,克罗诺杆菌快速增菌培养基(RGM)为缓冲蛋白胨水(BPW)中加入5.0 g/L低聚异麦芽糖作为促进剂、3.0 g/L丙酮酸钠作为修复剂、5 mg/L万古霉素作为抑制剂。当克罗诺杆菌初始接种量为1 CFU时,在快速增菌培养基(RGM)中经36℃培养24 h后,菌液浓度能达到109 CFU/mL。对不含、含有益生菌的婴儿配方奶粉,克罗诺杆菌在快速增菌培养基中的增殖速度分别是BPW的2倍、10~20倍。该检测方法特异性及增菌效果较好,菌体浓度在1 CFU时即可检出,可用于市售婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的检测。

婴幼儿食品中克罗诺杆菌属的分离鉴定及耐药性分析

通过传统方法对婴幼儿食品中克罗诺杆菌属进行分离鉴定,共分离得到43株克罗诺杆菌属。分别用7种抗生素对分离菌株的药物敏感性进行检测,43株分离株除了对氨苄西林和呋喃妥因(耐药率均为4.65%)、头孢曲松和头孢噻肟(耐药率均为2.33%)耐药外,对氯霉素的(耐药率51.16%)的耐药率最高。

丙二酸盐克罗诺杆菌pspA基因的干燥诱导及表达载体构建

噬菌体休克蛋白(phage shock protein,Psp)系统目前已被证明与包膜应激反应相关。为了探索干燥胁迫下丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)噬菌体休克蛋白A(PspA)的作用,文章通过实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术验证干燥胁迫可以诱导丙二酸盐克罗诺杆菌PspA编码基因pspA显著表达,提示Psp系统对克罗诺杆菌抗干燥胁迫具有一定的作用。该文成功克隆出丙二酸盐克罗诺杆菌pspA基因并构建pET28a-EGFP-PspA原核表达载体,诱导PspA的高效表达,可用于后续分析PspA在干燥胁迫下的功能及定位情况,以期对丙二酸盐克罗诺杆菌Psp系统的干燥胁迫机制展开进一步的研究和讨论。

丙二酸盐克罗诺杆菌PspA包涵体蛋白的表达、复性及纯化方法优化

为研究丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)中噬菌体休克蛋白A(phage shock protein A,PspA)的结构与功能,文章构建了PspA融合蛋白表达载体,但重组蛋白以包涵体形式大量表达;为获取较高浓度的可溶性蛋白进行后续探究,使用尿素裂解液使蛋白变性后,经多种方法复性GST-PspA包涵体蛋白,使其重新恢复生物学活性。研究结果表明,4℃低温条件下包涵体蛋白经尿素梯度稀释透析以控制复性速率,防止蛋白分子快速聚集,可以实现高效复性和纯化GST-PspA融合蛋白。为进一步探索Psp系统中各蛋白的功能及相互作用的研究提供一定的参考。

免疫磁珠结合显色平板快速检测婴儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌

该研究利用羧基化磁珠偶联兔多克隆抗体,制备特异性免疫磁珠,并优化制备条件,然后与显色培养基联用,建立免疫磁珠-显色平板检测方法,用于富集分离婴儿奶粉中的阪崎克罗诺杆菌。结果表明,磁珠与抗体的最佳偶联温度37℃、偶联时间2.0 h,1 mg磁珠的最佳抗体添加量为200μg,饱和偶联量为182.77μg。制得的免疫磁珠,捕获目标菌的浓度范围为10~2~10~7 CFU/mL,捕获率为68.4%~82.4%,与非目标菌反应率低于10%。检测方法应用于模拟污染样品,在目标菌浓度10~2~10~5 CFU/mL时,捕获率为66.2%~71.5%。相比传统方法,该方法的检测周期缩短了2~3 d。

GB 4789.40-2016和ISO 22964:2017方法检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌属的实验室适用性研究

克罗诺杆菌属(原阪崎肠杆菌)可在婴幼儿配方粉(Powdered Infant Formula,PIF)中长期存活。随着食品贸易的全球化,人们对婴幼儿配方粉(PIF)中克罗诺杆菌的污染尤为关注。本文参照ISO 16140-22016中方法比对的原则要求,对检测PIF中克罗诺杆菌的中国标准方法GB 4789.40-2016(参考方法)和欧盟标准方法EN ISO 22964:2017(替代方法)进行了方法比较研究。共有12个外部实验室参与检测3个不同污染水平(0 MPN/10 g,1.299 MPN/10 g和2.210 PMN/10 g)下添加了测试菌株的576份盲样的测试。结果表明,在低污染水平和高污染水平下,GB 4789.40-2016的灵敏度分别为80.00%和81.16%,而ISO 22964:2017对应的灵敏度分别为90.00%和97.10%。无论污染程度如何,相对检测水平(RLODs)都低于接受限(AL=2.5)。同时,采用AOAC指南中提出的检测概率(POD)模型对统计数据进行了分析,结果显示替代方法和参考方法之间没有统计学上的显著差异。据此得出用于检测PIF中阪崎克罗诺杆菌的GB 4789.40-2016方法与ISO 22964:2017方法具有等效性。