赭曲霉11α羟化酶的克隆表达及关键氨基酸位点分析

11α,17α-双羟基黄体酮是甾体激素类药物的重要中间体,工业上主要利用霉菌对17α-羟基黄体酮的11α羟化反应制备。对赭曲霉的11α羟化酶及其关键氨基酸位点展开研究,为深入解析酶的催化机理提供基础数据。利用底物转化实验探究了10个羟化反应常用霉菌对17α-羟基黄体酮的转化能力,考察了赭曲霉来源的11α羟化酶CYP68J5在不同表达系统中的活性,借助结构预测、分子对接和定点突变等手段对CYP68J5的关键氨基酸位点进行解析。结果表明,赭曲霉的转化能力最强,转化时间60 h的摩尔产率达到最大值,为78.55%;其羟化酶CYP68J5在酿酒酵母中的表达活性最高;位于底物结合口袋附近的D118、F216、M488是CYP68J5的关键氨基酸位点,这些位点在维持酶的结构稳定性上发挥重要作用,是后续分子改造的潜在重要靶点。

影响猪流感病毒致病性和传播性的关键氨基酸位点的研究进展

猪流感病毒(SIV)在猪群中广泛传播,给养猪业造成重大的经济影响。流感病毒主要是通过病毒基因组的突变和不同来源流感病毒基因组的重新组合来完成自身的进化。通过以上两种方式产生的流感病毒对动物的致病性和传播性会出现显著改变。在这篇综述中,我们对影响SIV致病性和传播性的关键氨基酸位点的突变进行了归纳和分析,为进一步研究SIV的致病机制等方面奠定了基础。

拟南芥根毛功能基因AtGDPD-Like3关键氨基酸位点鉴定

AtGDPD-Like3是编码甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD)类似基因,拟南芥该家族基因AtGDPD-Like3突变体shv3存在严重的根毛发育缺陷。为了鉴定AtGDPD-Like3关键氨基酸位点,我们构建S 538 A、V 556 A和D 628 A单点突变AtGDPD-Like3,分别转化atgdpdl3突变体并观察其恢复根毛缺陷程度。结果显示V 556 A、D 628 A位点突变AtGDPD-Like3完全恢复atgdpdl3根毛生长缺陷表型,但S 538 A突变AtGDPD-Like3只是部分恢复根毛缺陷。这些结果表明Ser 538是AtGDPD-Like3较为关键的氨基酸位点,突变影响其蛋白质功能行使,同时暗示AtGDPD-Like3还存在其它的关键氨基酸位点。此研究结果为进一步探究AtGDPD-Like3蛋白功能行使的作用机制奠定了基础。

猪链球菌9型噬菌体裂解酶Ply5218最小功能域及关键氨基酸位点的鉴定

为了鉴定猪链球菌9型噬菌体裂解酶Ply5218的最小活性功能域及关键氨基酸位点,利用PCR技术对全长裂解酶Ply5218进行截短并对可能与活性相关的关键氨基酸位点进行定点突变,研究截短与突变后各个蛋白的活性并与全长蛋白活性对比。结果显示,截短片段Ply5218_(1-147)可在平板上形成裂菌圈,仍保持裂菌活性,而比该片段更短的截短片段则失去裂菌活性,推测Ply5218_(1-147)为Ply5218的最小活性相关功能域;第8、58、136和142位点的氨基酸突变后,裂菌活性部分降低,第34和144位点的氨基酸突变后,则彻底失去裂菌活性。研究结果为深入揭示Ply5218的裂菌机制和进一步改造裂解酶提供了基础数据。

GH46家族壳聚糖酶酸碱耐受性的关键氨基酸位点的鉴定

壳寡糖具有多种生物活性,是目前仅知的唯一碱性寡糖,在食品、农业和生物医药领域应用广泛。壳聚糖酶可以特异性切割壳聚糖中的β-1,4糖苷键,形成不同聚合度的壳寡糖,因此,获得具有良好稳定性的壳聚糖酶是大规模酶法制备壳寡糖的关键。为了鉴定影响糖苷水解酶(Glycoside hydrolase,GH)46家族壳聚糖酶酸碱耐受性的相关氨基酸位点,选取来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)DAU101(最适pH为7.5)的壳聚糖酶为模板,以来自芽孢杆菌的壳聚糖酶Csn-BAC为研究对象,综合同源建模和序列比对的方法,选取了4个候选位点并构建了4个突变体(V1:P68A;V2:A137G;V3:A203M;V4:H234E)。结果显示,与Csn-BAC相比,4个突变体的热稳定性均出现了不同程度的下降,而酸碱耐受性有了明显的提升。结果表明,选取的氨基酸位点对酸碱耐受性均产生了显著的影响,同时表明该策略在改造壳聚糖酶稳定性方面是一种有效的方法。

猪链球菌2型噬菌体裂解酶催化域A5的关键氨基酸位点的鉴定

为了鉴定猪链球菌2型(Streptococcus suis 2)噬菌体裂解酶(Ly ACCG/Ly ACC)催化域A5的关键氨基酸位点,本研究利用NCBI、Pfam和Uniport数据库,对催化域A5的氨基酸序列中的各位点的保守性进行了比对分析;以噬菌体SMP基因组为模板,PCR扩增lyacc基因,测序分析后构建原核表达质粒p SJ2-lyacc;以质粒p SJ2-lyacc为模板,通过PCR扩增的方法将催化域A5中3个高度保守的氨基酸位点(30位的天冬氨酸/D30、53位的苏氨酸/T53和95位的甘氨酸/G95)的密码子分别定点突变为丙氨酸(A)的密码子,经测序确证后将突变体质粒p SJ2-lyacc/D30A、p SJ2-lyacc/T53A和p SJ2-lyacc/G95A分别转化BL21(DE3)感受态细胞,同时将质粒p SJ2-lyacc作为对照平行转化,用IPTG于27℃诱导表达,菌体重悬后超声裂解,上清液过滤,获得的蛋白粗提液经SDS-PAGE分析,表明重组裂解酶Ly ACC及其突变体D30A、T53A和G95A的分子质量均约为30 ku;将重组裂解酶Ly ACC及其突变体D30A、T53A和G95A的蛋白粗提液用于平板裂解试验,结果显示,原核表达的重组Ly ACC的裂菌圈直径为2.2 cm;突变体G95A的裂菌圈直径仅为1.4 cm,裂菌活性部分降低;突变体D30A和T53A的裂菌圈消失,彻底失去裂菌活性。上述结果表明,D30和T53是Ly ACC的关键氨基酸位点。

大肠杆菌噬菌体P88尾丝蛋白受体识别关键氨基酸位点的确定

温和噬菌体P88由溶原性大肠杆菌K88诱导得来,前期研究结果表明其尾丝蛋白的716-746位氨基酸为其受体识别的关键区域。本研究旨在确定该关键区域内的关键氨基酸位点。采用大肠杆菌无痕缺失的方法以溶源大肠杆菌K88的基因组为操作对象,将P88尾丝蛋白中的第716、719、721、722、725、730、734、736、744和746位的氨基酸分别定点突变为丙氨酸,丝裂霉素C诱导定点突变溶原菌K88,之后用P88的宿主菌DE048筛选和纯化定点突变噬菌体,并测定定点突变噬菌体宿主谱。在构建的10株大肠杆菌K88定点突变株中,有5株可以诱导出与亲本噬菌体P88具有相同宿主谱的噬菌体突变株,然而尾丝蛋白第719、721、730、734和736位氨基酸定点突变的K88突变株无法用DE048筛选出突变噬菌体粒子,因此推测噬菌体尾丝蛋白第719、721、730、734和736位氨基酸为其受体识别的关键氨基酸位点。本研究为温和噬菌体基因和宿主谱的改造提供了理论基础。

α2肾上腺素受体与配体作用关键受体氨基酸位点研究进展

α2肾上腺素受体(α2-AR)是AR家族的一员,分为α2A-AR,α2B-AR和α2C-AR 3种亚型,其内源性配体为去甲肾上腺素和肾上腺素。α2-AR可介导镇痛、麻醉、降血压等作用,但目前市面上尚无针对该受体的亚型特异性激动剂,随着对α2-AR功能的深入研究,配体与受体相互作用的关键受体氨基酸位点成为研究热点,而这些保守性和非保守性关键氨基酸位点对于α2-AR亚型高选择性药物的研发具有重要指导意义。本文就目前已报道的α2-AR与配体作用的关键受体氨基酸位点及其对药物研究的影响作一综述。

欧亚类禽H1N1猪流感病毒研究进展

猪作为“流感病毒的混合容器”可以感染不同亚型的流感病毒,其中H1N1亚型在猪群中最为流行。可分为欧亚类禽H1N1猪流感病毒(Eurasian avian-like H1N1,EA H1N1)、经典猪流感病毒(Classical swine H1N1,CS H1N1)和2009年大流行H1N1病毒(2009 Pandemic H1N1,2009/H1N1)等。EA H1N1猪流感病毒自出现后便开始在欧洲和亚洲地区的猪群中快速传播,逐渐取代了当时流行的CS H1N1猪流感病毒。部分地区存在不同亚型的猪流感病毒或不同基因型的EA H1N1猪流感病毒共同传播的现象,特别是当2009/H1N1猪流感病毒出现后,为其重组提供了更多可选择的基因片段,增加了其发生重组的概率,其中G4基因型的EA H1N1猪流感病毒在哺乳动物中可表达出更强的适应性,成为优势基因型。通过氨基酸位点的突变,EA H1N1猪流感病毒实现了自身的进化,如病毒复制效率提高、毒力增强、突破物种屏障传播或耐药性的产生等,使现阶段针对其防治的手段受到牵制,多种因素共同奠定了其在传播中的主要地位,具有造成下一次流感大流行的潜力。阐明了EA H1N1猪流感病毒能够在传播过程中占据主导地位的原因,指出现阶段防治手段的局限性,并指出在以后的研究中应重点关注其在不断突破物种屏障传播时,通过基因片段的重组和关键氨基酸位点的突变而获得的适应性优势,以期为EA H1N1猪流感病毒的进一步研究提供相应的依据。