酪蛋白糖巨肽对花生过敏原免疫反应性的影响

目的 探究酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptides,CGMP)与花生过敏原相互作用并降低其免疫反应性的潜力。方法 通过蛋白-蛋白分子对接技术探讨CGMP与Ara h1、Ara h2是否有相互作用的潜力。进一步通过混合水浴加热制备CGMP与花生蛋白的混合溶液(mixed solution of casein glycomacropeptides and peanut proteins,MCGP),建立MCGP致敏、花生蛋白激发的BALB/c小鼠模型,研究MCGP对花生过敏反应的影响。最后使用圆二色谱法研究酪蛋白糖巨肽与Ara h1、Ara h2的相互作用力及对其结构的影响。结果 CGMP与Ara h1、Ara h2间存在次级键(盐桥、氢键、范德华力),部分作用于过敏原表位;与花生蛋白过敏组相比, MCGP致敏组血清中的花生蛋白特异性免疫球蛋白E (specific immunoglobulin E, sIgE)、sIgG1、sIgG2a含量显著下降,白介素-4 (interleukin-4, IL-4)、IL-5、组胺水平显著下降,转化生长因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β)、γ干扰素(interferon-gamma, IFN-γ)水平显著升高, MCGP中Ara h2的α-螺旋与β-折叠的比例改变。结论 CGMP能够改变Ara h2的结构,遮蔽花生过敏原表位,抑制sIgE、sIgG结合Ara h1、Ara h2,降低部分花生过敏原的免疫反应性。

电针对大鼠足背炎性痛病灶局部P物质、IL-1β免疫反应性的影响

目的 :研究电针治疗福尔马林所致炎性痛的神经免疫机制。方法 :采用福尔马林试验 ,在大鼠一侧足背皮下注射 5%福尔马林 50 μL制备局部炎性痛病灶 ,应用痛行为学及免疫组织化学方法 ,观察电针胆经“环跳”穴、“阳陵泉”穴 (刺激参数为 1～ 3V ,4～ 1 6Hz,3 0min)对大鼠痛行为反应、炎症反应及足背炎性痛病灶局部组织P物质、IL 1 β免疫反应性的影响。结果 :①电针能显著抑制福尔马林导致的大鼠缩腿、舔爪等自发痛行为反应 (P <0 0 1 ) ;②电针能减轻福尔马林导致的局部炎症反应并显著翻转炎性痛病灶局部表皮、真皮及皮下组织P物质阳性神经纤维和IL 1 β阳性细胞免疫反应性增强现象 (P <0 0 1 )。结论 :SP与IL 1 β参与了福尔马林所致的炎性痛反应过程 ,电针可能通过抑制炎性痛病灶局部感觉神经末梢合成和释放SP及减少免疫细胞向病灶局部游走、合成并释放IL 1 β从而发挥消炎镇痛作用。

空气净化器降低室内尘螨过敏原含量及其免疫反应性的实验研究

目的检测开启空气净化器前后室内空气中粉尘螨主要过敏原的含量,探讨粉尘螨经空气净化器不同作用时间后对其抗原免疫反应性的影响。方法实验分组采样:(1)不开空调和空气净化器;(2)开空调、不开空气净化器;(3)同时开空调和空气净化器;(4)开空气净化器、不开空调。用粉尘采样器分别采集室内空气中尘螨过敏原Der f1和Der f2,运用ELISA方法检测4种环境条件下空气中Der f1、Der f2的含量;通过ELISA和免疫印迹方法检测空气净化器作用不同时间(24h、48h和72h)后粉尘螨过敏原免疫反应性的变化。结果 20个取样房间在开空调之后室内尘螨过敏原的含量都会增高,而在使用空气净化器后,不管是在空调开启或者关闭的情况下室内空气中Der f1和Der f2都会降低(P<0.01);粉尘螨在空气净化器等离子和静电高压场强作用下,死亡的粉尘螨其免疫反应性均较活螨显著降低(P<0.01),免疫组化显示其免疫反应性有所降低。结论本实验使用空气净化器能够显著降低室内空气中的尘螨过敏原Der f1、Der f2的浓度,并且通过空气净化器作用后,死亡的粉尘螨免疫反应性显著降低,提示使用空气净化器对过敏性疾病(如哮喘和过敏性鼻炎)具有重要的预防和干预作用。

广州管圆线虫半乳凝素基因的克隆表达、蛋白纯化及免疫反应性研究

目的构建在E.coli中高效表达广州管圆线虫半乳凝素蛋白的重组表达质粒,并对重组蛋白纯化条件进行优化及免疫反应性鉴定。方法根据本室构建的广州管圆线虫幼虫cDNA文库EST测序结果,筛选出有诊断潜能的半乳凝素基因,经过PCR扩增其cDNA全长序列后克隆入pET32a(+)载体进行诱导表达,包涵体经洗涤、变性、逐步透析复性,浓缩后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹。结果本研究首次克隆出广州管圆线虫半乳凝素蛋白基因全长cDNA序列(GenBank收录编号为DQ384534)。成功构建重组质粒pET32a(+)-AcGAL,通过IPTG诱导得到以包涵体形式表达的重组融合蛋白,Western-blot结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性。结论克隆表达了广州管圆线虫半乳凝素基因,为广州管圆线虫病诊断研究奠定了基础。

致弱尾蚴免疫血清与日本血吸虫不同发育阶段抗原免疫反应性的研究

目的 通过比较分析日本血吸虫不同发育阶段抗原的异同 ,并以致弱尾蚴免疫血清识别不同发育阶段抗原 ,筛选具有保护性免疫作用的抗原分子。方法 分离制备日本血吸虫未成熟虫卵、成熟虫卵、尾蚴、雄性成虫、雌性成虫等不同发育阶段的抗原 ;采用ELISA分别测定正常尾蚴感染兔血清、紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清抗原的抗体水平 ;通过SDS PAGE电泳和免疫印迹技术 ,分析正常尾蚴感染血清与紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清对不同发育阶段的免疫反应性。结果与结论 SDS-PAGE结果显示未成熟虫卵抗原、成熟虫卵抗原、尾蚴抗原、雄性成虫抗原、雌性成虫抗原蛋白之间互有异同。间接ELISA试验显示致弱尾蚴免疫血清同样能诱导宿主产生高滴度的抗体水平。致弱尾蚴免疫血清共筛选出 2 3种具免疫学活性的抗原分子 ,分子量分别为 :2 4 .5kDa、2 8kDa、36kDa、4 3kDa、4 4kDa、4 8kDa、5 4kDa、5 8.5kDa、6 0kDa、6 2kDa、6 6kDa、6 8kDa、70kDa、75kDa、79kDa、85kDa、87kDa、91kDa、95kDa、97kDa、10 5kDa、10 8kDa、110kDa。其中未成熟虫卵和成熟虫卵抗原各占 11种 ,尾蚴抗原分子 4种 ,雄性成虫抗原分子 3种 ,雌性成虫抗原分子 6种 。

截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段,并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法利用NcoⅠ、HindⅢ双酶切,从本室建立的pET-30a(+)-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段,并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中,构建表达重组质粒pET-32a(+)-trSAG1。将重组质粒转入E.coliBL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni-NTA agarose纯化后, Western-blotting分析其免疫反应性。结果成功构建重组质粒pET-32a(+)-trSAG1 ,通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白,相对分子质量40 000,Western-blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性,ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段,表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别,有望成为一种有价值的诊断抗原。

弓形虫缓殖子期特异性抗原1基因的克隆、表达及对重组抗原的免疫反应性分析

目的克隆与表达弓形虫缓殖子期特异性抗原1(BAG1)的基因,并分析重组抗原的免疫反应性。方法诱导体外培养的弓形虫RH株速殖子向缓殖子转化,用RT-PCR法从缓殖子期弓形虫扩增BAG1基因片段,进行序列分析;构建表达重组质粒pET32a(+)-BAG1,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达;表达蛋白经次氨基三乙酸镍(Ni-NTA)琼脂糖亲和层析纯化后,蛋白质印迹(Western blotting)分析与ELISA分析其免疫反应性。结果从缓殖子期弓形虫克隆的BAG1基因长690bp,构建的重组质粒pET32a(+)-BAG1经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组BAG1。Western blotting分析显示纯化的重组BAG1(SAG1)能被弓形虫慢性感染血清识别。ELISA结果表明重组BAG1抗原检测350份人血清弓形虫IgG抗体的阳性率为17.4%,显著高于重组SAG1抗原的阳性率12.6%(P<0.05)。结论原核表达的重组BAG1抗原具有特异的免疫反应性。

白细胞介素6受体样免疫反应性细胞在大鼠脑内的分布

目的 研究白细胞介素６ 受体（ＩＬ－６Ｒ和ｇｐ１３０）免疫反应性细胞在大鼠脑内的分布。方法 采用ＡＢＣ免疫组织化学方法。结果 ＩＬ－６Ｒ免疫反应性细胞主要分布在下丘脑的视前区、腹内侧核、室旁核和弓状核；在海马，ＩＬ－６Ｒ阳性细胞呈强阳性，密集分布于齿状回颗粒细胞层和ＣＡ１ ～ＣＡ２ 锥体细胞层；在大脑皮层、嗅结节、丘脑腹内侧核、终纹床核等处也有ＩＬ－６Ｒ阳性细胞。ｇｐ１３０ 阳性细胞主要分布于下丘脑的室周核、室旁核的内侧小细胞部、弓状核及视上核，在大脑皮层也有ｇｐ１３０ 阳性大锥体细胞的分布。ｇｐ１３０ 阳性细胞亦见于尾壳核、杏仁核区、终纹床核，在海马结构内的ｇｐ１３０ 阳性细胞较ＩＬ－６Ｒ染色较浅。此外，ＩＬ－６ 两种受体亚单位的免疫反应性细胞也散在分布于小脑皮层、小脑外侧核以及延髓／脑干。结论 在大鼠脑内广泛分布着ＩＬ－６ 两种受体亚单位的免疫反应性细胞，提示ＩＬ－６ 及其受体可能具有重要的神经生物学意义。

辣椒素对大鼠膀胱内压及CGRP-,NPY-免疫反应性神经的影响

观察了不同浓度的辣椒素 (CAP)注入大鼠膀胱后 ,膀胱内压、膀胱容量的泌尿动力学变化及CAP对膀胱壁内含CGRP及NPY免疫反应性 (IR)神经的影响。结果发现 ,高浓度CAP(4mmol/L及 8mmol/L)处理后膀胱最大压力明显下降 ,而膀胱容量及残余尿量增加 (P 0 .0 1)。免疫组织化学发现 ,各种浓度的CAP均明显降低膀胱壁各层CGRP IR神经纤维的长度和密度 (P 0 .0 0 1)。结果表明 ,CAP能广泛耗竭膀胱组织内CAP敏感的一级传入神经末梢中的CGRP ,并表现出一定的浓度依赖性变化 ,此可能为降低膀胱内压 ,引起尿潴留和充溢性尿失禁的神经原性病理机制。这可能为临床上局部使用CAP治疗神经原性膀胱 (逼尿反射亢进 )。

抗p21Ras单克隆抗体KGH-R1在大肠良恶性病变中的免疫反应性比较

目的:评价抗p21Ras单克隆抗体(mAb)KGH-R1在大肠良恶性病变及正常黏膜组织中的免疫反应性,为该抗体的临床应用奠定基础。方法:用本实验室制备的广谱抗p21 ras mAb KGH-R1对正常大肠黏膜、大肠炎息肉、大肠低级别上皮内瘤变、大肠高级别上皮内瘤变、浸润性大肠癌及癌旁病变组织进行免疫组化染色,计算各样本的阳性细胞百分率和组织学评分(HSCORE)分值,比较各组免疫反应性的差异。结果:mAb KGH-R1与64.89%(61/94)的浸润性大肠癌发生免疫反应,阳性样本的平均阳性细胞数为97.28%,平均HSCORE评分178.98分;与60.24%(50/83)的高级别上皮内瘤变组织发生免疫反应,阳性样本的平均阳性细胞数为95.08%,平均HSCORE评分156.38分;与64.58%(31/48)的低级别上皮内瘤变组织发生免疫反应,阳性样本的平均阳性细胞数为82.52%,平均HSCORE评分103.03分;与39.97%(29/73)的炎性息肉组织发生免疫反应,阳性样本的平均阳性细胞率17.78%,平均HSCORE评分18.66分。虽然mAb KGH-R1也与46.67%(21/45)的正常大肠黏膜上皮发生免疫反应,但阳性样本的平均阳性细胞数为2.64%,平均HSCORE评分为2.64分。大肠癌与癌旁高级别上皮内瘤变组织比较,mAb KGH-R1反应阳性细胞数和HSCORE评分无统计学意义,但高于癌旁低级别上皮内瘤变组织。20/85例(23.53%)癌旁正常黏膜组织与mAb KGH-R1呈微弱阳性反应。结论:mAb KGH-R1与大肠癌具有较强的免疫反应性,有开发为治疗性抗体的可能。

甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达及免疫反应性分析

目的构建甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白,并对表达蛋白的免疫反应性进行分析。方法人工合成A/California/05/2009 H1N1流感病毒的HA基因,以合成基因为模板,通过PCR方法扩增出去除信号肽的HA部分基因片段,然后将去除信号肽的HA基因克隆至pET30a(+)原核表达载体中,构建出原核表达质粒,再将重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达菌株;重组菌经IPTG诱导后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析,Western blot分析表达产物的免疫反应性。结果获得了HA基因的原核表达重组菌,细菌经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见约67.4 ku大小的目的蛋白表达条带,Western blot结果显示,表达产物与人甲型H1N1流感患者阳性血清具有反应性。结论成功表达出甲型H1N1流感病毒的HA蛋白,该蛋白具有良好的免疫反应性,为甲型H1N1流感的快速诊断方法的建立提供了生物材料。

LAIR基因的克隆、原核表达及免疫反应性鉴定

目的 :克隆和表达淋巴细胞相关免疫球蛋白样受体 (leuko cyte associatedimmunoglobulin likereceptor ,LAIR ) ,鉴定抗LAIR 1单克隆抗体 (mAb)与LAIR 2分子的免疫反应性。方法 :利用RT PCR ,从人外周血单个核细胞 (PBMC)及白血病细胞系Jurkat和HL 6 0中克隆了LAIRcDNA。将LAIR 1的胞膜外区基因及LAIR 2cDNA ,克隆入GST融合蛋白表达载体pGEX 4T 3中。以其转化E .coliBL2 1菌株后 ,在IPTG诱导下进行表达 ,表达产物用谷胱甘肽交联的Sepharose 4B纯化。用间接ELISA法 ,鉴定抗LAIR 1mAb对表达蛋白的免疫反应性。结果 :克隆并表达了LAIR 1和LAIR 2cDNA。同时克隆了 5种新的LAIR 1异型 ,其中从HL 6 0细胞克隆的 2种包含LAIR 1开放读框 (ORF) ,从Ju rkat细胞中克隆的 3种为LAIR 1cDNA片段。mAb鉴定表明LAIR 1与LAIR 2的免疫反应性不同。结论 :LAIR基因的转录、转录后的加工及表达 ,可能与个体和疾病状态有关。LAIR 1和LAIR

华支睾吸虫的一个μ型GST基因的表达、纯化与免疫反应性鉴定

【目的】扩增华支睾吸虫一个μ型谷胱甘肽移酶(mu-classglutathionetransferaseofClonorchissinen-sis,CsGSTM)基因,明确是否存在内含子,进行原核表达,纯化其表达产物,鉴定免疫反应性。【方法】用PCR方法从成虫cDNA文库和基因组中扩增出目的基因,测序,定向克隆到原核表达载体pET-30a(+),在大肠杆菌BL21/DE3表达,按照Ni-NTAagarose说明书纯化重组蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdode-cylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)、薄层色谱(thin-layerchromatography,TLC)和免疫印迹(Westernblotting)分析。【结果】CsGSTM基因全长657bp,没有内含子,构建的原核表达质粒pET-30a(+)-CsGSTM在大肠杆菌中得到了有效表达,Mr,pET-30a(+)-CsGSTM=31×103。重组蛋白达总蛋白的39%,纯化后的重组蛋白纯度为98%,重组蛋白在纯化前后均有免疫反应性。【结论】CsGSTM基因没有内含子,在大肠杆菌中能有效表达,纯化前后的重组蛋白都具有免疫反应性。

弓形虫致密颗粒蛋白基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的将克隆入pGEX-4T-1的致密颗粒蛋白基因进行表达并对表达产物的免疫反应性进行评价。方法将重组表达质粒pGEX-4T-1/GRA7转入大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导进行SDS变性蛋白质电泳,分别以Anti-GSTAntibody、免抗弓形虫阳性血清和人抗弓形虫阳性血清为一抗进行WesternBlot分析。用GSTrapFFHiTrapaffinitycolumns纯化重组蛋白,以此蛋白作为包被抗原,BLISA法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果SDS变性蛋白质电泳显示在43KDa～66KDa蛋白条带之间有特异蛋白的表达,蛋白分子量大小与理论值相符。WesternBlot分析表明该重组蛋白为GST融合蛋白,且该蛋白能被人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清所识别。ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合,而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论弓形虫致密颗粒蛋白基因在大肠埃希菌中得到表达;该重组蛋白具有良好的免疫反应性。

枫蓼肠胃康颗粒对细胞免疫反应性结肠炎中SOD、MDA的影响

目的 观察枫蓼肠胃康颗粒对细胞免疫反应性结肠炎大鼠血中超氧化物歧化酶 (SOD)和丙二醛 (MDA)的作用。方法 将雄性Wistar大鼠分成 6组 ,用三硝基苯磺酸和ethanol混和液灌肠法 ,建立大鼠细胞免疫反应性结肠炎动物模型 ,在 1、3、7、2 1d分别处死大鼠。对肠壁形态进行观察 ,并测定大鼠血中SOD活力及MDA含量。结果 高剂量组的肠壁损伤分值在 7、2 1d较造模组降低 (P <0 0 5 ) ;造模组大鼠SOD活力d 3和d 7低于高剂量给药组 (P <0 0 5 ) ,MDA含量d 7、2 1高于各给药组 (P <0 0 1或P <0 0 5 )。

肝片形吸虫重组组织蛋白酶L的免疫反应性和免疫原性分析

目的分析肝片形吸虫(Fasciola hepatica)重组组织蛋白酶L(CatL)的免疫反应性,以及对SD大鼠的免疫原性。方法诱导含重组原核表达质粒pET30a-FhCatL的大肠埃希菌BL21(DE3)宿主菌表达,SDS-PAGE分析表达产物,以感染肝片形吸虫山羊血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫反应性。20只SD大鼠随机均分为重组蛋白免疫组和佐剂对照组,免疫组大鼠皮下注射纯化的重组FhCatL,200μg/(只·次),共免疫3次,每次间隔3周;对照组用等量PBS与佐剂混合后注射。于第2次和末次免疫前,以及末次免疫后3、6和9周尾静脉采血,分离血清。利用间接ELISA法检测免疫大鼠血清IgG抗体水平,噻唑蓝比色法(MTT法)检测脾淋巴细胞增殖情况。结果经纯化获得重组FhCatL蛋白,相对分子质量(Mr)约42 000。Western blotting分析结果表明,纯化重组蛋白能被感染肝片形吸虫的山羊血清识别。重组FhCatL蛋白免疫SD大鼠后可诱导产生特异性IgG抗体,随着免疫时间的延长抗体水平逐渐升高,于末次免疫后3周抗体效价达到峰值(1∶102 400),明显高于对照组(1∶1 000)。免疫组脾淋巴细胞刺激指数为2.176±0.047,显著高于对照组(1.171±0.032)(P<0.05)。结论重组FhCatL蛋白具有较好的免疫反应性和免疫原性。

结核分枝杆菌Ag85A蛋白的原核表达、纯化和免疫反应性

目的通过原核表达获得结核分枝杆菌Ag85A蛋白。方法用PCR从结核分枝杆菌H37Rv菌株中扩增出编码Ag85A的fbpA基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,产生重组质粒pPro85A后,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21并诱导大量表达。用镍纯化系统纯化重组Ag85A蛋白,用不同分枝杆菌感染的小鼠血清通过ELISA确定其免疫反应性。利用PCR技术鉴定fbpA基因在不同分枝杆菌的分布。结果32 ku的Ag85A蛋白获得高效表达和纯化。表达Ag85A蛋白的fbpA基因在结核分枝杆菌H37Rv、H37Ra、BCG、草分枝杆菌、土地分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和次要分枝杆菌中均有表达,但在牝牛分枝杆菌中未表达。结核病患者和结核分枝杆菌毒株H37Rv感染小鼠血清所产生的抗Ag85A抗体滴度最高。结论重组Ag85A蛋白已成功表达纯化,并保留了免疫反应性。

模拟失重对大鼠比目鱼肌肌梭钙结合蛋白D-28K免疫反应性的影响(英文)

目的检查模拟失重对大鼠比目鱼肌肌梭钙结合蛋白D 2 8K样免疫反应阳性物质 (CaBP LI)的影响 ,探讨模拟失重所致肌梭损伤的发生机制。方法采用免疫过氧化酶反应ABC法观察尾吊 7d、1 4d与对照组大鼠比目鱼肌梭内肌纤维CaBP LI的差别。结果梭外肌纤维和神经纤维不显示CaBP免疫反应性。每个肌梭都有某些梭内肌纤维上发现CaBP LI。悬吊 1 4d后 ,梭内肌纤维的CaBP免疫反应性明显降低。结论模拟失重可致大鼠比目鱼肌肌梭的CaBP免疫反应性发生改变 ,可能与肌梭的退行性改变有关。

刚地弓形虫抑制蛋白的原核表达与免疫反应性分析

目的克隆并表达刚地弓形虫抑制蛋白(Tg PRF)基因,并分析其免疫反应性。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,根据Tg PRF的基因编码序列设计引物,RT-PCR扩增产物双酶切后连接入p ET30a(+)载体,重组质粒转化入大肠埃希菌(E.coli)DH5α,经双酶切、PCR和测序鉴定阳性菌落。p ET30a(+)-Tg PRF转化至E.coli BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。重组蛋白经镍亲和层析法纯化后,以兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析r Tg PRF蛋白的免疫反应性。结果 Tg PRF基因RT-PCR扩增产物约为492 bp。经双酶切、PCR和测序结果显示,重组质粒p ET30a(+)-Tg PRF构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约35 000的可溶性重组蛋白。Western blotting结果显示,r Tg PRF蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。结论本研究克隆的Tg PRF基因序列能在原核表达系统中表达,且具有免疫反应性。

刚地弓形虫尿苷磷酸化酶的克隆、表达与免疫反应性检测

目的预测刚地弓形虫尿苷磷酸化酶(uridine phosphorylase,TgUPase)基因编码蛋白的主要特性和抗原表位,克隆、表达TgUPase基因,并检测其免疫反应性。方法采用生物信息学在线分析程序和软件预测TgUPase蛋白的理化性质和抗原表位。提取RH株弓形虫速殖子总RNA。根据TgUPase基因全长编码序列(GenBank登录号为DQ385446.1)的开放阅读框设计引物,并用RT-PCR扩增,扩增产物经双酶切后连接入pET-30a(+)载体。用重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR、双酶切和测序鉴定。将重组质粒pET-30a(+)-TgUPase转化至E.coli BL21(DE3),并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,分别以抗His标签抗体和人抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白及其免疫反应性。结果生物信息学预测结果显示,TgUPase蛋白由303个氨基酸组成,相对分子质量(Mr)为33 042.9,为可溶性蛋白,有3个潜在的T/B细胞联合抗原表位。RT-PCR扩增产物约为921 bp。菌落PCR、双酶切以及测序结果表明,重组质粒pET-30a(+)-TgUPase构建成功。SDS-PAGE结果表明,经IPTG诱导获得约Mr38 000的可溶性重组蛋白(带His标签)。Western blotting结果显示,重组蛋白能被His标签抗体和人抗弓形虫血清识别。结论成功构建了重组质粒pET-30a(+)-TgUPase,获得刚地弓形虫重组尿苷磷酸化酶,且重组蛋白具有免疫反应性。