人骨保护素成熟肽表达载体的构建、表达及重组蛋白免疫学鉴定

目的 :构建人骨保护素 (OPG)成熟肽cDNA重组表达载体 ,实现其在毕赤酵母中的高效表达。方法 :由人成骨细胞提取总RNA ,经RT -PCR扩增得到人OPG成熟肽cDNA ,克隆入分泌型表达载体 pPIC9K ,转化酵母细胞 ,G418筛选多拷贝整合的重组子进行甲醇诱导表达 ,产物行Westernblotting 鉴定。结果 :成功构建了人OPG成熟肽表达载体 ,该载体能在酵母细胞中获得分泌表达 ,诱导96h的表达量占上清总蛋白的30 %。重组蛋白相对分子质量约55ku ,可被OPG抗体识别。结论 :重组人OPG成熟肽在酵母表达系统获得较高水平表达 ,为进一步研究开发基因工程药物准备了条件。

问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白LipL41抗原表位预测及免疫学鉴定

目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别。方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位。采用PCR扩增候选T/B联合表位片段,采用噬菌体展示及SDS-PAGE等技术获得含不同T/B联合表位的重组P。分别以rLipL41/1和rLipL41/2抗血清、黄疸出血群赖型赖株全菌抗血清和钩体患者血清为一抗,采用Western Blot检测各抗血清与各重组P免疫杂交反应性。结果:根据预测结果选择了LipL41s中8个共有或差异T/B联合表位。经PCR扩增获得了上述T/B联合表位片段。各T/B联合表位片段均准确插入噬菌体P蛋白N端并有效表达。各抗血清均能识别上述8个T/B联合表位,但其WesternBlot杂交信号强度存在差异,其中共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233与不同抗血清的信号较强且稳定。结论:所选择的8个T/B联合表位均为LipL41的有效抗原表位。共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233可作为钩体MAP疫苗的首选抗原表位。差异T/B联合表位LipL41s-89和LipL41s-299与不同抗血清有免疫交叉现象。

日本血吸虫磷酸丙糖异构酶Th1型表位的免疫学鉴定

目的筛选和鉴定日本血吸虫磷酸丙糖异构酶(SjTPI)的Th1型细胞表位,为构建短肽疫苗奠定基础。方法用BLAST比对并预测SjTPI的T细胞表位SjTPI-P18及其对照表位SjTPI-P9。设计并合成其编码DNA,重组入原核表达载体pET-32c(+)后进行表达,获得纯化的重组融合蛋白rSjTPI-P18和rSjTPI-P9。用rSjTPI、rSjTPI-P18及rSjT-PI-P9刺激经照射致弱尾蚴免疫、rSjTPI加强免疫的C57BL/6和C3H/HeJ小鼠淋巴细胞,3H-TdR掺入法检测淋巴细胞的增殖效果及细胞培养上清中IL-2水平;分别用重组rSjTPI-P18和合成SjTPI-P18刺激rSjTPI-P18、SjTPI-P18或PBS加弗氏佐剂两次免疫的C57BL/6小鼠淋巴细胞,并检测其细胞培养上清中IFN-γ及IL-4水平。结果参照曼氏血吸虫TPI T细胞表位预测的SjTPI-P18及SjTPI-P9,获得了与Trx融合表达的重组肽rSjTPI-P18及rSjTPI-P9。与rSjTPI-P9相比,rSjTPI及rSjTPI-P18均可刺激辐照致弱尾蚴免疫、rSjTPI加强免疫的C57BL/6或C3H/HeJ小鼠的淋巴细胞增殖且IL-2分泌量增加(P均<0.05);SjTPI-P18及rSjTPI-P18刺激经rSjTPI-P18或SjTPI-P18免疫两次的C57BL/6小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ水平升高(P均<0.05),而IL-4水平较低。结论筛选和鉴定出的SjTPI-P18是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位。

日本血吸虫副肌球蛋白合成肽的免疫学鉴定

目的鉴定日本血吸虫副肌球蛋白合成肽Sj97-P22。方法27只雌性C57BL/6小鼠随机均分为合成肽Sj97-P22免疫组、无关肽免疫组和PBS免疫组,分别于尾基部皮下注射与完全福氏佐剂等体积充分混匀的合成肽Sj97-P22(100μg)乳化物、无关肽(100μg)乳化物和PBS乳化物,抗原免疫剂量为100μg/(只.次),共免疫2次,间隔1周。于免疫后7～10d分离各组小鼠脾单个核细胞,运用流式细胞技术三色标记法检测其CD4+T细胞胞内因子干扰素γ(IFN-γ)和白介素4(IL-4)。将Sj97-P22免疫小鼠或PBS免疫小鼠的脾单个核细胞分别与Sj97-P22、无关肽或PBS共培养,采用3H-TdR掺入法观察细胞增殖效果,并用ELISA法检测细胞培养上清中IL-2、IFN-γ和IL-4的浓度。结果Sj97-P22免疫组小鼠脾脏CD4+T细胞中胞内分泌IFN-γ的细胞百分率为(8.05±0.54)%,显著高于无关肽免疫组[(4.74±1.04)%]和PBS免疫组[(6.51±0.49)%](P<0.05);而分泌IL-4的细胞百分率[(0.60±0.11)%]显著低于PBS免疫组[(1.31±0.27)%](P<0.05),与无关肽免疫组[(0.84±0.08)%]间的差异则无统计学意义(P>0.05)。Sj97-P22可明显刺激Sj97-P22免疫小鼠脾单个核细胞增殖,增殖指数达到3.12±1.59,细胞培养上清中IL-2和IFN-γ浓度分别为(9.13±1.54)和(39.75±9.69)pg/ml,与无关肽和PBS刺激相比显著升高(P<0.05),而IL-4浓度在3个刺激物间的差异无统计学意义(P>0.05)。Sj97-P22不能刺激PBS免疫鼠脾单个核细胞增殖及培养上清中IL-2、IFN-γ及IL-4浓度变化。结论Sj97-P22可能是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位。

大肠杆菌表达的乙型肝炎表面抗原124aa分子的纯化和免疫学鉴定

目的 探索大肠杆菌表达的乙型肝炎表面抗原 (HBsAg) 12 4aa分子作为疫苗成分应用的可能性。方法 以超声破碎法获取包涵体 ,用HisTrapTM试剂盒亲和层析纯化目的蛋白 ,加入聚乙二醇 (PEG40 0 0 )以提高变性蛋白的复性效率 ;以抗HBsAga抗原决定簇单克隆抗体 (McAb)和抗HBsAg多克隆抗体 (PcAb)作为包被抗体 ,采用夹心ELISA法分析其抗原性 ;以纯化产物免疫BALB/c小鼠 ,RIA法测定小鼠血清中抗HBs抗体。结果 通过HisTrapTM 试剂盒亲和层析纯化的HBsAg12 4aa分子经反相高效液相色谱 (RP HPLC)分析 ,纯度达 95 %以上 ;经复性后的蛋白具有抗原性和免疫原性。结论 HBsAg12 4aa分子在大肠杆菌中的成功表达 。

家蚕蚕蛹过敏原CPH30的表达、纯化、免疫学鉴定及B细胞抗原表位预测

【目的】克隆、表达纯化出家蚕Bombyx mori蚕蛹过敏原蛋白CPH30(cuticular protein hypothetical 30 precursor),并对其进行免疫学鉴定及B细胞抗原表位预测。【方法】通过蛋白组学方法分析CPH30蛋白的潜在过敏原性,人工化学合成该蛋白基因,将基因连接到p ET-28a载体上,重组质粒转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21,IPTG诱导基因表达。通过镍亲和层析获取高纯度蛋白,用Western blot方法对蛋白进行免疫学鉴定。通过DNAStar软件分析其潜在的B细胞表位。【结果】成功构建出CPH30基因的表达载体;表达纯化出CPH30蛋白,SDS-PAGE电泳结果显示分子量为25 k Da左右;Western blot结果显示,CPH30蛋白与家蚕过敏患者血清具有Ig E结合性,证明CPH30具有免疫原性;利用DNAStar软件成功分析出氨基酸序列第57-69和150-158位为潜在的B细胞表位。【结论】成功克隆表达出CPH30蛋白,并成功鉴定出其免疫原性,为家蚕蚕蛹过敏反应性疾病的特异性诊断和疫苗治疗奠定理论基础。

问号钩端螺旋体血清群LipL32基因型分析及其重组蛋白的免疫学鉴定

目的 探讨 15群 15型问号钩端螺旋体 (简称钩体 )中国参考标准株及 2群 2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在主要外膜蛋白 (MOMP)基因 (LipL32 ) ,克隆并构建该基因的原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫性。方法 常规酚 氯仿法提取上述钩体株基因组DNA ,高保真PCR扩增全长LipL32基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列并构建表达系统 ,不同浓度IPTG诱导后用SDS PAGE检测rMOMP表达情况。分别用兔抗TR patocⅠ钩体全菌抗血清、rMOMPs免疫兔血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和免疫原性 ,显微镜凝集试验 (MAT)检测rMOMPs免疫兔血清的交叉凝集效价 ,钩体细胞黏附模型检测抗体阻断效果。结果 上述 17株钩体均有LipL32基因 ,但可分LipL32 1和LipL32 2两种基因型。 13个LipL32 1和 4个Li pL32 2基因型之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 95 .12 %～ 96 .6 0 %和 97.79%～ 98.16 %。IPTG诱导后rMOMP1和rMOMP2表达量分别占细菌总蛋白的 4 0 %和 10 %。rMOMP1和rMOMP2均能与兔抗钩体TR patocⅠ血清发生结合反应 ,免疫家兔可对上述 17株钩体产生 1∶2～ 1∶6 4MAT效价的凝集抗体。 1∶2～ 1∶16稀释的兔抗rMOMP1和rMOMP2血清均能有效地阻断钩体的黏附。结论 所有检测的钩体具有LipL32 1或LipL32 2基因。

问号钩端螺旋体血清群LipL41基因型分析及其表达产物的免疫学鉴定

目的 确定我国 15群 15株问号钩端螺旋体 (简称钩体 )参考标准株和 2群 2株双曲钩体国际标准株携带LipL4 1基因情况 ,构建该基因的原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫原性。方法常规酚 氯仿法提取上述 17株钩体基因组DNA ,高保真PCR扩增全长LipL4 1基因片段 ,T A克隆后测序分型。构建LipL4 1基因原核表达系统 ,SDS PAGE检测重组目的蛋白 (rLipL4 1)表达情况。分别用钩体属特异性TR patocⅠ抗原、rLipL4 1兔抗血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和抗原性。分别用显微镜凝集试验 (MAT)、钩体黏附J774A .1细胞模型检测兔抗rLipL4 1血清的交叉凝集效价和黏附阻断作用。结果 15株问号钩体均有LipL4 1基因 ,并可分为LipL4 1 1和LipL4 1 2两种基因型 ,2株双曲钩体则否。 11个LipL4 1 1基因和 4个LipL4 1 2基因克隆之间的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为88.6 1%～ 88.6 7%和 93.2 4 %～ 97.18%。所构建的原核表达系统rLipL4 1 1和rLipL4 1 2的表达量分别占钩体总蛋白的 30 %和 4 0 %。rLipL4 1 1和rLipL4 1 2均能与TR patocⅠ抗血清发生结合反应 ,免疫家兔能产生抗体。rLipL4 1 1和rLipL4 1 2兔抗血清对上述 15株问号钩体MAT效价为 1∶8～ 1∶12 8、1∶16～1∶2 5 6稀释时均能有效地阻断钩体对细胞的黏附。结?

藏羊源细粒棘球蚴抗原B8/2基因的克隆表达和免疫学鉴定

目的克隆、表达青海省藏羊源细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus）抗原B8/2（Eg Ag B8/2）基因,并进行免疫学鉴定。方法用RT-PCR扩增Eg Ag B8/2基因c DNA,构建原核表达载体pET-Eg Ag B8/2,转化至大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）对诱导表达后的蛋白进行鉴定。结果克隆的Eg Ag B8/2基因长335 bp,序列分析表明与已报道的Eg Ag B8/2 c DNA序列的同源性为98%~100%,原核表达载体pET-Eg Ag B8/2构建正确。诱导表达后,通过SDS-PAGE检测,上清中有大量目的蛋白表达。纯化的蛋白经Western blotting鉴定为目的蛋白。结论成功克隆了青海省藏羊源Eg Ag B8/2基因,构建了原核表达载体,诱导表达后的蛋白为目的蛋白。

自身免疫性肝炎特异性靶抗原的表达及免疫学鉴定

目的 克隆、表达可溶性肝抗原（ＳＬＡ）及细胞色素Ｐ４５０ ２Ｄ６（ＣＹＰ ２Ｄ６）。方法 采用 ＲＴ—ＰＣＲ技术从人肝组织ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ中扩增ＳＬＡ及 ＣＹＰ ２Ｄ６ ｃＤＮＡ，经ＢａｍＨ Ⅰ、Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切定向插入载体ＰＱＥ－３０并在大肠杆菌Ｍ１５中表达。对表达载体ＰＱＥ—３０／ＳＬＡ、ＰＱＥ—３０／ＣＹＰ ２Ｄ６中的目的基因进行序列分析，表达产物用 ＳＤＳ—ＰＡＧＥ、免疫印迹方法鉴定。结果 表达产物经 ＳＤＳ－ＰＡＣＥ和免疫印迹分析后在分子量 ４．７ × １０４和５．０ × １０４处各有一条明显的蛋白带，并分别能特异性与抗ＳＬＡ、ＣＹＰ２Ｄ６阳性血清反应。结论 表达ＳＬＡ、ＣＹＰ２Ｄ６为自身免疫性肝炎的诊断及其发病机制研究提供物质基础。

软叶针葵花粉肌动蛋白抑制蛋白基因的克隆表达与纯化及免疫学鉴定

花粉是最主要的吸入性过敏原之一。软叶针葵是一种热带、亚热带常见植物，在授粉季节所产花粉量较大，具很大的过敏潜能。但目前国内外尚鲜见软叶针葵花粉过敏原研究的报道。本研究用简并性引物从软叶针葵花粉中获得1个肌动蛋白抑制蛋白（profilin）基因，并在大肠杆菌中进行表达，获得有活性的重组profilin，同时研究其免疫学特性，并为软叶针葵花粉过敏诊断及免疫学治疗奠定基础。

日本血吸虫特异性IgE抗体相关肽表位的筛选与免疫学鉴定

目的 从噬菌体表面显示肽库筛选并鉴定日本血吸虫特异性IgE抗体相关表位。 方法用ABC 酶联免疫吸附 (ELISA)法检测日本血吸虫病流行区居民血清 15 0份 ,选择其中 15份具高滴度血吸虫特异性IgE抗体的血清 ,混合后经蛋白G柱亲和层析祛除IgG抗体 ,用于对 12肽的噬菌体表面显示肽库进行 5轮免疫亲和淘筛。从所获噬菌体克隆中挑取 35个克隆 ,经DNA序列测定 ,对各独立肽表位进行免疫学鉴定。结果 经 5轮筛选 ,DNA序列测定显示共有 4个独立噬菌体克隆 ,其中 phage 3和 phage 6有较多重复克隆存在 ,为优势克隆 ;Westernblot分析显示 ,筛库血清中特异性IgE抗体能有效识别各噬菌体克隆。分别用各克隆噬菌体免疫小鼠 ,均能诱导特异性IgE抗体产生。结论 从 12肽噬菌体表面显示肽库中成功筛选到日本血吸虫特异性IgE抗体相关肽表位。

菠萝过敏原profilin的克隆、表达及免疫学鉴定

超敏反应性疾病是较为常见的危害人类健康的疾患之一，食物过敏在我国已屡见不鲜。菠萝，又叫凤梨，属凤梨科多年生草木，是药食兼优的热带水果。食用后有助消化、利尿等作用。有文献报道食用菠萝后可出现四肢及口舌麻木、腹痛、腹泻、呕吐或者头痛、头昏、皮肤潮红、全身发痒，甚至出现呼吸困难、休克等一系列过敏症状［1］。

家蚕蚕蛹基因LOC101743840的原核表达、免疫学鉴定及生物信息学分析

目的原核表达家蚕蚕蛹LOC101743840(以下简称LOC)基因,鉴定LOC蛋白的免疫学特性,并进行生物信息学分析。方法将合成的家蚕蚕蛹LOC基因(gi|512917985)连接至克隆载体p MD18-T,用限制性内切酶Xho I和Bam H I分别对p MD18-T-LOC阳性质粒与原核表达载体p ET-28a双酶切,构建重组表达质粒p ET-28a-LOC并转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达(经IPTG诱导);用Western blot鉴定重组LOC蛋白的免疫活性;用Clustalw2和MEGA5工具包分析LOC的基因;用Prot Param Tools预测LOC蛋白的理化性质;用PSIPRED和SWISS-MODEL预测其蛋白质结构。用IEDB、Preprod和DNAStar预测其细胞抗原表位。结果成功表达了家蚕蚕蛹LOC基因,其开放阅读框768 bp,编码255组氨基酸;由E.coli BL21(DE3)原核表达的重组LOC蛋白为可溶性,分子量约33 k D;Western bolt结果显示重组LOC蛋白可特异性结合家蚕蚕蛹过敏患者血清中的特异性Ig E;家蚕蚕蛹LOC与脐橙螟LOC106139919(gi|913330692)蛋白的同源性为69%。系统进化树显示家蚕蚕蛹与美国白蛾亲缘关系比较近。理化性质预测结果显示LOC蛋白质不稳定。蛋白质结构预测结果显示LOC主要的结构为无规则卷曲。T细胞抗原表位预测得到8个肽段(9-17、79-87、93-102、104-115、124-132、152-160、223-231和244-251)。B细胞抗原表位预测得到个5肽段(34-49、59-74、127-142、202-217和213-228)。结论成功表达了家蚕蚕蛹LOC,并证实重组LOC蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究家蚕蚕蛹蛋白的结构成分、免疫学特性及理化性质提供了实验数据。

转基因香石竹中F3’5’H基因的克隆、表达和免疫学鉴定

在研究转基因香石竹品系月之霓裳(Moonshade)、月之伊人(Moonlite)中外源基因F3’5’H的表达中,本文克隆了F3’5’H全长基因1.5kb,构建获得工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)(+F3'5'H)。SDS-PAGE分析的结果显示,该菌株高效表达出F3’5’H重组蛋白,约占菌体总蛋白的30%。用经纯化的F3’5’H重组蛋白作为抗原,制备F3’5’H重组蛋白的抗血清,经ELISA免疫学分析表明,该抗血清的效价为1:25600。Western blot结果表明F3’5’H重组蛋白具有良好的IgG结合活性,且抗血清与转基因香石竹品系月之霓裳和月之伊人中的外源基因F3’5’H所表达的蛋白发生明显的抗原抗体反应。这样,月之霓裳和月之伊人用于评价转基因香石竹品系的环境安全性在我国也得到了验证。

猫过敏原白蛋白的克隆表达、纯化和免疫学特性鉴定

目的克隆、表达猫过敏原白蛋白(Fel d 2),并分析其过敏原活性。方法提取猫肝脏总RNA,逆转录合成cDNA,采用适宜引物进行PCR扩增目的基因,随后将其克隆到原核表达载体PET24a(+),在大肠杆菌中进行表达,镍亲和柱层析法提纯重组蛋白,Western blot检测其过敏原活性。结果序列分析表明所克隆白蛋白的序列由1 752 bp组成,编码584个氨基酸,与Genebank上的基因序列(NM 001009961)同源性为99.9%。SDS-PAGE显示表达的重组白蛋白Mr65 000。免疫印迹表明重组白蛋白具有与猫过敏原过敏病人血清IgE结合活性。结论表达的重组白蛋白具有与猫过敏患者血清IgE结合活性。

对一株基因工程人抗角蛋白抗体的免疫学鉴定

目的对1株基因工程人抗角蛋白抗体识别抗原的特性进行鉴定。方法利用从噬菌体抗体库中筛选到的特异表达抗角蛋白的Fab片段的质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达出Fab片段,用ELISA鉴定抗原结合活性和特异性,用蛋白免疫印迹和竞争抑制性ELISA检测抗体所识别的角蛋白组分。结果该株基因工程人抗角蛋白抗体的结合活性和特异性良好,所识别的抗原为相对分子质量46000角蛋白,为特异性人抗角蛋白K17抗体。结论该抗体具有优良的免疫学特性,有必要对其生物学活性和临床应用前景做进一步探讨。

花生主要过敏原Ara h2的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

花生中的Arah2蛋白是花生的主要过敏原，本研究从花生中克隆出Arah2的基因并表达了该蛋白，该蛋白具有特异的变应原性。

日本血吸虫22.6kDa膜相关蛋白Th1型表位的免疫学鉴定

目的鉴定日本血吸虫22.6 kDa膜蛋白（Sj22.6）的Th1型表位,为构建短肽疫苗奠定基础。方法采用合成肽Sj22.6-P4、无关肽（对照）及PBS免疫C57BL/6小鼠2次（间隔7 d）,末次免疫后7～10 d取脾分离单个核细胞,用合成肽Sj22.6-P4、无关肽及PBS刺激培养,3H-TdR掺入法检测淋巴细胞的增殖效果,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其细胞培养上清中IFNγ-、IL-4及IL-2水平。运用流式细胞技术三色标记法检测经合成肽Sj22.6-P4、无关肽及PBS免疫2次的C57BL/6小鼠脾淋巴细胞内的Th1、Th2细胞因子。结果合成肽Sj22.6-P4可刺激经该抗原肽免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞增殖,与PBS组相比,增殖指数（SI）均〉2。与无关肽对照组相比,细胞培养上清中IL-2、IFN-γ分泌水平增高,其中IL-2分泌水平差异有统计学意义（P〈0.05）,IFN-γ差异无统计学意义（P〉0.05）,而IL-4分泌水平明显降低（P〈0.05）。合成肽Sj22.6-P4免疫组小鼠脾脏CD4＋T细胞中分泌IFN-γ细胞的百分比显著增高,分泌IL-4细胞的百分比显著降低（P均〈0.05）。结论合成肽Sj22.6-P4是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位。

芝麻主要过敏原清蛋白基因的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

芝麻是亚洲地区重要的油料作物，主要含有两种储存蛋白，为11S的球蛋白和2S的清蛋白，这两种蛋白占芝麻中总蛋白的80％～90％，清蛋白是其中主要的致敏蛋白之一。从SWISS—PROT和TrEMBL以及NCBI的GenBank等数据库下载到一些芝麻中清蛋白的核酸序列，利用生物信息学方法对这些芝麻清蛋白序列进行同源性比对，确定其保守区域。