多态性BoLAⅠα1α2与恒定链结合及在真核细胞共定位

目的:探明牛主要组织相容性复合体(BoLA)Ⅰ类分子α链的多态性和结合恒定链(Ii)的结构域。方法:从3头淮北黄牛获得75条BoLAⅠα基因序列,应用分子生物学软件进行比对分析;克隆典型BoLAⅠα结构域和Ii基因插入原核表达质粒,诱导蛋白表达后进行纯化鉴定,用拉下法和免疫印迹检测BoLA Iα链与Ii结合的结构域。构建相应真核重组质粒,应用激光共聚焦显微镜观察其BoLAⅠα片段与Ii在细胞内共定位。结果:首先,所克隆的BoLAⅠα基因序列存在至少5种基因型,呈现高度多态性,分布于该分子的抗原肽结合区域(α1α2)和胞浆区。其次,构建的含BoLAⅠα1α2α3、BoLAⅠα1α2和BoLAⅠα3基因的原核重组质粒经诱导表达和蛋白纯化,其中,BoLAⅠα1α2α3、BoLAⅠα1α2具有结合Ii的活性功能。最后,在293T细胞内BoLAⅠα1α2α3和BoLAⅠα1α2与Ii共定位,而单一BoLAⅠα3却不能。结论:BoLAⅠα基因具有高度多态性,BoLAⅠα1α2是与Ii结合和胞内共定位的功能片段。

原子力显微镜-扫描电子显微镜共定位表征系统的研发与应用

微纳加工过程中,常有样品需要进行聚焦离子束(FIB)溅射、切割,扫描电子显微镜(SEM)以及原子力显微镜(AFM)表征,而这三类仪器都需要将样品固定在样品台上才可测试,固定不佳会影响表征结果.但固定好的样品在不同仪器之间转移、拆卸、再固定的过程中极易受到破坏.基于以上问题,设计了AFM-SEM-FIB样品共定位系统,可实现样品在此三种仪器之间的无损转移及共定位,避免珍贵样品破坏及目标丢失,以及解决AFM扫描无法控制方向、迅速调整位点等问题.在微纳表征中有优异的表现,系统已被开发成产品并量产销售.

多囊卵巢综合征生物学标志物探索:孟德尔随机化和共定位分析

目的 采用基于汇总数据的孟德尔随机化(SMR)和共定位分析,整合多组学数据来探索与PCOS发病风险相关的生物学标记物。方法 基因表达和蛋白质丰度的遗传汇总数据分别来自GTEx/eQTLGen数据库和Ferkingstad等的研究,PCOS的全基因组关联分析(GWAS)数据来自FinnGen和UKB数据库,采用SMR分析来评估基因/蛋白质与PCOS发病风险之间的因果关系,并对候选基因进行共定位分析以进一步探索基因/蛋白与PCOS之间潜在的共同因果变异。结果 SMR分析结果发现,共有323个基因、26个蛋白与PCOS发病风险相关(Pvalue<0.01,PHEIDI>0.05),其中有7个基因在蛋白丰度和基因表达层面都与PCOS发病风险相关,结合共定位分析结果,共得到4个基因在基因表达和蛋白丰度层面均与PCOS发病风险相关,且具有中高水平证据的共定位。在蛋白丰度层面上,ATP1B2[OR=1.274,95%CI(1.091,1.487)]的高表达与PCOS发病风险增加相关,而ATOX1[OR=0.345,95%CI(0.169,0.704)]、RIDA[OR=0.730,95%CI(0.613,0.869)]和STX8[OR=0.291,95%CI(0.123,0.689)]的低表达与PCOS发病风险增加相关。结论 ATOX1、ATP1B2、RIDA和STX8可能与PCOS发病存在因果关系。

激光扫描共聚焦显微镜使用中荧光共定位的一种计算方法

激光扫描共聚焦显微镜在形态学、分子细胞生物学、神经科学和药理学等研究领域得到广泛地应用,荧光共定位计算是该仪器的一种重要应用功能。共定位计算的结果为肿瘤治疗过程中药物与肿瘤的作用机理研究提供了依据之一,推动了肿瘤精准定位治疗的发展。随着科技的进步和科研的深入,人们对共定位的分析结果要求越来越高。本文提出的激光共聚焦显微镜荧光共定位计算方法,通过3D构建和反卷积,获得了更加真实的荧光共定位计算结果。

黄体生成素和卵泡刺激素在大鼠垂体前叶的细胞共定位研究

为探讨卵泡刺激（ＦＳＨ）与黄体生成生素（ＬＨ）分泌及基因表达与调控用抗人ＬＨ－β亚单位单克隆抗体和抗人ＦＳＨ－β亚单位单克隆抗体进行免疫细胞化学定位的研究。通过连续切片免疫酶技术，免疫细胞化学双标记及电镜免疫金双标记技术，在大鼠垂体前叶进行ＦＳＨ和ＬＨ的免疫细胞化学共定位研究。结果表明：存在着棕（ＤＡＢ显色示ＦＳＨ）、蓝（ＣＮ显色示ＬＨ）及棕蓝混合染色细胞；电镜免疫金双标记发现分别被１５ｎｍ金粒（示ＦＳＨ）、１０ｎｍ（示ＬＨ）及被１５ｎｍ、１０ｎｍ金粒同时标记的３种细胞（另文报道）；光镜连续切片染色亦发现ＦＳＨ阳性、ＬＨ阳性及ＦＳＨ－ＬＨ双阳性３种细胞。因此可以确定垂体前叶存在３种促性腺激素（ＧＴＨ）细胞，即ＦＳＨ细胞（只含ＦＳＨ）、ＬＨ细胞（只含ＬＨ）和ＦＳＨ－ＬＨ细胞（既含ＦＳＨ又含ＬＨ）。

大豆全基因组分枝相关基因发掘及与QTL共定位

大豆(Glycine max)分枝在个体和群体水平上均与大豆产量关系密切,因此大豆分枝相关基因的发掘及利用对大豆高产分子育种具有重要意义。文章通过GO(Gene ontology)分类和文献检索共获得植物分枝发育相关基因183个。基于序列相似和结构域相同的原则,从大豆基因组中发掘出大豆分枝相关的候选基因406个。通过收集已发表的大豆分枝相关QTL,利用BioMercator2.1软件,将符合映射条件的35个QTL映射到公共图谱的12个染色体。通过共定位分析发现,在20个分枝相关的QTL区间内存在大豆分枝相关候选基因57个。本文发掘的分枝发育相关基因信息为大豆分枝相关QTL的精细定位和克隆以及大豆分枝发育的分子生物学基础研究提供了参考。

腺病毒E1B55ku癌蛋白打破hDaxx与PML在细胞核的共定位

利用间接免疫荧光试验 ,通过Confocal激光扫描生物荧光显微镜和图像软件分析腺病毒 (adenovirus,Ad)E1B 5 5ku癌蛋白 (AdE1B 5 5ku)与人Daxx(humanDaxx ,hDaxx)在细胞核的定位关系 ,研究它对早幼粒细胞性白血病蛋白 (promyelocyticleukemiaprotein ,PML)与hDaxx在细胞核定位关系的影响。实验结果表明 ,AdE1B 5 5ku与hDaxx共定位细胞核 ,并打破hDaxx与PML共定位于细胞核PML致癌结构域 (PMLoncogenicdomains,PODs)

大鼠颌下腺雄激素受体的免疫定位及与促性腺激素释放激素受体的共定位关系

目的 :研究大鼠颌下腺雄激素受体 (AR)的存在及其与促性腺激素释放激素受体 (GnRHR)的免疫共定位关系 ,证明颌下腺是雄激素和GnRH的一个靶器官。 方法 :制备大鼠颌下腺石蜡连续切片 ,以免疫组化SABC法分别研究AR和GnRHR的免疫定位。 结果 :大鼠颌下腺浆液性腺泡上皮细胞、颗粒曲管、排泄管及分泌管上皮细胞内有AR免疫反应性物质存在。阳性物质分布于胞质内 ,胞核阴性。邻片双标记染色结果显示 :GnRHR免疫反应性物质也存在于上述细胞内。阳性物质分布在胞质 ,胞核阴性。 结论 :大鼠颌下腺存在AR ,是雄激素的靶器官 ,而且 ,雄激素和GnRH在颌下腺有相同的靶细胞 。

HIV衣壳蛋白P24与TRIM22在HEK293T细胞中的表达及共定位

目的观察人类免疫缺陷病毒(HIV)衣壳蛋白P24与三基序蛋白22(TRIM22)在HEK293T细胞中的共定位情况。方法以慢病毒载体p LP1为模板,通过PCR法扩增p24编码序列,克隆至p DsRed-Monomer-N1真核表达载体。经菌落PCR、双酶切及DNA测序进行鉴定。将p DsRed-Monomer-N1-p24与p EGFP-N3-TRIM22载体共同转染HEK293T细胞,用荧光显微镜观察p24-DsRed-Monomer和TRIM22-EGFP的表达及共定位情况。结果经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,成功构建p DsRedMonomer-N1-p24真核表达载体。通过荧光显微镜检测发现,p24-DsRed-Monomer和TRIM22-EGFP在HEK293T细胞中存在共定位关系。结论 HIV衣壳蛋白P24与TRIM22存在共定位。

共聚焦和超分辨率显微荧光图像的共定位分析浅谈

共定位分析是研究蛋白或分子相互作用的有效工具。荧光显微图像的共定位分析包括定性分析和定量分析两部分。严格而言,共定位分析是使用共定位系数去描述两个或以上的分子间变量关系。目前,许多研究工作者对荧光显微图像的共定位分析需求大。然而,对需要做共定位分析的样品要求、采图要求和分析方法等普遍存在疑问。在本文中,笔者结合多年成像类设备共享服务的经验,基于激光共聚焦和超分辨率荧光显微图像,详细阐述共定位定性和定量分析的方法,以供其他科研工作者参考和借鉴。

激光共聚焦扫描显微镜观察ERα和MTA1在乳腺癌细胞内的共定位

目的:观察ERα和MTA1在乳腺癌细胞内的共定位。方法:在有无雌激素或拮抗剂刺激下,利用激光共聚焦扫描显微镜观察ERα和MTA1在乳腺癌细胞系MCF-7中的共定位。结果:在无雌激素刺激下两者共定位于细胞浆和细胞核,而在雌激素刺激后两者则共定位于细胞核内。在雌激素受体拮抗剂刺激下,两者在细胞浆内定位增加。结论:雌激素和雌激素受体拮抗剂刺激乳腺癌细胞改变ERα和MTA1的共定位。

N-甲基-D-门冬氨酸受体与使君子酸受体在培养海马神经元树突上的膜表面表达与共定位

目的 研究含NR2B亚单位的N 甲基 D 门冬氨酸 (NMDA)受体 (NR2B NMDAR)与含GluR1亚单位的使君子酸 (AMPA)受体 (GluR1 AMPAR)在发育不同阶段的培养海马神经元树突上的膜表面表达与共定位。 方法 以FLAG NR2B和GFP GluR1表达载体共转染原代培养第 5d(DIV5 )的大鼠海马神经元 ,分别用相应特异性抗体和荧光标记二抗作活细胞染色 ,显示膜表面表达的受体簇。 结果 对DIV7和DIV14的培养海马神经元树突表面受体簇计数 (个数 10 0 μm) ,GluR1 AMPAR受体簇分别为 5 9 2± 5 6和 74 8± 3 1(P <0 0 5 ) ;NR2B NMDAR为 38 7±3 5和 80 8± 4 9(P <0 0 1) ;两者共定位为 16 3± 5 2和 4 0 1± 6 0 (P <0 0 1)。DIV14海马神经元 4 0 %的共定位受体簇分布在树突棘上。 结论 随着海马神经元的发育 ,树突膜表面NR2B NMDAR、GluR1 AMPAR及两者共定位受体簇密度均增加 ,提示 ,形成更多具有活性的兴奋性突触 ,且主要位于树突棘上。

TRIM22与HIV衣壳蛋白p24在脑胶质瘤细胞中的表达特点及共定位研究

目的观察外源性三基序蛋白22(TRIM22)与HIV衣壳蛋白p24在U-251脑胶质瘤细胞中的表达特点及共定位情况。方法分别将pEGFP-N3-TRIM22或pDsRed1p24载体转染U-251细胞,通过激光共聚焦显微镜观察TRIM22-EGFP和p24-DsRed1的表达和分布情况。通过激光共聚焦xyz轴扫描,经ImageJ 1.50i软件进行3D结构重建,观察p24-Dsred1在U-251细胞中的分布特点。将pEGFP-N3-TRIM22和pDsRed1p24载体在U-251细胞中共表达,观察TRIM22-EGFP和p24-DsRed1是否存在共定位关系。结果单独转染pEGFP-N3-TRIM22或pDsRed1p24载体时,TRIM22-EGFP和p24-DsRed1在U-251细胞的胞体或突起中均有较高水平的表达;且3D结构重建显示外源性p24-DsRed1可迁移至U-251细胞的足突。在U-251细胞共转染pEGFP-N3-TRIM22和pDsRed1p24载体时,TRIM22-EGFP与p24-DsRed1存在共定位关系,并能以出胞形式脱离细胞。结论 TRIM22与HIV衣壳蛋白p24在U-251脑胶质瘤细胞中存在共定位关系。

玉米根细胞中类整合素蛋白与α-微管蛋白的共定位及其可能的相互作用(英文)

采用间接免疫荧光标记法对玉米根细胞中的类整合素蛋白和细胞骨架主要组分之一的α-微管蛋白进行了荧光定位。结果表明:类整合素蛋白主要分布在质膜上。与对照相比,用与类整合素蛋白特异结合的5肽GRGDS处理后,质膜上类整合素的分布更为均匀,微管的排列密度降低,而用不与类整合素蛋白特异结合的GRGDS类似物SDGRG处理则对类整合素蛋白分布和微管蛋白的排列均无明显影响。微管蛋白解聚剂或稳定剂处理改变类整合素在质膜上的分布。这些结果表明类整合素蛋白与微管蛋白间有复杂的相互作用。

水稻R基因同源序列与遗传学上已知抗病基因的共定位

植物抗病（R）基因结构上的高度保守性，为利用基于PCR的方法快速分离R基因同源序列提供了基础。采用这种方法，我们曾从水稻中分离到8个R基因侯选同源序列9R genecandidates,RGCs)。为了研究RGCs与遗传学上已知的R基因的关系，对它们进行了限制性片段长度多态性（RFLP）分析和染色体定位。DNA杂交结果显示RGCs都属于多基因家族（Fig.1)。6个RGCs（Osh359－1、Osh359-2、Osh359-3、Osh359-5、Os8558-3、Os8558-14）在两个灿稻品种H359和Acc8558中检测出多态性，并定位在水稻染色体上（Fig.2)。它们分别检测出了1、1、4、1、2个1个座位，共10个座位，其中9个定位在第11号染色体的3个区域上，即RFLP标记G181之间（由Osh359-2、Osh359-3、Osh359-5和Osh359-3检测的6个座位），G1465与C50之间（Osh359-3检测出的一个座位），和C496附近（由Osh359-1和Os8558-14检测出的两个紧密连锁的座位）另有一个由Os8558－3检测出的座位定位到第8号染色体上，位于L457和G1092B之间，这些染色体区域包含近一半的遗传学上已知的抗病基因，如Xa-3、Xa-10、Pi-a和xa-13。这一结果表明RGCs与已知的抗病基因位于相同的染色体区域。此外，RGCs定位的结果,它们在水稻基因组中呈簇状分布，表现出与R基因快速形成不同的抗病特异性的一致（Fig.3&Tab.1)。本研究的结果显示，水稻的第11号染色体，特别是其中的一些区域，与水稻的抗病性紧紧相关，比如：在G181和C82之间，存在6个紧密连锁的RGCs座位，且它们覆盖的染色体区段仅约4cM，相当于1Mb。对该区域的进一步研究将对R的进化和特异性的产生提供新的证据和启示，用至发现新的抗病基因。同时，利用R基因结构的保守性，采用PCR方法，有可能广泛地应用于其它作物新的抗病基因的分离。

板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光蛋白共定位载体的构建

低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统。我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿色荧光蛋白的转化株pCPXHY2GFP/EP155和以G418为筛选标记、表达红色荧光蛋白的转化株pCPXG418RFP/EP155。将载体pCPXG418RFP转化pCPXHY2GFP/EP155,获得的转化株能观察到绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白共定位的现象。板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光共定位载体pCPXHY2GFP与pCPXG418RFP的构建,为深入研究病毒与宿主相互作用的分子机制提供了强有力的研究材料。

FK506结合蛋白25及其突变体与CLIC1蛋白在真核细胞内共定位的研究

目的研究FK506结合蛋白25（FKBP25）野生型及其突变体在真核细胞内的表达、定位及与胞内氯离子通道蛋白1（CLIC1）的共定位情况。方法以pc DNA3.1-FKBP25-FLAG为模板,分别构建以p CDGFP为载体的FKBP25野生型及其缺失突变体FKBP25（1～42 aa）、FKBP25（1～110aa）、FKBP25（43～224 aa）、FKBP25（43～110 aa）、FKBP25（111～224 aa）的真核表达质粒,并分别转染至HEK 293T细胞中,Western blot法检测重组蛋白表达情况;将上述质粒分别与带FLAG标签的CLIC1质粒共转染至COS7细胞,激光共聚焦扫描显微镜下观察、分析荧光共定位情况。结果成功构建了p CDGFP-FKBP25基因的一系列真核表达质粒;Western blot显示：p CDGFP-FKBP25及其突变体p CDGFPFKBP25（1～42 aa）、p CDGFP-FKBP25（1～110 aa）、p CDGFPFKBP25（43～110 aa）、p CDGFP-FKBP25（43～224 aa）、p CDGFP-FKBP25（111～224 aa）均能在HEK 293T细胞中有效表达;GFP-FKBP25野生型在COS7细胞中主要分布在细胞质中,细胞核中表达较少,而突变体在细胞质、细胞核均有表达,而且细胞核中的表达多于野生型。共定位实验结果表明：野生型FKBP25蛋白与CLIC1蛋白在细胞质内存在明显的共定位现象。其3个缺失突变体与CLIC1蛋白的共定位明显减少,而且共定位也存在区别：FKBP25-N与CLIC1共定位主要于细胞核中,部分分布于细胞质;FKBP25-PC和FKBP25-C与CLIC1只共定位于细胞质中。结论荧光共定位实验观察到FKBP25野生型及其3种突变体FKBP25（1～42aa）、FKBP25（43～224 aa）、FKBP25（111～224 aa）与CLIC1蛋白存在不同程度的共定位现象,为进一步揭示FKBP25的生物学功能提供了基础。

鲫疱疹病毒ORF31R(CaHV-31R)的特征及其编码蛋白与细胞器共定位

鲫疱疹病毒(Carassius auratus herpesvirus, CaHV)是一种引起鲫急性鳃出血症和高死亡率的病毒病原。病毒要借助功能基因与细胞组分(如细胞器)的相互作用才能完成感染与复制。本实验通过生物信息分析、PCR扩增、重组质粒构建及其与细胞器标记质粒共转染鱼细胞(epithelioma papulosum Cyprinid, EPC)的荧光观察,对预测鲫疱疹病毒基因CaHV-31R编码蛋白的特性、亚细胞定位及与细胞器共定位进行研究。结果显示,鲫疱疹病毒编码蛋白CaHV-31R由313个氨基酸组成,含一个跨膜结构域(248～270 aa)和一个RNase E/G家族蛋白的典型结构域(40～182 aa);与5种来源鲤疱疹病毒同源蛋白多重比对发现,与鲤疱疹病毒II型中的日本株ST-J1和中国株SY-C1的同一性较高(分别为100%和80.7%),与鲤疱疹病毒I型代表株CyHV-1的同一性居中(为26.5%),而与鲤疱疹病毒III型中的德国株CyHV-3(或称锦鲤疱疹病毒Koi herpesvirus,KHV)和中国株CyHV-3-GZ11的同一性最低(分别为20.7%和18.2%);经基因扩增和构建真核重组质粒pEGFP-31R,当用其单独转染EPC细胞,绿色荧光信号主要在细胞质中呈弥散分布,少量在细胞质中或在细胞核外围呈点状分布;当用pEGFP-31R与内质网标记质粒pDsRed2-ER或与高尔基体标记质粒pDsRed2-Golgi共转染细胞,绿色荧光信号在胞质中的分布情况与单独转染时不同,分别能与2种有单层膜结构的细胞器—内质网和高尔基体共定位。研究表明,CaHV-31R是鲫疱疹病毒中一个能编码与细胞器共定位蛋白的基因。