从一道选考题解析农杆菌转化法中的“三除”

从筛除对象、用于筛除的物质、影响筛除效果的因素等方面解析了农杆菌转化法中的“三除”:筛除未转化的农杆菌、筛除共培养的农杆菌、筛除未转化的受体细胞,为教师教学和学生深度学习提供参考。

提高植物农杆菌转化效率辅助策略研究进展

农杆菌介导是目前转基因植物研究采用的主要方法,不同植物间利用农杆菌转化的转化效率差异很大,高效农杆菌转化体系对于转基因植物产业化和功能基因组学等研究具有重要意义。总体而言,影响农杆菌转化效率的因素主要包括基因型、外植体及其生理状态、农杆菌菌株、培养基成分、共培养条件等。对于一些难转化的植物来说,辅助因素对转化效率的提高起着至关重要的作用。本文综述了影响农杆菌转化效率的一些辅助因素及其作用,包括植物材料微创伤处理和干燥处理、培养基中抗氧化剂和表面活性剂使用、农杆菌中额外拷贝Vir和植物细胞中VIP(VirE2 interacting protein)过表达、载体上核基质附着序列引入等,以期为进一步改进难转化作物如小麦、大豆等农杆菌介导的遗传转化效率提供参考。

农杆菌转化后丹参植株再生

用发根农杆菌１５８３４，ＬＢＡ９４０２株和根癌农杆菌Ｃ５８株感染丹参无菌苗，完成质粒转化后诱导出毛状根和冠瘿瘤。毛状根和冠瘿组织在无激素的培养基上于光照条件下分化出转化后的丹参再生植物，再生植物移植到土壤中能够成活。用发根农杆菌转化后的再生植物的具有节间缩短，植株矮化、地下部毛状须根发达等特征。用根癌农杆菌转化后的再生植物生长旺盛，地上部分较原植物高大，根系发达，根产量和丹参酮含量都高于原植物。

茶树农杆菌转化系统和基因枪转化系统的优化

在用农杆菌浸染前,将茶树外植体预培养在含有PVP(polyvinylpyrrolidone,16g/L)的预培养基上2-3d可提高转化频率.优化后的茶树基因枪转化体系,即制弹程序:60 mg/1ml钨粉悬浮液10 μl中加入1.6 μl质粒DNA(1 μg/μl),再分别加入0.1 mol/L的亚精胺4 μl,2.5 mol/L 的CaCl2 15 μl,最后定容至48 μl;每次轰击上样量为8-10 μl.基因枪转化后抗性筛选2个月,抗性愈伤组织存活率为5.0%～12.1%.

小麦大龄幼胚再生性能改进与农杆菌转化

【目的】小麦幼胚再生率与幼胚大小关系密切,改进小麦大龄幼胚再生性能促进小麦转基因研究。【方法】以18个普通小麦基因型和5个硬粒小麦基因型为材料,对其开花授粉后15—17 d的大龄幼胚进行破碎处理、组织培养和农杆菌转化,对转化后的幼胚组织和获得的抗性再生植株分别进行组织化学染色检测和PCR检测。【结果】大龄幼胚培养2 d后破碎处理的再生率为18.2%,显著高于完整胚对照(1.7%),培养2 d后进行破碎处理的再生效果高于4和6 d后破碎处理;不同基因型小麦大龄幼胚破碎处理后再生率为16.9%—46.7%,其中,Bobwhite和中8423大龄幼胚再生率达到了40%以上;大龄幼胚破碎后在弱光条件下培养,再生率进一步提高,较对照(完整胚黑暗培养)提高5.4%—47.4%;农杆菌侵染后GUS瞬时表达率为0—76.7%,其中科农199高达76.7%,其次为Verry(64.4%)和Alondra(47.2%);经PCR检测,农杆菌转化小麦大龄破碎幼胚获得了候选转基因植株。【结论】破碎处理和弱光培养显著提高了小麦大龄幼胚再生率,比对照提高5—10倍;科农199、Verry和Alondra大龄幼胚对农杆菌侵染比较敏感,适宜作为农杆菌转化的受体材料;农杆菌转化小麦大龄幼胚可以获得转基因植株。

小麦农杆菌转化系统的建立与转基因植株的获得

针对农杆菌转化系统的诸多影响因素进行了系统研究,建立了有效的小麦农杆菌转化系统;利用石4185、石6365的花药愈伤组织为受体,进行了甜菜碱醛脱氢酶和胆碱氧化物酶等目的基因的转化研究。

农杆菌转化法将抗虫基因导入大豆获转基因植株

利用根癌农杆菌(Agrobacteriumfaciens)介导法将抗虫基因导入大豆子叶节。大豆无菌苗子叶节经过与 根癌农杆菌共培养、卡那霉素抗性筛选获得96株抗性植株,经PCR和PCR-Southern鉴定,有4株为阳性株。

借助粒子轰击提高农杆菌转化水稻的频率

为了提高农杆菌转化水稻的频率 ,对粳稻品种台北 30 9的幼穗和成熟胚的愈伤组织诱导频率和粒子轰击时其愈伤组织转化频率的影响进行了研究 .结果表明 ,水稻幼穗是诱导愈伤组织的最佳外植体 ,通过粒子轰击可以有效地提高农杆菌转化水稻愈伤组织的频率 ,其中以每个样品轰击两次的效果最好 ,其转化率比对照提高5 4.5 %

硝酸银在水稻农杆菌转化中的作用

以籼稻、粳稻两种类型的成熟种子为外植体研究了不同浓度的AgNO3在水稻农杆菌转化中的作用 .结果表明 ,在农杆菌转化前添加AgNO3可以提高愈伤组织诱导率 ,最适浓度为 8～ 10mg/L ,但对愈伤组织的分化没有明显促进作用 ;转化后添加低浓度的AgNO3可以减轻愈伤组织的褐化 ,提高抗性愈伤率和绿苗分化率 ,最适浓度为 2 - 8mg/L .同时发现 ,无论是转化前还是转化后 ,添加高浓度的AgNO3对水稻愈伤组织的分化均具有毒害作用 .

共培养的水分状态对农杆菌转化玉米的影响

农杆菌与受体的共培养条件,对农杆菌介导的遗传转化有着重要的作用,为了提高玉米芽生长点的遗传转化效率,以郑58玉米自交系的种子为试验材料,用EGFP(增强型绿色荧光蛋白)基因作为标记基因,通过控制农杆菌共培养时的水分提供方式,研究共培养时的水分条件对农杆菌转化玉米芽生长点的影响。结果表明,将转化的玉米种子放到加有2层滤纸的培养皿中,每培养皿放置10～15粒种子,加1.5 mL无菌水,放在25℃暗培养3～4 d,在不影响转化效果的基础上有利于转化后发芽,可获得较多的转化材料。

对农杆菌转化法几个疑问的解答

人教版普通高中课程标准实验教科书《现代生物科技专题》中介绍了用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。学生在学习这一内容时提出了好几个问题，现对有些问题作如下解答：

农杆菌转化植物细胞的机理及其基因工程

农杆菌T—DNA能进入植物细胞并稳定地保存在植物染色体中,成为植物细胞新增的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代。这是自然界中存在的原核生物对真核生物进行基因工程的奇妙例证。 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacient)和发根农杆菌(A.rhizogenes)的一些菌株几乎侵染所有受伤后双子叶植物的能力,它们是同属于根瘤菌科的革兰氏阴性菌。它们能分别在宿主植物的感染部位引起冠瘿瘤(Crown gall tumor)和发根瘤(Hairy root tumor),一旦诱导后,冠瘿瘤或发根瘤不需要这些细菌也能增殖。

农杆菌转化系统在蔬菜育种上的应用及常见问题的探讨

自从70年代,人们首次从分子水平上证实了农杆菌浸染植物,到1983年第一个转基因植物问世,农杆菌介导转基因工程已是日新月异,硕果累累,转化成功的植物达116种,利用农杆菌可侵染双子叶植物的特点,这种方法已被广泛地应用在蔬菜育种中。1 农杆菌转化系统的原理和方法 土壤农杆菌是一种革兰氏阴性菌。

农杆菌转化法高效构建顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株提高头孢菌素C产量

目的获得顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株,以阻断sorbicillinoids的合成,并研究其与头孢菌素C(CPC)产量的关系。方法通过根癌农杆菌转化法,依据同源双交换的原理,同时敲除合成sorbicillinoids骨架结构的两个聚酮合酶基因sorA和sorB,并通过摇瓶发酵实验检测缺失菌和野生菌的产量。结果筛选并验证了6株A.chrysogenum-Δpks菌株,遗传稳定,转化效率约为20%。通过发酵实验测定发现,缺失菌株产CPC能力比野生菌提高了70%。结论农杆菌转化法是一个高效的顶头孢霉遗传操作系统,并且顶头孢霉中sorbicillinoids的缺失可以提高CPC产量。

棉花黄萎病菌遗传转化载体构建和农杆菌转化

载体构建是建立真菌遗传转化体系的基础。本研究以pCAMBIA1305.1双元载体为基本骨架,构建棉花黄萎病菌遗传转化T-DNA质粒双元载体,通过限制性内切酶酶切、补平、连接以及去磷酸化等措施将pCAMBIA1305.1上Hygromycin抗性基因的CaMV 35S启动子替换成构巢曲霉的trpC启动子。经大肠杆菌转化后对转化子进行酶切验证,并将新构建的载体1305-3分别转入农杆菌菌株LBA4404和EHA105。为农杆菌介导的黄萎病菌遗传转化体系的建立和优化提供了存在于不同农杆菌菌株中的供试载体。

农杆菌转化花粉愈伤组织获取纯合的转基因水稻植株

应用农杆菌介导法成功地将玉米转座子 Ds导入粳稻 (Oryza sativa L.subsp.japonica)中花 11的花粉愈伤组织中 ,基因转化以对除草剂 PPT有抗性的 Bar基因和潮霉素抗性基因 H pt为选择标记 .共获得了 18个独立的转基因绿苗 ,其中单倍体 11株 ,二倍体 7株 .转基因植株均抗除草剂 BASTA.考查了二倍体植株种子后代 (T1)对 BASTA的抗性 ,7个株系的所有植株均抗 BASTA,而未发生感抗分离 ,表明外源基因在转基因植株中是纯合的 .PCR和 Southern blotting的研究支持上述结果 .

农杆菌转化法中的“Ti质粒转化载体系统”的简介——一道江苏高考题的奥秘解读和拓展

以2009年江苏高考卷34题中的农杆菌转化法与教材中农杆菌转化法的区别为起点,依次分析了农杆菌转化法中需要构建Ti质粒转化载体系统的原由和Ti质粒转化载体系统的类型,以期促进中学教师和学生对农杆菌转化法的全部了解。

解读浙江选考题中的农杆菌转化法

本文从农杆菌Ti质粒的介绍、重组质粒导入农杆菌的方法、农杆菌侵染植物细胞机理和转化法的影响因素4个角度,深入解读了近几年浙江选考题中涉及的农杆菌转化法。

农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展

在水稻遗传转化过程中,农杆菌介导转化法与其他方法相比优势较多,比如转入的外源DNA结构完整及表达比较稳定、操作简便、转化率高等,已被广泛应用于转基因技术中。本文对根癌农杆菌介导水稻遗传转化的原理、影响遗传转化的因素进行了综述,并探讨了农杆菌介导转化法的应用前景。

农杆菌敏感小麦基因型的筛选及其转化(英文)

利用C58c1农杆菌菌株(其携带的pPTN290质粒载体上含有nptⅡ基因和GUS基因)为供体材料和小麦幼胚为受体材料,对我国35个春小麦基因型进行了农杆菌敏感性研究和转化研究。组织化学染色结果表明,PM97034、P187、巴140105、扬麦158、新春9号和克丰6号等基因型农杆菌感染后GUS,基因瞬时表达率达到了15.0%～30.0%,显著高于模式基因型Bobwhite。其余幼胚分别在含10～25mg/LG418培养基上诱导愈伤组织和分化植株,抗性再生植株经ELISA检测、PCR检测、叶片离体退绿检测、XGluc染色检测和Southernblot检测,最终从新春9号、PM97034和Bobwhite获得了转基因植株,转化效率分别为3.3%、2.0%和1.1%,新春9号和PM97034的农杆菌转化效率高于Bobwhite。Southernblot检测结果同时表明,外源基因在多数转基因植株中表现为单拷贝整合。T1代植株ELISA检测结果和PCR检测结果表明,外源基因在个别株系中的分离符合孟德尔遗传规律,而在多数株系中的分离偏离了孟德尔遗传规律。阳性植株与阴性植株分离比经χ2c适合性检测,表明外源基因在多数株系中的遗传符合3∶1分离规律。本文首次对不同小麦基因型进行了农杆菌敏感性和转化效率研究,筛选到新春9号和PM97034两个对农杆菌比较敏感且转化效率比较高的基因型,可望广泛用于小麦转基因研究。