内吞作用相关基因FCHO2在乳腺癌中的表达及功能分析

目的:探讨内吞作用相关基因FCHO2在各亚型乳腺癌中的表达及其与乳腺癌患者的预后和免疫细胞浸润的相关性。方法:应用免疫组化法和bc-GenExMinerv5.0数据库数据分析FCHO2在各亚型乳腺癌组织中的表达,通过GEO和TIMER数据库数据分析FCHO2与各亚型乳腺癌患者预后和免疫细胞浸润的关系,利用STRING和GEPIA数据库数据分析与FCHO2的互作蛋白网络和其与互作蛋白的相关性,通过UALCAN和DAVID数据库数据对乳腺癌组织中FCHO2表达相关基因进行KEGG和GO分析。结果:免疫组化法结果显示,FCHO2在管腔型和HER2+乳腺癌组织中均呈高表达(均P<0.05),且与HER2和Ki67表达有关联(P=0.03和P=0.007)。FCHO2高表达的管腔型乳腺癌患者总生存期(OS)和无复发生存期(RFS)均明显缩短(均P<0.05)。FCHO2蛋白与EPS15等多种蛋白表达相关且构成蛋白-蛋白互作网络。KEGG和GO分析显示,乳腺癌组织中FCHO2相关表达基因主要与昼夜节律、自噬等生物学过程有关,涉及叉头框蛋白O(FoxO)和TGF-β等信号通路。FCHO2表达与各亚型乳腺癌组织中的免疫细胞浸润相关(均P<0.05)。结论:FCHO2在管腔型、HER2+乳腺癌组织中呈高表达,且与管腔型乳腺癌患者预后及免疫细胞浸润相关,其可能成为乳腺癌治疗的潜在靶点。

植物内吞体分选转运复合物(ESCRT)调控逆境胁迫响应的研究进展

逆境胁迫是导致全球农作物产量下降的主要原因之一。当植物受到胁迫时,细胞内蛋白质运输途径需要迅速调整,以确保与应激反应相关的货物分子能通过内膜系统被正确递送到效应位点。真核生物的内膜系统由多种细胞器构成,这些细胞器在有序调控下被准确而高效地生成,参与细胞内物质运输。内吞体分选转运复合物(ESCRT)参与调控液泡前体/多囊泡体的生物学发生过程,并促使了泛素化蛋白从内吞体到液泡的运输过程。本研究重点概述了ESCRT在植物逆境胁迫响应方面的最新研究成果,包括ESCRT的基本组成和功能,以及ESCRT在植物非生物胁迫(干旱、盐胁迫)和先天免疫中的调控作用。探究ESCRT如何特异性识别并调控逆境胁迫响应蛋白,将有助于构建更为精准的ESCRT介导逆境响应的分子调控网络。图2表1参70.

发动蛋白(dynamin)抑制剂Dyngo-4a在大鼠骨髓间充质干细胞内吞葡聚糖过程中存在脱靶效应

目的研究发动蛋白(DNM)抑制剂Dyngo-4a在依赖DNM的内吞途径中可能存在的脱靶作用。方法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)并进行流式细胞术鉴定,将细胞分为抑制剂对照组、Dyngo-4a处理组、转染阴性对照(si-NC)组、DNM2小干扰RNA(si-DNM2)转染组、转染和Dyngo-4a共处理组。反转录PCR和Western blot法验证DNM2基因沉默效率,CCK-8法检测Dyngo-4a处理后细胞活性变化,共聚焦显微镜检测内吞的Dylight649标记的转铁蛋白(transferrin-Dylight649)和四甲基罗丹明标记的葡聚糖(dextran-TMR)阳性的囊泡数量以及平均荧光强度。结果使用小干扰RNA能显著下调BMSC的DNM2的mRNA和蛋白表达,转染组内吞的转铁蛋白囊泡数量与转染阴性对照组比较明显降低,si-DNM2转染组内吞的葡聚糖囊泡数量和平均荧光强度与si-NC组比较变化不明显,转染si-DNM2和Dyngo-4a共处理组与单独si-DNM2转染组比较,Dyngo-4a处理组与抑制剂对照组比较,葡聚糖囊泡数量和平均荧光强度均明显降低。结论Dyngo-4a作为靶向DNM的抑制剂在葡聚糖内吞进BMSC过程中存在脱靶效应。

肾损伤分子1介导游离轻链内吞致近端肾小管上皮细胞损伤

目的:探究近端肾小管上皮细胞中肾损伤分子1(KIM-1)介导免疫球蛋白轻链(FLCs)内吞对肾小管损伤的影响及机制。方法:(1)选取4例多发性骨髓瘤肾损伤患者尿标本,采用离子交换层析法纯化FLCs;(2)体外实验构建纯化的FLCs诱导人肾脏近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)损伤模型,继续给予FLCs刺激,并予KIM-1抑制剂TW-37干预;体内实验向小鼠腹腔注射FLCs,14 d后建立FLCs致小鼠肾小管损伤的动物模型,并予TW-37干预。Western Blot检测HK-2细胞和小鼠肾组织KIM-1、megalin、核因子E2相关因子2(Nrf2)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及转化生长因子β(TGF-β)等水平,ELISA法检测小鼠尿白蛋白/肌酐比值、尿液KIM-1的含量,天狼星红染观察小鼠肾间质纤维化程度等。结果:(1)体外实验中FLCs刺激HK-2细胞诱导KIM-1表达增加,并与FLCs存在共定位,TW-37处理后可减少HK-2细胞中FLCs内吞,减轻FLCs刺激所致的肾小管细胞溶酶体的核周聚集,降低氧化应激及纤维化指标表达。(2)动物模型结果显示,TW-37干预可缓解FLCs所致的肾小管损伤,包括尿KIM-1水平及肾组织KIM-1表达下降,肾组织氧化应激和纤维化指标表达下降,肾组织胶原沉积减轻。结论:KIM-1可介导肾近端小管细胞内吞FLCs,抑制KIM-1有助于缓解FLCs造成的肾损伤。

禾谷炭疽菌中内吞相关蛋白找寻及特征解析

植物病原丝状真菌内吞过程与菌丝细胞的生长、分化以及发育等关系密切。禾谷炭疽菌是一种半活体营养型植物病原丝状真菌,可以侵染玉米、小麦、高粱等禾本科植物而引起炭疽病,前人对其分泌蛋白在致病性过程中作用的研究较多,但对致病性过程中内吞相关蛋白的研究尚未见报道。构巢曲霉中具有DPFxD基序的蛋白发挥着受体介导的内吞信号作用,有助于实现真菌的内吞过程。基于构巢曲霉DPFxD蛋白序列,通过Blastp比对分析和关键词搜索,明确禾谷炭疽菌中存在48个DPFxD蛋白序列,并利用生物信息学分析工具对上述蛋白进行了亚细胞定位、信号肽、二级结构等特征解析,以及对DPFxD蛋白和同源蛋白开展遗传关系分析,明确其与炭疽菌属中C. incanum、C.sublineola、C. tofieldiae具有较高的同源性。研究成果为进一步探究DPFxD蛋白功能奠定理论基础,也为其他炭疽菌内吞作用蛋白研究提供重要的理论指导。

穿孔素-2是交叉呈递树突状细胞内吞逃逸的孔形成效应因子

在抗病毒和抗肿瘤T细胞介导的免疫应答启动过程中,树突状细胞(DCs)交叉呈递主要组织相容性复合体(MHC)I类分子上的外源性抗原。交叉呈递依赖于树突状细胞内吞小室不寻常的“渗漏”,由此内化的蛋白质逃逸到胞质中,用于蛋白酶体介导的MHC I-结合肽的生成。鉴于1型常规树突状细胞擅长交叉呈递,研究人员欲寻找细胞类型特异性的内吞逃逸效应因子。本研究设计了一种适合遗传筛选的检测方法,并鉴定了一种孔形成蛋白,即穿孔素-2(Mpeg1),作为交叉呈递细胞的专用效应因子。

内吞体运输必需分选复合物在肿瘤中的作用

内吞体运输必需分选复合物(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)是与膜重塑密切相关的复合物,在许多涉及膜重塑事件中起重要作用,包括病毒出芽、细胞分裂、神经元修剪、多泡体形成等。ESCRT含多种亚基,不同亚基相互配合协同完成复合物的生物学功能。ESCRT突变或表达水平改变会引起严重后果,造成多种与膜修复相关的生物学过程出现障碍,涉及帕金森病、艾滋病、肿瘤等疾病。肿瘤发生发展与许多膜重塑事件有关,随着对ESCRT的深入研究,发现其在肿瘤发生发展、治疗及预后中起重要作用。本文主要围绕ESCRT在肿瘤中的不同作用展开综述,包括作用机制、预后评估、治疗靶点的选择等,旨在为ESCRT与肿瘤之间的关系提供思路,为多种肿瘤治疗提供更多选择。

基底刚度对基于纳米颗粒的阿霉素内吞影响的研究

通过探究阿霉素内吞调控的细胞活性以及内吞作用相关联的重要蛋白表达的变化,分析基底刚度对于基于纳米载药颗粒技术的阿霉素内吞行为的影响。通过调控PDMS基料和固化剂的比例实现基底刚度的调控。实验结果表明,具有适当刚度(杨氏模量为0.578 MPa, 0.815 MPa和1.986 MPa)基底上的细胞活性差,说明阿霉素的输运在该段基底刚度范围内效率较高。为了探究阿霉素内吞作用受基底刚度调控的内在机理,探索了与内吞过程紧密相关的αVβ5和NUMB的表达情况。从免疫荧光蛋白和Western blot实验结果来看,杨氏模量为1.986 MPa的基底上负责锚定网格蛋白的αVβ5蛋白荧光强度最高;在适当刚度范围内,NUMB蛋白荧光强度显著提高,表明受基底刚度调控的NUMB和αVβ5表达的提高介导了阿霉素的输运,从而影响细胞活性。此研究为进一步提高化疗药物治疗肿瘤的效果提供参考。

抑制Rho/ROCK通路促进酒精干预星形胶质细胞内吞功能及相关基因Vps37c表达

目的分析酒精及Rho/ROCK路抑制对星形胶质细胞转录组的影响。方法本研究以CTX TNA2大鼠星形胶质细胞为研究对象,选用酒精及Rho/ROCK通路抑制剂法舒地尔进行干预,实验分为对照组、酒精组及法舒地尔组;各组样本干预后Trizol法提取样本总RNA,基于HiSeq平台进行Illumina转录组测序;利用KEGG数据库进行注释及富集分析;qRT-PCR对关键差异基因进行验证。结果酒精组与对照组相比较,获得差异基因14个,KEGG富集分析结果显示,氨基糖和核苷酸糖代谢通路及细胞内吞通路富集程度最高;法舒地尔组与酒精组相比较,获得差异基因149个,KEGG富集分析结果显示,细胞内吞通路排第6位;对照组与酒精组差异基因和酒精组与法舒地尔组差异基因进行差异分析,共获得共有差异基因5个,KEGG富集分析结果显示,细胞内吞通路通路富集程度最高;该通路涉及基因为Vps37c,对该基因进行qRT-PCR验证,结果显示,与对照组相比较,酒精干预后星形胶质细胞Vps37c mRNA表达降低;与酒精组相比较,法舒地尔干预后Vps37c mRNA表达升高。此结果与测序结果一致。结论酒精干预能够抑制星形胶质细胞内吞功能,抑制细胞内吞功能基因Vps37c表达;Rho/ROCK通路抑制能够促进星形胶质细胞内吞功能,促进细胞内吞功能基因Vps37c表达。

内吞适配蛋白Epsin3在乳腺癌中的表达及预后分析

目的 基于癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库,分析内吞适配蛋白Epsin3(EPN3)在乳腺癌中的表达及临床意义。方法 应用TCGA数据库门户网站UALCAN、c Bio Portal、Oncomine等分析EPN3在乳腺癌中的表达变化及预后关系;应用癌症多组学分析数据平台Linked Omics分析在乳腺癌中EPN3的表达变化与临床指标的关系。结果 乳腺导管癌中EPN3基因表达较正常乳腺组织显著上调(P<0.01)且EPN3高表达不利于患者预后;乳腺癌中EPN3的表达受组织学类型、病理阶段、病理T阶段、病理N阶段、原癌基因人类表皮生长因子受体、雌激素受体、孕激素受体、PM50类型、患者种族、肿瘤纯度、年龄和淋巴结数量的影响(P<0.05)。结论 EPN3高表达不利于乳腺癌预后,可作为筛选和治疗乳腺癌的相关靶点。

刀豆素A诱导巨噬细胞受体介导内吞及溶酶体过程

本文采用电子显微镜对胶体金标记刀豆素Ａ（ＣｏｎＡ－Ａｕ）与小鼠腹腔巨噬细胞表面ＣｏｎＡ受体的结合、内吞及其在巨噬细胞中转运的形态学变化；同时采用共聚焦显微镜对巨噬细胞内Ｃａ２＋和ｐＨ的动态变化进行了观察。电镜观察表明：ＣｏｎＡ的内吞属于受体介导内吞，低温对其有抑制作用。内吞体是受体与配体的分离场所，配体被溶酶体降解，而受体则返回细胞膜表面形成再循环。共聚焦显微镜观察表明：细胞内Ｃａ２＋瞬时增高，溶酶体内ｐＨ值下降且有周期性波动，间隔为１０—１５ｍｉｎ。

RNA干扰endophilin A2抑制大鼠海马神经元突触囊泡内吞

目的:探讨内吞蛋白(endophilin)A2对大鼠海马神经元突触囊泡内吞的影响。方法:设计干扰endophilin A2的小分子干扰片段,通过Western blot的方法筛选出针对endophilin A2有效的特异性干扰片段;用免疫荧光的方法验证干扰片段对神经元内源性endophilin A2的干扰效果;利用双全细胞膜片钳的方法,记录不同刺激方案下的兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents,EPSCs)的情况,以明确endophilin A2对突触囊泡循环的影响。结果:(1)免疫荧光结果显示endophilin A2的干扰片段能显著减少海马神经元内源性endophilin A2的表达(P<0.05);(2)双全细胞膜片钳结果显示,0.1 Hz的低频刺激下,干扰endophilin A2表达的神经元EPSCs大小与阴性对照组没有明显差异;而无论是单串高频刺激下还是多串高频刺激下,干扰endophilin A2表达的神经元标准化EPSCs的下降程度都明显增强(P<0.05)。结论:(1)成功筛选出特异性干扰endophilin A2的有效干扰片段;(2)干扰endophilin A2的表达不影响海马神经元突触囊泡胞吐;(3)干扰endophilin A2的表达可抑制大鼠海马神经元突触囊泡内吞。

突触囊泡内吞的分子机制

突触传递是神经系统实现其功能的最基本的方式。神经细胞进行着快速的突触囊泡信息传递而没有耗尽突触囊泡,这主要依赖于突触囊泡在神经末梢进行着精确而快速的内吞作用。本文将主要介绍四种突触囊泡的回收分子机制,网格蛋白介导的经典途径、Kiss-and-run、Bulk endocytosis以及2013年12月在Nature上报道的超速内吞机制。

细胞内吞循环运输通路及其分子调控机制

内吞运输对于细胞与外界的物质信息交流至关重要,其过程涉及对胞外大分子、膜磷脂、膜蛋白内吞及分选的精细调控。在内吞运输系统中,循环运输通路负责将膜蛋白和磷脂等送回质膜,维持质膜组成的稳定,保障多种细胞生物学过程的正常进行,如营养吸收、细胞极性形成、细胞迁移、细胞分裂、突触可塑性、免疫应答、生长因子受体调控等。真核细胞中存在两大类循环运输通路,分别是网格蛋白依赖内吞货物蛋白的循环运输(CDE货物循环)和非网格蛋白依赖内吞货物蛋白的循环运输(CIE货物循环)。在体内具有重要生理功能的转铁蛋白受体TfR和低密度脂蛋白受体LDLR是CDE循环的代表性货物膜蛋白。近年,受CIE货物循环调控的重功能膜蛋白被逐步发现,如IL2受体α-亚基、主要组织相容性复合体MHCClassⅠ、葡萄糖转运因子GLUT4等。因而,对CIE货物循环调控机制的研究越来越受到学界关注,相关研究既有重要的细胞生物学理论意义,也能为诸如Ⅱ型糖尿病和癌症等重大疾病的诊疗策略提供科学依据和潜在治疗线索。相较于CDE货物循环,学界对CIE货物循环的研究开展较晚,对其调控机制的了解也较少。为此,本文在介绍内吞循环运输通路类型及其特点的基础上,着重关注CIE循环运输调控的分子基础,对CIE货物循环研究领域的新进展、新研究体系进行了归纳和说明。

p38 MAPK信号通路参与受体介导的细胞内吞的调控

目的:观察p38MAPK信号转导通路在受体介导的细胞内吞中的作用。方法:利用Alexa594标记的转铁蛋白作为受体介导的内吞作用的观察指标,来研究p38特异性抑制剂SB203580或ERK通路特异性抑制剂PD98059预处理以及p38基因敲除对该过程的影响。结果:在受体介导的细胞内吞中,p38被磷酸化激活。SB203580的预处理或p38基因的敲除都能阻断受体介导的细胞内吞,而PD98059的预处理对该过程没有影响。结论:p38MAPK信号转导通路参与了受体介导的细胞内吞的调控。

鸡恒定链协助抗原肽结合MHCⅡ类分子并进入细胞内吞体

为探明鸡恒定链(invariant chain,Ii)的胞质区/跨膜区[Ii(Cyt/Tra)]作为载体是否可携带抗原肽在细胞内结合MHCⅡ类分子和进入转运途径的细胞器(内吞体),构建4个基因目的片段[Ii、Ii(Cyt/Tra)、F2(新城疫病毒F蛋白片段)和Ii(Cyt/Tra)/F2],分别将它们插入原核表达载体pET-32a和真核表达载体pmCherry-C1/N1中,构建8个重组质粒,再转入工程菌(E.coli)和人肾细胞系(293T),并应用拉下法(pull-down)检测目的蛋白与MHCⅡβ的结合,应用激光共聚焦确定它们在真核细胞与MHCⅡβ的共定位以及在内吞体的定位。结果表明,构建的重组质粒均能相应地原核或真核表达相应目的蛋白;Ii、Ii(Cyt/Tra)和Ii(Cyt/Tra)/F2不仅能够与MHCⅡβ结合,还能进入细胞内吞体;但是F2既不能与MHCⅡβ结合,也不能进入内吞体。Ii活性片段Cyt/Tra不仅本身具有结合MHCⅡβ的作用,而且还可以携带抗原肽与之结合并一起转入细胞内吞体而进入抗原递呈途径。该结果为进一步研究Ii载体转运抗原提供了理论依据。

下调EMS1/cortactin对人高转移潜能肝癌细胞株迁移和内吞的影响

目的观察下调人高转移潜能肝癌细胞株(MHCC-97H)中EMS1/cortactin对细胞迁移和内吞的影响,探讨EMS1/cortac-tin在细胞内可能存在的功能。方法构建靶向EMS1的shRNA真核表达质粒(EMS1-PSilencer4.1-GFP-shRNA,EMS1-shR-NA);通过Lipofectamine 2000处理后将EMS1-shRNA转染MHCC-97H细胞,免疫荧光显微镜下观察转染效率;采用RT-qPCR和Westen blot分别检测EMS1 mRNA和cortactin蛋白表达水平;利用划痕、Transwell小室实验、转铁蛋白(transferrin,Tfn)内吞实验分别研究细胞迁移和内吞作用。结果成功构建EMS1-shRNA。免疫荧光显微镜下见转染细胞中明显的绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP),荧光强度在48 h达到峰值,其转染效率达84.76%。与未处理组相比,转染EMS1-shRNA细胞中EMS1 mRNA水平下降至19.00%,cortactin蛋白水平下降至36.74%、细胞相对迁移距离下降至55.52%、相对穿膜细胞数下降至27.79%、细胞内吞荧光标记Tfn水平显著减弱(P均<0.05)。结论下调EMS1/cortactin后,MHCC-97H细胞迁移、内吞能力明显下降,提示EMS1/cortactin与原发性肝癌(primary human heptatocellular,HCC)转移的生物学行为有关。

Dynamin-Ⅰ的功能结构域及其在突触囊泡内吞过程中的作用

在神经系统中,突触是神经元间信息传递的桥梁。突触囊泡通过胞吐和内吞作用完成一次突触囊泡循环。Dynamin-Ⅰ(又称发动蛋白-1),为三磷酸鸟苷酶(GTPase)家族的一员,由四个功能结构域组成,分别为N末端GTPase域、普列克底物蛋白同源域、GTPase效应结构域和C末端脯氨酸和精氨酸富集域。目前大量研究证明,dyanmin-Ⅰ的四个功能结构域各自具有特定的功能、接受不同的调控机制,在突触囊泡胞吞过程中发挥重要作用。因此深入研究dyanmin-Ⅰ的四个功能结构域以及其在突触囊泡内吞过程中的生理调控的方式和位点,具有重要的理论和实践意义。

网格蛋白介导的内吞作用机制

受体介导的内吞作用是目前公认的生物体摄取生物大分子的途径,而网格蛋白介导的内吞又是最主要的受体介导方式.结合国内外最新报道,介绍了网格蛋白和衔接蛋白的结构、分子特性和功能;从衔接蛋白、网格蛋白的招募;包被小凹的内陷、缢缩和包被液泡的芽殖和包被液泡的脱壳等过程,阐释了网格蛋白介导的内吞作用机制.

网格蛋白介导型内吞作用与广谱抗病毒药

病毒性疾病对人类的健康造成了巨大的威胁,虽然有很多药物用于临床治疗,但由于病毒的易变异性,对现有的抗病毒药物极易产生耐药性,而新发病毒又层出不穷,因此研发新的抗病毒药物尤其是广谱且不易产生耐药的抗病毒药物对于病毒性疾病的治疗就显得尤为重要。网格蛋白介导型内吞是许多病毒和病原体进入宿主细胞的主要途径,抑制此途径可阻断病毒进入宿主细胞,从而抑制病毒感染,由于其功能和机制与病毒自身无关,不易产生耐药,是近年来广谱抗病毒药物的潜在作用靶标。本文结合国内外最新研究报道,简要综述了病毒依赖网格蛋白介导型内吞入胞的机制,网格蛋白介导型内吞抑制剂的研究现状,及其在广谱抗病毒药物研发中的潜在应用前景。