N端B细胞表位缺失的兔出血症病毒VP60蛋白的表达及其免疫原性

本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒rBac-VP60△A3C。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,重组蛋白VP60△A3C在Sf9细胞中高效表达,电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似。将重组蛋白VP60△A3C以每只200μg免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,免疫后14 d,以兔出血症病毒WF株攻毒新西兰兔。结果表明,免疫组无死亡,而对照组全部死亡。本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础。

N端携带HBGAs受体结合表位的兔出血症病毒嵌合VP60蛋白的表达及其免疫原性

将HBGAs受体结合表位插入兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60的N端,分析嵌合VP60蛋白的表达及病毒样颗粒(VLPs)形成情况,并研究N端HBGAs受体结合表位的插入对嵌合VP60蛋白免疫原性的影响。通过VP60蛋白N端起始位点HBGAs受体结合表位的插入,获得表位插入的VP60基因。利用Bac-to-Bac系统构建杆状病毒重组质粒,命名为Bacmid-VP60-CR,转染Sf9昆虫细胞后,得到重组杆状病毒rBac-VP60-CR,经HA、IFA和Western Blot鉴定,结果显示,重组蛋白VP60-CR在Sf 9昆虫细胞中得到高效表达,电镜观察显示其可形成与VP60类似的VLPs结构。将重组蛋白免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,200μg/只,免疫后每周采血检测HBGAs表位抗体水平,同时在免疫后14 d,以RHDV WF株攻毒观察VP60-CR重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,与VP60对照相比,VP60-CR蛋白可产生更高水平的针对HBGAs表位的抗体水平,且VP60-CR免疫兔可完全抵抗RHDV强毒的攻击。本研究构建了一种N端插入HBGAs受体结合表位的嵌合VP60蛋白,为研究高免疫原性兔出血症基因工程疫苗抗原奠定了基础。

山东省某规模化兔场GI.1a型兔出血症病毒的分子特性分析

2023年10月,山东省某规模化兔场(存栏2000只母兔)免疫过兔出血症(RHD)疫苗的经产母兔出现精神不振、体温升高、猝死等情况。为查明发病原因,采集4只病死兔组织进行细菌分离培养和病原核酸检测,并对检出的1份阳性样品(命名为S1001)进行了兔出血症病毒(RHDV)分型鉴定及遗传进化分析。结果显示:未分离到细菌,4份病料均为RHDV阳性;经测序S1001属于RHDV GI.1a基因型,其p16、p23、p29、VP10基因均属于GI.1a分支;与疫苗株(NJ株)相比,VP60基因的核苷酸同源性为95.9%,p16、p23、p29、VP10等蛋白分别存在9、18、11、2处氨基酸变化。蛋白结构预测结果显示,S1001 VP60蛋白的N端片层结构区变化明显,与参考株结构相似性为93%,TM-score为0.59(越接近于1,结构越相似)。结果说明:该兔场存在RHDV感染,感染的RHDV与疫苗株相比存在较多分子差异,蛋白构象变化有可能导致VP60蛋白抗原性发生变化。建议持续加强RHDV的遗传变异监测,及时掌握病毒变异情况,以期为新型疫苗研发奠定基础。

兔出血症病毒1、2型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立和应用

兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)的急性致死性传染性疾病。RHDV属于杯状病毒科(Calicivirus)兔病毒属(Lagovirus)。目前兔出血症病毒1型(GI.1)和兔出血症病毒2型(GI.2)2种基因型均有在我国流行。为了更好地进行流行病学调查、实时监测兔出血症发展趋势和临床诊断,建立了一种检测RHDV1型和RHDV2型病原的快速、简单、特异且敏感的Taq Man实时PCR。结果显示,稀释度为1×10^(8)~1×10^(4) copies/μL标准品建立的标准曲线有良好的线性关系,决定系数r^(2)为0.999;该方法对RHDV1型和RHDV2型具有高度特异性,与兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌等其他病原没有任何交叉反应;检测灵敏度为100~1000 copies/μL;组内和组间变异系数在0.01%~1.61%之间。用该方法对60份临床肝脏样品和52份鼻肛拭子样本进行检测,结果显示,RHDV检出率为70.5%,敏感性显著高于普通RT-PCR方法(51%)。因此,该方法能够同时检测RHDV1型和RHDV2型,可用于鉴别诊断兔出血症病毒。

兔多杀性巴氏杆菌和兔出血症病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立兔多杀性巴氏杆菌(Pm)和兔出血症病毒(RHDV)的双重PCR检测方法,本研究根据Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域,设计2对特异性引物,经PCR分别扩增Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域,构建重组质粒pMD-Pm和pMD-RHDV,并经菌液PCR和测序鉴定后作为重组质粒标准品。经各反应条件优化后初步建立了检测Pm和RHDV的双重PCR方法。反应条件优化结果显示,该方法的最适退火温度为59℃,扩增kmt1和VP60基因的最优引物浓度均为0.5μL(10μmol/L)。对Pm和RHDV及其他病原包括兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等20种相关病原的特异性试验结果显示,除Pm和RHDV有特异性扩增条带外,其余相关病原均无扩增条带,特异性较强。将两种重组质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后作为模板,经该双重PCR方法扩增。结果显示,该方法对pMD-Pm的检测限为17.9拷贝/μL,对pMD-RHDV的检测限为1260拷贝/μL,敏感性较高;对两种病原的DNA和cDNA混合物的批内和批间重复性试验结果均一致,重复性较好。对100份临床患病兔肺脏样品的检测结果显示,Pm和RHDV的阳性率分别为13%(13/100)和7%(7/100),二者混合感染率为37%(37/100),与已报道的Pm和RHDV单一PCR方法的检测结果均一致。表明该方法检测的准确性较高,可以用于临床样品的检测。本研究建立的同时快速检测Pm和RHDV的双重PCR方法为临床这两种病的诊断提供了技术支持。

Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP 60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用Ad Max腺病毒包装系统,基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组,构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞,通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证;利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3895和1752 bp的条带,测序比对结果显示,其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带;Western blotting结果显示,大小约为60 ku的VP60蛋白特异性条带;IFA观察结果显示,感染重组腺病毒的HEK293细胞产生了绿色荧光,表明重组病毒能在HEK293细胞中表达VP60蛋白,且该蛋白具有良好的抗原性;病毒滴度测定结果显示,初代重组腺病毒的TCID_(50)为10^(5.5)/0.1 mL。【结论】本试验构建了含RHDV2 VP 60基因的重组腺病毒,并成功表达了RHDV2 VP60蛋白,为进一步研究开发RHDV2疫苗提供了病毒模型。

鉴别检测兔出血症病毒1型、2型双抗体夹心ELISA方法的建立及应用

为实现对兔出血症病毒1型(RHDV1)和兔出血症病毒2型(RHDV2)的有效鉴别诊断,从而有效预防和控制兔出血症,将抗RHDV广谱单抗2A11作为捕获抗体包被于ELISA板,以HRP标记的抗RHDV1特异性单抗1D4、抗RHDV2特异性单抗6B3分别作为检测抗体,经条件优化,建立了鉴别检测兔出血症病毒1型、2型的双抗体夹心ELISA方法,并进行敏感性、特异性试验,对送检的60份兔肝脏样品用该双抗体夹心ELISA方法和RT-PCR方法进行检测,比较这2种方法的符合率。结果显示,该双抗体夹心ELISA方法的最佳工作条件为:捕获抗体浓度为4μg/mL,2种HRP标记的检测抗体的浓度均为0.5μg/mL;判定标准为:以检测抗体HRP-1D4检测样品D值>0.195判为RHDV1阳性,以检测抗体HRP-6B3检测样品D值>0.166判为RHDV2阳性;通过特异性和敏感性试验发现,该双抗体夹心ELISA方法具有较强特异性和较高敏感性。检测60份送检的兔肝脏样品,发现本方法与RT-PCR方法相比,检测RHDV1阳性样品的符合率为100%(9/9),RHDV2阳性样品的符合率为82.61%(19/23),阴性样品的符合率为87.5%(28/32),总符合率为93.33%(56/60),且该方法阳性样品检出率高于RT-PCR方法。本研究建立的双抗体夹心ELISA方法可有效地鉴别检测RHDV1和RHDV2这2种不同基因型的病毒,为兔出血症的流行病学研究提供有力的技术支撑。

两株GI.1型和GI.2型兔出血症病毒RdRp基因的克隆与分析

为了解兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)RdRp基因的遗传稳定性和变异规律,本研究分别克隆了RHDV SCH04株和RHDV2 SCCN03株的RdRp基因,然后对基因序列进行比对和系统发育分析,并通过编码蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜区域、二级结构、三级结构、磷酸化和糖基化修饰位点的预测,对RdRp进行生物信息学分析。结果显示,两株RdRp基因序列全长均为1548 bp,编码516个氨基酸。GI.1型RHDV毒株间序列相似性为86.9%~99.9%,GI.2型RHDV毒株间为91.3%~99.9%。GI.1型和GI.2型RHDV毒株间序列相似性为84.3%~88.3%。SCH04株和SCCN03株分别属于GI.1a型和GI.2型RHDV,且SCH04株和SCCN03株的RdRp基因核苷酸序列相似性为84.95%,其编码蛋白存在17个氨基酸差异位点,氨基酸序列相似性为96.71%;二者均属于稳定蛋白,不存在信号肽和跨膜区域;其分子量、等电点、脂溶系数、平均亲水系数和不稳定系数等指标无显著差异。SCH04株RdRp的α螺旋和β转角比例比SCCN03株略高,分别为41.86%和4.26%,而SCCN03株RdRp的延伸链和无规则卷曲比例比SCH04株略高,分别为12.79%和43.41%;SCCN03株RdRp比SCH04株多4个磷酸化位点和1个N-糖基化位点。分析结果表明不同型间RHDV RdRp基因核苷酸变异率较高,GI.1 RHDV毒株间的变异范围大于GI.2 RHDV毒株。SCH04株和SCCN03株RHDV RdRp的氨基酸序列相似性高于核苷酸序列相似性,其二级结构和高级结构差异较小,遗传相对稳定。本研究为RHDV的遗传演变和生物合成等分子病原学研究提供了科学参考。

兔出血症病毒和多杀巴氏杆菌嵌合蛋白VP60-Plp E的构建及其免疫原性鉴定

兔病毒性出血症(兔瘟)和兔巴氏杆菌病是对家兔危害最严重的两种疫病。用于防控这两种疫病的二联灭活疫苗存在着生产成本偏高问题。虽然基因工程亚单位疫苗的应用有助于提升二联苗的效力,但是生产成本依然偏高。本研究的目的是获得一种嵌合了巴氏杆菌保护性抗原PlpE的表位的兔出血症病毒VP60重组蛋白。首先通过Bepipred-2.0分析,确定PlpE的免疫显性区域主要位于N端。然后将编码PlpE26-45位、51-95位氨基酸序列的基因片段连接到VP60基因的5’端和3’端,并通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得嵌合了PlpE表位的重组蛋白VP60-PlpE。血凝试验显示VP60-PlpE具有明显的血凝活性,提示重组蛋白仍然能够形成病毒样颗粒。Western blot实验结果表明VP60-PlpE与PlpE抗血清反应明显。小鼠免疫保护力实验表明VP60-PlpE对巴氏杆菌具有免疫保护力。家兔免疫保护力实验表明VP60-PlpE对兔出血症病毒和巴氏杆菌均具有免疫保护作用。总之,本研究成功构建出一种嵌合了巴氏杆菌保护性表位的兔出血症病毒VP60,为研制更低成本的兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病亚单位疫苗提供了基础。

兔出血症病毒2型SC株VP60蛋白特异性单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得我国兔出血症病毒2型(RHDV2)SC株特异性单克隆抗体,研究以纯化RHDV2作为抗原免疫BALB/c小鼠,4次免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA方法筛选,获得一株能够稳定分泌RHDV2 VP60蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为6B3。经Western blot和间接免疫荧光试验验证,该单克隆抗体可识别RHDV2,不与RHDV1反应,具有良好的毒株特异性。亚型鉴定结果为IgG3,轻链为Kappa型,腹水ELISA效价为1∶80 000。本研究得到的针对RHDV2的特异性单抗,将对我国兔出血症的诊断及流行病学调查提供有效制剂。

兔出血症病毒经典毒株和变异毒株的RT-PCR鉴定

本研究旨在建立鉴别兔出血症病毒经典毒株(RHDV)和变异毒株(RHDV2)的RT-PCR检测方法。根据Gen Bank中经典RHDV和RHDV2的VP60基因序列,设计2对分别结合两种基因的特异性引物。利用2对引物,以人工合成RHDV2的VP60基因构建的p MD19-T-VP60-2和p MD19-T-VP60为模板,进行RT-PCR体系退火温度的优化,优化后的退火温度为58.2℃。对优化后的RT-PCR体系进行RHDV和RHDV2的敏感性试验、特异性试验,并用于检测RHDV人工感染样品和疑似临床样品,结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性,经典RHDV和RHDV2的检测限度分别为95拷贝和76拷贝的靶基因片段,且对支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌等病原以及重组质粒p MD19-T-EBHSV的检测结果均为阴性。RHDV人工感染的组织样品检出率为100%,15份临床样品中3份为经典RHDV阳性,其他均为经典RHDV及RHDV2阴性。该方法的建立能够实现快速、特异及敏感地检测RHDV和RHDV2,为监测RHDV变异株的流行情况提供技术支撑。

1例兔出血症病毒2型感染疫情的诊断

旨在了解河南疑似兔出血症病毒2型(RHDV2)的感染情况,并对RHDV2的致病性进行初步分析。本研究采集病死兔的肝组织,利用微量血凝试验、RT-PCR扩增及测序、VP60基因系统进化树分析和动物回归试验进行病原鉴定。微量血凝试验结果显示,组织样本悬液能够凝集人“O”型血红细胞;RT-PCR扩增、测序及序列分析结果显示,检测到RHDV2特异性条带,片段大小为829 bp;系统进化树分析结果发现,分离的病毒与我国四川发现的首例RHDV2毒株SC2020/04的VP60基因相似性高达98.2%;临床病例的剖检显示病死兔胸腺、气管、肺、肝、脾、肾等实质性器官出血较为严重;动物回归试验发现攻毒组家兔死亡率为100%,平均死亡时间为65.8 h,RT-PCR扩增均检测到RHDV2特异性条带。本研究首次在河南兔场检测到RHDV2,为RHDV2的防控提供了科学参考。

兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果

用RT—PCR方法扩增兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白VP60基因，通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid—VP60，用此质粒转染Sf9昆虫细胞，得到重组病毒rAcV—Bac—VP60，经RT—PCR、IFA、SDS-PAGE、Western blotting、HA和HI鉴定，结果显示重组VP60蛋白在Sf9昆虫细胞中得到表达。在不加任何佐剂的情况下，用表达的蛋白免疫3月龄非RHD免疫兔，结果显示，免疫后21天，兔体内可产生抗RHDV抗体，抗体血凝抑制效价为2^6～2^7，该抗体可以抵抗血凝效价为2^10致死剂量RHDV强毒的攻击，本研究为兔病毒性出血症基因工程疫苗的研制奠定了基础。

兔出血症病毒RT-PCR检测方法的建立及其临床应用

本研究旨在建立检测兔群鼻拭子中兔出血症病毒(RHDV)的RT-PCR方法,研究健康免疫兔群是否存在携带RHDV现象。根据GenBank上公布的RHDVvp60基因保守序列,设计了1对特异性引物,经cDNA的合成和PCR扩增,目的片段大小为591bp。结果表明该方法能检出最小RNA浓度为2.40ng·μL-1,敏感性为血凝试验(HA)的8×103倍。通过对自5个省采集的168份健康免疫兔鼻拭子样品进行检测,结果显示,阳性样品为22份,阳性率为13.09%。试验表明:RT-PCR方法能快速、敏感地从健康免疫兔鼻拭子样品中检出RHDV,提示健康免疫兔群存在携带RHDV的现象,该方法适合临床进行大规模病原学检测和兔群携带病毒的调查,具有良好的应用前景。

兔出血症病毒2型的分离鉴定与序列分析

兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种具有高度传染性、急性致死性兔病。兔出血症病毒2型(RHDV2)引起的RHD主要在欧洲流行,病兔的死亡率高达90%,而用经典RHDV毒株制备的疫苗几乎不能预防家兔感染RHDV2,从而给世界养兔业造成了巨大的经济损失。2020年4月,中国四川省某兔场首次发生由疑似RHDV2引起的RHD,笔者所在实验室通过红细胞凝集试验(Hemagglutination,HA)、逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增、vp60基因序列分析和病毒复制试验,对采集的病死家兔肝脏样本进行病原鉴定。HA结果显示,部分病死家兔的肝脏样本不能引起血凝现象;RT-PCR结果显示,样品中出现了RHDV2的特异性条带。对新发现毒株cDNA的RT-PCR产物进一步分析发现,所扩增vp60基因核苷酸序列与经典RHDV vp60基因核苷酸序列的一致性为77.5%~80.1%,与RHDV2 vp60基因核苷酸序列的一致性为93.6%~96.1%,并且与RHDV2处于同一个进化分支。病毒复制试验结果显示,用病死家兔肝脏组织与磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)按1 g∶10 ml混合后制成的悬液分别人工感染5只非免疫25日龄未断奶仔兔和5只2月龄兔,在24~48 h全部死亡。基于以上试验结果,确定本研究新发现的RHDV毒株为RHDV2,并将其命名为SC2020,这是在中国首次发现RHDV2毒株,应引起高度重视。

兔出血症病毒胶体金免疫层析试纸条诊断方法的建立及初步应用

为了建立一种快速、简便的兔出血症病毒(RHDV)的检测方法,用胶体金标记纯化的RHDV多克隆抗体,以杆状病毒表达系统表达的重组RHDV VP60蛋白为免疫原制备RHDV的单克隆抗体(McAb,简称单抗)A3C,将RHDV McAb和羊抗兔IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,经条件优化研制成RHDV免疫胶体金试纸条。该试纸条可以检出红细胞凝集试验(HA)效价为1∶10的RHDV悬液,即HA检测为阴性的样品,该试纸条检测为阳性,其敏感性高于HA;特异性试验结果显示,该试纸条不与家兔其他常见病菌发生交叉反应。应用该试纸条对127份疑似兔出血症家兔肝脏样品进行初步检测,同时用HA做平行试验,阳性符合率为100%。因此,该试纸条是一种快速、灵敏、特异的兔出血症病毒检测方法,为兔出血症的现场诊断提供了有效的方法,显示出很好的临床应用前景。

一株无血凝性兔出血症病毒的分离鉴定及其衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

从临床病料中分离鉴定出1株无血凝性的致病性兔出血症病毒（RHDV），命名为Yaan-1。HA试验测得该毒株原代及经兔体传3代后的肝毒在25℃、37℃和4℃时均无血凝性；但在琼脂扩散试验和对流免疫电泳中均可见分离株与常规RHDV高免血清形成清晰的沉淀线；电镜观察可见30nm左右的病毒粒子。采用RT-PCR方法将Yaan-1株的衣壳蛋白VP60基因进行了克隆测序，序列分析表明VP60基因序列全长1740bp，编码579个氨基酸，测序结果提交GenBank（注册号为DQ069280），并与世界各国的常规RHDV分离株进行比较，结果表明核苷酸同源性为90．0％～98．0％，氨基酸同源性为94．1％～99．0％，氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区；同时对Yaan-1株的分子量、等电点、疏水性、跨膜区等分子结构特征进行了分析。本研究首次报道了无血凝性RHDV中国分离株，丰富了地方毒株资源，为明确我国地方株的分子流行病学，以及对VP60蛋白分子特征研究提供了新材料。

兔出血症病毒双夹心ELISA检测方法的建立

为建立特异性好、敏感度高、稳定可靠的检测兔出血症病毒的双夹心ELISA方法。该试验制备了兔出血症病毒多抗和小鼠腹水单抗,并将他们提纯。用方阵法筛选最佳反应浓度,用特异性试验、敏感度试验和重复性试验对该方法进行鉴定,并同时用双夹心ELISA和血凝试验(HA)对52份待测兔肝脏样品进行检测,比较这两种方法的符合率。结果显示:兔出血症病毒多抗最佳稀释度为1∶400,浓度为19.50 mg/L;单抗的最佳稀释度为1∶800,浓度为2.86 mg/L。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法特异性强、敏感度高。对52份待检兔肝脏样品的检测结果显示:双夹心ELISA和HA试验的阳性检出率分别为82.7%(43/52)和75.0%(39/52),双夹心ELISA与HA试验的符合率为90.7%。用不同批次包被的酶标板重复检测已知样品显示出良好的重复性。以上试验结果表明该双夹心ELISA方法是检测RHDV的一种特异、敏感、快速、经济的免疫学检测技术。

检测兔出血症病毒抗体胶体金试纸条的研制及初步应用

利用免疫层析技术建立快速检测兔出血症病毒(RHDV)抗体的方法,将胶体金标记重组RHDV VP60蛋白,抗VP60单抗A3C和金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)分别包被质控线(C线)和检测线(T线),通过检测强阳性、阳性、弱阳性、阴性血清优化试纸条制备条件,并验证其性能及与血凝抑制试验的符合率。结果显示,试纸条检测阳性血清时T线、C线颜色深度相同,强阳性血清T线比C线颜色深,弱阳性血清T线比C线颜色浅,阴性血清T线不显色、C线显色,检测强阳性、阳性、弱阳性、阴性血清与血凝抑制试验的符合率分别为93.75%、88.75%、91.25%、95.00%,总的符合率为91.54%;该试纸条具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,为兔病毒性出血症流行病学调查和抗体水平监测提供了有力的检测工具。

兔出血症病毒(RHDV)WHNRH株的分离鉴定及基因组全序列的测定与分析

从发病长毛兔中分离鉴定了兔病毒性出血症病毒WHNRH株。参考GenBank中已登录的RHDV毒株序列对RHDV WHNRH分离株进行了全基因组序列测定与分析。设计5对扩增区段相互重叠的RHDV特异性引物，扩增除5’和3’末端以外的序列，采用设计锚引物的5’RACE方法以及针对RHDV 3’末端的polyA结构设计引物获得了RHDV WHNRH株的5’和3’末端序列。胶回收各PCR产物，连接pMD18-T克隆载体，测得RHDV WHNRH分离株的基因组全长为7437nt（不包括polyA），与GenBank公布的全部共6株RHDV全基因序列进行同源性比较分析，同源性在89．0％～97．1％之间，ORF1同源性为89．0％～97．1％，编码氨基酸序列的同源性为95．2％～98．7％；ORF2的核酸苷序列同源性为92．1％～97．7％，编码氨基酸序列的同源性为94．1％～96．6％。