厚垣镰孢霉固体发酵产葡聚糖内切酶的条件优化

【目的】优化厚垣镰孢霉固体发酵产葡聚糖内切酶的条件,为纤维素酶应用奠定基础。【方法】以厚垣镰孢霉HML278为研究对象,采用固体发酵方法分析其产葡聚糖内切酶的条件即发酵时间、发酵温度、接种量和培养基料液比对葡聚糖内切酶酶活力的影响,通过正交试验筛选厚垣镰孢霉固态产酶的最优发酵条件。【结果】葡萄糖浓度线性回归方程:y=0.0465x+0.0177,R 2=0.999。单因素试验中,料液比为1︰2时酶活最高,为2.86 U/mL;孢子接种量为孢子悬液1.5 mL/100g物料时酶活最高,为3.29 U/mL;发酵温度为40℃时酶活最高,为3.67 U/mL;发酵时间为4 d时酶活最高,为3.67 U/mL。正交试验显示,最优发酵条件为培养基料液比1︰2、发酵温度40℃、发酵时间5 d,葡聚糖内切酶酶活为4.15 U/mL。【结论】优化的厚垣镰孢霉固体发酵条件产葡聚糖内切酶的酶活较高,降解纤维素效果佳。

N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶的功能与机制

N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶(endo-beta-N-acetylglucosaminidase,ENGase)广泛分布于各种生物中,主要通过降解错误折叠的糖蛋白,参与细胞和生命的调控。ENGase也是糖链编辑的有效工具酶,可专一性水解游离寡糖链及糖肽或糖蛋白上核心五糖的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)之间的β-14糖苷键。其水解产物是寡糖链和一个GlcNAc,或带有一个GlcNAc的糖肽或糖蛋白。本文对ENGase的发现、分布、蛋白质结构、酶学反应及生物学功能进行阐述,为ENGase的生物学研究提供思路,为糖生物学与糖组学的应用研究奠定基础。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1在肿瘤发生发展及治疗中的作用研究进展

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(APE/Ref-1)是一种具有DNA修复和转录调控双重功能的蛋白质,其在肿瘤细胞中的高表达与肿瘤发生发展紧密相关。激素如17β-雌二醇可促进APE1/Ref-1的分泌,影响其表达。APE1/Ref-1抑制剂,如C10和E3330,已在实验中显示了抑制肿瘤细胞增殖和增强化疗药物敏感性的潜力,但APE1/Ref-1抑制剂的临床应用安全性和最佳时机需更多研究探讨。

血清脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1自身抗体、生长分化因子15水平对结直肠癌患者术后复发转移的预测价值

目的分析血清脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1自身抗体(APE1-AAbs)、生长分化因子15(GDF-15)水平及对结直肠癌患者术后复发转移的预测价值。方法选取52例结直肠癌患者为观察组,并根据预后情况分为术后复发转移组(n=15)和术后未复发转移组(n=37)。选取同期正常体检健康者52例为对照组。检测APE1-AAbs、GDF-15水平。采用Pearson相关性分析法分析APE1-AAbs、GDF-15与结直肠癌术后复发转移的相关性。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析APE1-AAbs、GDF-15对结直肠癌术后复发转移的预测价值。结果观察组的APE1-AAbs、GDF-15水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。术后复发转移组的APE1-AAbs、GDF-15水平高于术后未复发转移组,差异有统计学意义(P<0.05)。APE1-AAbs、GDF-15水平与结直肠癌术后复发转移呈正相关(P<0.05)。APE1-AAbs、GDF-15联合预测结直肠癌术后复发转移的价值高于APE1-AAbs、GDF-15单独预测,差异有统计学意义(P<0.05)。结论APE1-AAbs、GDF-15在结直肠癌患者血清中呈高表达。APE1-AAbs、GDF-15或可作为结直肠癌术后复发转移的标志物。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

减数分裂内切酶1高表达对肝细胞癌预后的影响

目的探讨减数分裂内切酶1(EME1)的高表达对肝细胞癌(HCC)预后的临床意义。方法利用癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)数据库及高通量基因表达(GEO)数据库,对HCC肿瘤与非肿瘤组织差异表达基因进行筛选并进行生存分析。回顾性收集2010年1月-2014年12月于解放军总医院第五医学中心行肝癌切除术的80例患者的病理组织样本,采用免疫组织化学法检测EME1的表达情况,进行生存分析,评估EME1对肝癌患者术后5年生存率的影响;采用基因富集分析预测EME1在HCC中的功能。结果TCGA数据库筛选出371例HCC癌组织及50例非肿瘤组织样本,分析显示EME1 mRNA在HCC癌组织中明显高表达。筛选GEO数据库中的107例样本(包括70例HCC癌组织,37例非肿瘤组织),癌组织的EME1 mRNA表达量明显高于非肿瘤组织(P<0.05)。生存分析显示EME1高表达组术后5年总体生存率明显低于低表达组(44.1%vs.53.0%,P<0.05)。免疫组化结果半定量分析显示,EME1高表达组的总体生存率明显低于低表达组(32.8%vs.45.0%,P<0.05),多因素COX分析显示,EME1高表达[风险比(HR)=2.234,95%CI 1.073~4.649,P=0.032]和中国肝癌分期(CNLC)高分期(HR=4.317,95%CI 1.799~10.359,P=0.001)是影响HCC患者术后5年生存率的独立危险因素。结论EME1在HCC组织中高表达,并与HCC患者的不良预后相关,可作为HCC治疗的潜在靶点。

沉默减数分裂内切酶1(EME1)抑制肝癌细胞增殖的机制

目的探讨减数分裂内切酶1(EME1)在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞生物学行为的影响。方法筛选TCGA数据库肝癌样本中的差异表达基因。采用免疫组化和Western Blot分析EME1在肝癌组织中的表达丰度。通过短发夹RNA(shRNA)构建慢病毒并感染BEL-7404细胞干扰EME1基因表达,分为沉默组(shEME1)和对照组(shCtrl)。通过实时荧光定量PCR法和Western Blot检测两组EME1 mRNA和蛋白表达水平,Celigo计数法及MTT活性检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期,Caspase3/7活性检测细胞凋亡。两组间比较采用成组t检验。结果TCGA结果显示EME1的mRNA表达水平在肝癌组织中是癌旁组织的18.9倍(114.5±153.0 vs 8.0±7.2,t=5.00,P<0.001);EME1的蛋白表达水平在肝癌组织中是癌旁组织的7.0倍(免疫组化检测,8.4±2.6 vs 1.2±0.4,t=7.55,P<0.001)和2.5倍(Western Blot检测,249.0%±35.5%vs 100.0%±77.8%,t=3.02,P<0.05)。慢病毒感染后,相对于对照组,沉默组EME1的mRNA表达水平下降了29.9%(29.9%±0.9%vs 100.0%±3.6%,t=32.82,P<0.001),蛋白表达水平显著下降了35.7%(35.7%±14.9%vs 100.0%±28.9%,t=3.42,P<0.05);细胞计数下降了45.1%(4053±167 vs 8988±477,t=16.91,P<0.001)、细胞活性下降至66.9%(0.518±0.046 vs 0.774±0.022,t=8.74,P<0.001)及细胞克隆形成能力下降至29.0%(75±6 vs 260±9,t=28.92,P<0.001)。与对照组比较,沉默组G1期细胞(49.9%vs 44.0%,t=8.96,P<0.001)比例增多,G2/M期(15.9%vs 17.9%,t=9.13,P<0.001)与S期(34.2%vs 38.1%,t=6.91,P<0.001)的细胞比例减少;Caspase3/7活性增强了1.5倍(145.8%±5.9%vs 100.0%±2.3%,t=12.50,P<0.001)。结论EME1在肝癌组织中高表达,沉默EME1基因可抑制肝癌细胞增殖,促进细胞凋亡。

胰蛋白酶与赖氨酸C端内切酶不同顺序酶切对蛋白质组样本制备的影响

在基于质谱的蛋白质组学研究中,深度高效的蛋白质酶解是确保蛋白质被充分酶解,提升蛋白质鉴定深度(包括鉴定蛋白质数目以及蛋白质氨基酸序列覆盖率等)的关键。胰蛋白酶(trypsin)由于其能够特异性酶解精氨酸和赖氨酸羧基端,是基于质谱技术的蛋白质组学领域应用最为广泛的蛋白酶。然而,研究发现,胰蛋白酶对于赖氨酸残基的切割存在一定的遗漏酶切效率。因此,在实际蛋白质组学样本制备中,会采用胰蛋白酶和赖氨酸C端内切酶(LysC)联合使用的方式,确保赖氨酸残基的充分酶切。我们的研究发现,常用的LysC-Trypsin串联酶切的方式,会因首先加入的LysC对后续加入的胰蛋白酶进行切割,从而影响了胰蛋白酶对蛋白质样本的酶切效果。因此,本研究进行了LysC和胰蛋白酶串联酶切顺序的调整,即首先进行胰蛋白酶酶切,再加入LysC酶进行切割。本文全面比较了Trypsin-Trypsin(T-T)、LysC-Trypsin(L-T)和Trypsin-LysC(T-L)3种不同的顺序酶切方法对蛋白质样本制备质量的影响,结果表明,Trypsin-LysC顺序酶切方法在不增加实验成本的条件下,不仅获得最低的蛋白质赖氨酸/精氨酸遗漏酶切位点数目,而且酶解后得到的肽段氨基酸序列长度适中,使得Trypsin-LysC酶切后肽段样本更有利于反相色谱吸附和分离,以及串联质谱检测,从而最终显著提升样本中蛋白质的检测深度和蛋白质氨基酸序列覆盖率。本文工作为蛋白质样本的溶液内顺序酶切提供了新的技术方案和参考依据。

玛巴洛沙韦:首个靶向于Cap-依赖性核酸内切酶的抗流感药物

玛巴洛沙韦是首个Cap-依赖性内切酶抑制剂,通过抑制流感病毒RNA聚合酶酸性蛋白亚基内切酶活性,从而抑制流感病毒的复制。玛巴洛沙韦于2022年8月通过美国食品药品监督管理局(FDA)审批,在临床上用于治疗5岁及以上、流感症状不超过48 h的急性无并发症流感患者,并于2023年3月获得中国国家药品监督管理局正式批准。临床试验表明,玛巴洛沙韦具有单剂量给药、安全性高等优势,将成为儿童流感患者的替代药物。

β-1,3-葡聚糖内切酶合成、制备及应用研究进展

β-1,3-葡聚糖内切酶是一类广泛存在于细菌、真菌和某些植物中,并能够水解β-葡聚糖产生不同分子量葡聚糖的酶。低分子量葡聚糖具有抗菌、抗氧化、免疫调节和抗肿瘤的生理活性,已在医药、食品、化工等多个领域显现良好的应用前景。目前生产低分子量葡聚糖的方法主要包括物理、化学和酶降解法。相较于物理和化学降解法,酶降解法具有催化效率高、反应条件温和、收率高及对环境友好等特点,但现阶段已开发的β-1, 3-葡聚糖内切酶的酶活性和稳定性仍无法满足工业化生产的需求。因此,开发适用于工业化生产的β-1,3-葡聚糖内切酶,已成为跨越通过降解高分子量葡聚糖制备低分子量葡聚糖技术壁垒的关键。本文系统介绍了β-1,3-葡聚糖内切酶的合成调节、特点、用于低分子量葡聚糖的制备以及工艺的优化等方面的研究进展,为促进β-1,3-葡聚糖内切酶的研究和工业化应用提供参考。

限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位稀有突变

目的研究限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位密码子稀有突变的可行性。方法将采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测方法作为实验组,限制性内切酶酶切联合蓝白斑筛选检测方法作为对照组。对照组将KRAS基因第12位密码子突变型(MUT)/野生型(WT)(MUT/WT 12)质粒按0∶1、1∶300、1∶1000、1∶3000的比例混合,限制性内切酶酶切PCR产物,酶切后产物进行蓝白斑筛选。实验组将MUT/WT 12质粒按0∶1、1∶3000、1∶10000、1∶30000的比例混合,在对照组方法的基础上酶切产物去磷酸化后再蓝白斑筛选。比较两组蓝白斑克隆数。限制性内切酶酶切鉴定实验组MUT/WT 12为1∶30000的阳性克隆,一代测序阳性克隆验证插入片段的序列。采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选验证26例肺癌病例游离DNA的KRAS基因第12位稀有突变。结果对照组1∶3000的培养皿上白色克隆17个,蓝色克隆2329个,白色/蓝色克隆为1/137;而实验组1∶30000的培养皿上白色克隆23个,蓝色克隆394个,白色/蓝色克隆为1/17,1∶30000实验组白色/蓝色克隆比例明显高于1∶3000对照组。实验组1∶30000培养血上5个阳性克隆酶切鉴定出3个阳性,其插入片段为KRAS第12位突变片段。限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选26例肺癌病例可检测出2例为KRAS基因第12位密码子突变。结论采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选可检测出1∶30000 KRAS基因稀有突变。

限制性内切酶介导的整合技术

限制性内切酶介导的整合技术是近年发展起来的一种研究基因的新方法,与质粒拯救相结合,可快速分离质粒两侧的DNA序列,进而对该序列做进一步分析和研究.该技术已应用于基因突变、基因标记、寻找新基因等研究领域.本文重点介绍了限制性内切酶介导的整合技术的原理、影响因素及应用现状.

Ⅱ型限制性内切酶EcoR Ⅰ中非特异性核酸内切酶杂质测试技术研究

非特异性核酸内切酶杂质是影响II型限制性内切酶质量的重要因素,该文以EcoR I为例对II型限制性内切酶中非特异性核酸内切酶杂质进行了测试方法研究,以ΦX174 RF I型DNA作为底物,结果显示90U EcoR I中未检出非特异性核酸内切酶杂质,并对测试方法进行了方法学考察,显示该方法的重复性、稳定性佳,90U EcoR I可检测到0.1 U的Pst I。

绿色木霉AS3.3711的葡聚糖内切酶Ⅲ基因的克隆与表达

为研究构建可降解纤维类固体废弃物的工程菌 ,采用RT PCR方法克隆到绿色木霉 (Trichodermaviride)AS3 371 1的葡聚糖内切酶Ⅲ (EGⅢ )的cDNA基因 ,测序后构建到酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)诱导型表达载体pYES2上 ,用正交实验对超声波辅助酵母转化系统进行了优化 .转化获得的EGⅢ转化子用 2 %的 β D 半乳糖诱导 ,用Northern杂交、刚果红染色法和CMC糖化力法分别对目的基因的转录和表达产物的葡聚糖内切酶活性进行检测 .结果表明 ,EGⅢ的cDNA基因开放阅读框长度为 1 2 5 4bp ,编码 4 1 8个氨基酸 ,推测蛋白质分子量为 4 4 1× 1 0 3 .正交实验中较优组合为第 5组 (超声波处理 6 0s,温育 4 0min ,单链DNA 1 5 0 μg ,热激 5min) ;刚果红染色显示 ,转化子可产生明显的水解圈 ;CMC酶活检测显示该基因能在酿酒酵母中表达有生物活性的EGⅢ并分泌到胞外 ,发酵液中的酶活在培养 6 0h达到最高 0 0 4 1U/mL ;最适酶解温度为 5 0℃ ;最适 pH值为 5 8.

鲢鳙线粒体DNA的九种限制性内切酶酶场图谱的比较

以十一种限制性内切酶对鲢鱼ｍｔＤＮＡ进行单酶完全酶解的切点数：ＳａｌＩ和ＢｇｌⅡ为０；ＰｓｔＩ．ＸｈｏＩ．ＫｐｎＩ和ＳａｃＩ为１；ＨｐａＩ和ＸｂａＩ为２；ＢａｍＨＩ为３；ＢｇｌＩ和ＥｃｏＲＩ为４。以九种限制性内切酶对鳙鱼ｍｔＤＮＡ进行单酶完全酶解，其切点数；ＰｓｔＩ．ＸｈｏＩ．ＳａｌＩ．ＫｐｎＩ．ＢｇｌⅡ均为１；ＨＰａＩ和ＸｂａＩ为２；ＳａｃＩ为３；ＢｇｌＩ为４。采用琼脂糖凝胶电泳法测得鲢鱼ｍｔＤＮＡ分子量为１５９３０±２２０碱基对（ｂｐ）；鳙鱼ｍｔＤＮＡ分子量为１６６５０±１５０碱基对（ｂｐ）。用单、双酶解法和部份酶解法构建了鲢鱼九种酶１８个切点和鳙鱼九种酶１６个切点的限制性内切酶酶切图谱。另外，对这两种鱼的酶解位点数，片段大小和限制酶图谱进行了比较。

人参RAPD产物的限制性内切酶消化

为了鉴定随机扩增产物的同源性以及更有效地利用DNA分子标记研究人参种质资源，我们首次将毛细管PCR扩增的RAPD反应产物进行限制性内切酶消化并有效的进行了酶切位点分析，结果证明PCR-RFLP是筛选人参特异DNA分子标记的一种简单易行的新方法，可为药用植物种质资源研究提供另一有用的工具。

高温纤维素降解菌的筛选及内切酶基因的克隆表达

以滤纸条作为唯一碳源从以牛粪和砻糠为原料的堆肥样品中分离到了8株具有纤维素降解特性的微生物,其中菌株T1和T2在刚果红培养基上培养48 h后的水解圈明显大于其他菌株。对菌株T1和T2进行了生理生化和16S rRNA序列分析,克隆了菌株T2的内切酶基因并对该基因进行了结构域分析,同时构建了表达载体p28-egB并将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。研究结果表明:(1)菌株T1和T2可分别鉴定为Bacillus cereus和Bacillus subtilis;(2)菌株T2的内切酶基因片段大小为1500 bp,编码499个氨基酸,结构域分析显示该酶由两个不连续的结构域组成,其一为N端催化结构域,由糖基水解酶家族5组成,其二为C端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成;(3)在E.coli BL21中成功表达了菌株T2的内切酶基因,SDS-PAGE电泳图谱显示该蛋白大小约为50 KD,浓度约为93.14 mg·L-1。

伪狂犬病毒DNA限制性内切酶分析

应用５种限制性核酸内切酶（ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ，ＳａｌＩ、ＢｇｌⅡ和ＨｉｎｄⅢ）建立了伪狂犬病毒闽Ａ株ＤＮＡ的内切酶图谱，并与Ｂｕｋ株、Ｓｈｏｐｅ株、Ｎｏｒｄｅｎ株、Ｓ株，台湾ＮＴＵ株进行比较，认为闽Ａ株与美国或欧洲毒株无关，而与台湾株同源，表明核酸限制性内切酶分析在伪狂犬病病毒研究中是一种毒株鉴别、分子流行病学调查的有用工具。

用16S rRNA基因的内切酶图谱快速鉴别几种对虾病原菌

坎普氏弧菌是青岛海洋大学生物系微生物实验室于1989－1990年自对虾养殖场中国对虾红腿病虾心脏及血淋巴中分离并鉴定的菌株，副溶血弧菌和溶藻胶弧菌两菌株于1994年9月得自中国科学院微生物研究所。为建立快速、准确的中国对虾病原菌的诊断技术，根据几种细菌的16SrRNA基因的序列，设计并合成该基因的多聚酶链反应的引物PLI和PL2。用该对引物分别从坎普氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻胶弧菌的DNA样品中扩增出分子量与原设计相同的DNA片段，然后用AluI内切酶对3种细菌的多聚酶链反应产物进行酶切，形成3种不同的限制性内切酶图谱。研究结果证明，用16SrRNA基因的限制性内切酶图谱，可快速、准确地鉴别3种对虾病原菌。

大黄素对大鼠肝癌细胞凋亡诱导因子及核酸内切酶G mRNA表达的影响

目的研究大黄素(emodin,EM)对大鼠肝癌细胞CBRH-7919细胞凋亡及凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)和核酸内切酶G(endonuclease G,EndoG)mRNA表达的影响,探讨大黄素的抗癌机制。方法实验分空白对照组、Caspase抑制剂Z-VAD-FMK干预组、大黄素组、大黄素+Z-VAD-FMK组共4组,采用四氮唑盐(MTT)还原法筛选大黄素的干预条件,根据结果选择44.8μmol/L的大黄素干预48h作为干预条件;以原位末端标记法(Tunel)检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,QT-PCR)法检测AIF、EndoGmRNA。结果大黄素能抑制肝癌CBRH-7919细胞株的增殖,诱导其凋亡,与空白组相比差异具有显著性(P<0.01);QT-PCR检测显示,大黄素及大黄素+Z-VAD-FMK组细胞AIF、EndoG mRNA表达上调,与空白组比较,差异具有显著性(P<0.01)。结论大黄素可上调CBRH-7919细胞AIF、EndoG表达,通过启动非Caspase依赖通路而发挥促凋亡的作用。